1、1发酵工程第二章 发酵工程菌种1、发酵工程菌：发酵工业的微生物种类很多，可分为两二类，即可培养微生物和未培养微生物。其中，可培养微生物包括四大类：1）细菌：单细胞原核微生物，分布最广、数量最多，工业上常用的有枯草芽孢杆菌、醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等，用于各种酶制剂、有机酸、氨基酸等； 2）放线菌：单细胞原核，因菌落呈放线状而得名，最大的经济价值在于能产生多种抗生素，常用的放线菌主要来自链霉菌属、小单孢菌属和诺卡菌属，如链霉素、红霉素、金霉素； 3）酵母菌：一类单细胞，兼性厌氧，出芽生殖真核微生物，啤酒酵母、假丝酵母、类酵母用于生产啤酒、制造面包、生产脂肪酶和可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白；
2、 4）霉菌：发霉的真菌，根霉、毛霉、红曲霉、青霉，它们广泛用于生产酶制剂等。2、发酵工程菌种的分离筛选：发酵工业对菌种的要求：1）能在廉价原料制成的培养基上生长，目的产物产量高、易回收；2）生长快，发酵周期短；3)培养条件易于控制；4）抗噬菌体和杂菌污染能力强；5）菌种不易变异退化；6）对放大设备的适应性强；7）菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。 菌种的获得途径：1）从菌种保存机构直接购买（CCCCM 中、ATCC 美） ；2）从自然届分离筛选；3）从发酵水平高的批号中重新进行分离筛选。 菌种的分离筛选过程：样品的采集（土壤、海洋、空气、极端环境微生物、动植物中，总原则是来源
3、越广泛，获得新菌种的可能性越大）-材料的预处理（热处理、膜过滤、离心法、添加几丁质分离放线菌）-富集培养（控制营养成分和条件筛选目的菌）- 菌种分离（平板划线分离法、涂布分离法）见 P18-菌种的初筛和复筛-菌种鉴定，确定菌种类型。3、菌种的代谢：1）初级代谢产物：把微生物产生的对自身生长和繁殖必需的物质称为初级代谢产物。2）次级代谢产物：由生物体合成，但对其自身的生长、繁殖和发育并没有影响的一类物质，如抗生素、生物碱、色素、毒素等。 代谢控制机制包括酶合成的调节（诱导和阻遏）和酶活性的调节。4、菌种的选育方法：自然选育（利用菌种的自然突变而进行菌种的筛选） 、诱变育种（理论基础是基因突变，诱
4、变和筛选不断重复） 、细胞工程育种、杂交育种（将两个基因型不同的菌株接合） 、原生质体融合（去除细胞壁后选 PEG 作为助融剂） 、基因工程育种、蛋白质工程育种、组合生物合成育种（利用重组工程酶对一些药物和化合物直接进行衍生化） 、反2向生物工程育种。5、以抗生素为例简述筛选菌种的方法和过程：对象确定-采集样本-富集培养（投其所好、取其所抗之原则）-初筛-复筛-较优菌株斜面-性能测定-菌种保藏6、接种龄：种子罐中培养的菌体从开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间；接种量：移入的种子悬浮液体积和接种后培养液体的体积的比例。第三章 培养基1、培养基的分类：1）按纯度分：合成培养基、天然培养基；
5、2）按状态分：固体培养基、半固体培养基、液体培养基；3）按用途分：孢子培养基、种子培养基、发酵培养基；2、选择性培养基：是指根据某种微生物的特殊营养要求或其对某种化学、物理因素的抗性而设计的培养基。其功能是使混合菌样中的劣势菌变成优势菌，从而提高改菌的筛选效率。3、培养基的成分：1）碳源：常用的碳源有糖类（葡萄糖、糖蜜、淀粉糊） 、油脂（豆油、菜油、鱼油） 、有机酸（乳酸、柠檬酸、乙酸）和烃醇（正烷烃）等。2）氮源：有机氮源（花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉） 、无机氮源（NH4Cl、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵、氨水）3）无机盐及微量元素：P、S、Mg 、Fe、K、Na
6、、Cu、Zn、Mn、Gu 等。4）水：5）生长因子（氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等） 、前体、产物促进剂和抑制剂（在次级代谢产物发酵过程中，往往抑制某一代谢途径就会使另一代谢途径活跃） 生理酸性物质：经微生物生理作用后能形成酸性物质的无机氮源。如硫酸铵；如菌体代谢后能产生碱性物质的则此种无机氮源称为生理碱性物质，如硝酸钠。 前体：能被微生物直接利用，以构成次级代谢产物结构的一部分，而其本身结构没有大的变化，这种物质称为前体，如玉米浆中的苯乙胺。4、发酵培养基的配制条件：1）都必须含有合成细胞组成所必需的原料；2）满足一般生化反应的基本条件；3）一定的 pH 条件等；4) 工业生产上选择的培养基俗
7、称发酵培养基，还应包括能够促进微生物合成产物所必需的成分。第四章 灭菌1、灭菌：用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中所有生命物质的过程。包括化学灭3菌、射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌（原理是高温下微生物细胞的蛋白变性而死亡）和过滤除菌。2、对数残留定律：湿热灭菌时，微生物死亡速率与残留菌数成正比叫对数残留定律。-dN/dt=K*N N残存的活菌数；t灭菌时间（s） ；K灭菌速度常数（1/s）与微生物种类和加热温度有关；dN/dt-活菌数瞬时变化速率，即死亡速率。 为什么高温灭菌优于其他灭菌方法？从理论研究和生产实践都证明，在灭菌过程中，同时会发生微生物死亡和培养基破坏这两个过程，微生物死亡速
8、率的提高超过培养基成分破坏速率的增加，要减少营养成分的破坏，可升高温度灭菌。因此，对于同一灭菌效果，选择较高的温度、较短的时间，这样既可达到需要的灭菌程度，同时又可减少营养物质的损失。3、分批灭菌：是将配制好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所有设备一起灭菌的操作过程。包括升温、保温、降温三个阶段。灭菌主要是在保温过程中实现，在升温阶段后期，也有一定的灭菌作用。4、连续灭菌：将配制好的培养基在通入发酵罐时进行加热、保温、降温的灭菌过程，也称之为连消。 其流程为：配料预热（预热桶作用是定容和预热，目的是使培养基在后续加热过程中能快速地升温到指定的灭菌温度）-加热（用连消泵打入加热
9、器，使培养基与蒸汽混合并迅速达到灭菌温度，加热器有塔式和喷射式两种）-保温（维持灭菌温度一段时间，是杀灭微生物的主要过程，维持罐和管式维持器）-降温（迅速降温）5、空气除菌：好氧性微生物需要空气，为保证纯种培养，需要空气灭菌。方法有：辐射杀菌（高能阴极射线、X、 射线、紫外线能破坏蛋白质活性而杀菌，紫外线用的最多）化学、蒸汽灭菌、静电除菌（利用静电引力吸附带电粒子） 、热杀菌、过滤除菌(介质过滤是采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物，常用的介质有棉花、活性炭和玻璃纤维、矿渣、金属丝纤维、合成纤维等。 棉花要选用未经脱脂的，这样压紧后仍有弹性，纤维长度要适中，填充率为 8.5%-10%
10、。 空气过滤除菌过程：前置空气过滤器进行粗滤 空气机升压 一级冷凝器对压缩空气降温 二级甚至多级冷凝器降温、除水、除油 空气加热器降低湿度 空气储罐稳压 空气过滤器除菌 无菌空气进入发酵罐 空气过滤除菌包括绝对过滤和深层过滤：1）绝对过滤是介质孔隙小于被拦截的微生物4大小，如用聚四氟乙烯或纤维素酯材料制成的微孔滤膜，孔径 0.22um。 2）深层过滤是指介质孔隙大于被拦截的微生物大小，但介质有一定的厚度，机理是静电、扩散、惯性及拦截作用。如棉花过滤器、石棉滤板、金属烧结管等。 深层过滤效率是滤层所滤去的微粒与原来微粒的比值，即穿透滤层微粒与原有微粒的比。 对数穿透定律：空气通过单位滤层后微粒下
11、降的速度与进入空气微粒的浓度成正比；进入滤层的微粒数与穿透滤层的微粒数之比的对数是滤层厚度的函数。6、空气的预处理流程：前置过滤器（可降低过滤器负荷，即多次过滤）-空压机（提供动力，以克服随后各设备的阻力，包括往复式、螺旋杆式、涡轮式）-空气贮罐 -冷却器-气液分离器（冷却后的压缩空气，会有来自空压机的润滑油，如果冷却温度低于露点，空气中还会有水，除去空气中的水和油，以保护过滤介质）-冷却器- 气液分离器丝-丝网过滤器-加热器-总过滤器-分过滤器7、空气过滤的机理：1）惯性冲击滞留机理；2）拦截滞留机理；3）布朗扩散作用机理；4）重力沉降；5）静电吸附第五章 生物反应动力及过程分析1、酶：生物
12、酶分为六大类：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、合成酶。2、代谢产物形成的动力学模型，gaden 根据产物生产速率和细胞生长速率之间的关系，将其分成三种类型：1）相关模型（伴随生长的产物形成模型）：指产物的生成与细胞的生长相关的过程，此时产物通常是基质的分解代谢产物，代谢产物的生成与细胞的生长是同步的。 （各高峰几乎同时出现，有平行总量关系，这些发酵的产物有菌体本身）2）部分相关模型（不完全伴随生长的产物形成模型）：反应产物的生成与细胞生长仅有间接关系。在细胞生长期内，基本无产物生成（菌体生长与细胞生成的两个主峰分别出现在两个期，在菌体生长期不合成或很少合成，产物生成期菌体生长率出现
13、微弱回升，有柠檬酸发酵和氨基酸发酵等）3）非相关模型（不伴随生长的产物形成模型）：产物的生成与细胞的生长无直接联系。它的特点是当细胞处于生长阶段时，并无产物积累，而当细胞停止生长后，产物却大量生成。 （菌体生长与产物合成形成不相关的两个阶段，第一期长菌，在产物合成期无菌体生长的回升现象，产品有抗生素、维生素、色素等次级代谢产物）53、Monod 方程：在培养基无抑制剂的情况下，细胞的比生长速率与限制性基质浓度之间的关系 为最大比生长速率(h-1)，S 为限制性基质浓度(gL)；Ks 为饱和常数(g/L)，其值等于比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。 其意义是衡量微生物对基质的亲和
14、力，其越小，微生物对基质的亲和力越大。会判断 几个概念：1、比生产速率 是菌体繁殖速率与培养基中菌体浓度之比=（dx/dt）/x；单位为 1/h，其中 X-菌体浓度单位为 g/L。对数期为常数； 2、基质比消耗速率 qs 是指单位时间内单位菌体消耗基质的量（ds/dt）/x；单位为 1/h，其中 S底物浓度单位为 g/L； 3、产物生产比速率 qp 是指单位时间内单位体积发酵液生产产物的量（dp/dt/dv） 。 X 为菌体浓度，u 为比生长速率；4、得率系数：表示消耗单位营养物所生产的细胞或产物数量。其包括生长得率系数和产物得率系数：1）生长得率系数 Yx/S、Yx/O2、Yx/Kcal 分
15、别表示消耗每克营养物、每摩尔氧和每千卡能量所生产的细胞数; 2）产物得率系数 Yp/S、YCO2/S、YATP/S、YCO2/O2 表示消耗每克营养物（S）或每摩尔氧（O2）生产的产物（P）或 ATP 和 CO2 的克数。5、分批发酵、补料分批发酵、连续发酵：1）分批发酵：是一种准封闭式系统，是指一次性投料、接种直到发酵结束，此过程中发酵SKsmaxmax6液始终留在发酵罐内，所有液体的流量为零。图：说明：1）延迟期：细胞浓度无明显变化；2）对数期：细胞浓度随时间呈指数生长；3）减速期：细胞的生长速率开始减慢；4）静止期：细胞浓度不再增加，为最大值；5）衰亡期：细胞开始死亡，细胞生长速率为负值
16、。2）补料分批发酵：指在分批发酵过程中补充培养基，而不从发酵体系中排出发酵液，使发酵液体积随着发酵时间逐渐增加。 3）连续发酵：指以一定的速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养液，从而使发酵罐内的液量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物培养方式。 稀释速率 D：等于培养液在罐中平均停留时间的倒数，在稳定状态下，细胞的比生长速率等于稀释速率。 D=F/V=u6、单级连续发酵：反应器中的培养基接种后，通常先进行一段时间的分批培养，待细胞浓度达到一定程度后，以恒定的流量 F 将新鲜培养基送入培养基，同时用泵将反应器中的培养液以同样的流量抽出，于是反应器中的培养液体积 V
17、 保持不变。7、多级连续培养：将多个搅拌罐反应器串联起来，前一反应器的出料作为后一反应器的进料，即成为多级连续培养系统。第六章 发酵工业中氧的供需1、呼吸强度：单位质量干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以 Qo2 表示。2、摄氧率（好氧速率）：指单位体积培养液在单位时间内的耗氧量，以 表示。3、氧的传递过程：1）供氧（空气中氧-气膜-气液界面-液膜-液体主流中）2）耗氧（液体主流-液膜-菌丝丛-细胞膜-细胞内）4、氧的传递阻力：1）供氧阻力： 氧从气相主体扩散到气液界面的阻力； 通过气液界面的阻力； 通过细胞外侧的滞流液膜，达到液相主体的阻力； 液相主体中的传递阻力 2)秏氧阻力： 通过细胞或细
18、胞团外的滞流液膜，到达细胞团与液体界面的阻力； 通过液体与细胞团之间界面的阻力； 细胞团在细胞与细胞之间的介质中的扩散阻力； 进入细胞的阻力； 细胞内反应阻力。注：供氧方面的主要阻力是气膜和液膜阻力；耗氧方面的阻力主要是细胞团与细胞膜阻力引起！7第七章 发酵工程控制1、发酵工业中溶解氧为什么很容易成为控制因素？答：溶氧是需氧微生物生长所必须的，对细胞生长和产物合成有较大影响，由于氧在水中的溶解度很低，所以在需氧微生物发酵过程中溶解氧往往最易成限制因素。溶解氧在发酵过程控制中起重要作用：溶解氧判断操作故障或事故引起的异常现象；溶解氧判断中间补料是否恰当；溶解氧判断发酵体系是否污染杂菌；溶氧作为控
19、制代谢方向的指标。2、最佳 pH 的选择：选择最适发酵 pH 的准则是获得最大比生产速率和适当的菌量，一伙的最高产量。一般 pH 调控有以下几种方法： 配制合适的培养基，调节培养基初始 pH至合适范围并使其也很好的缓冲能力； 培养过程中加入非营养基质的酸碱调节剂，如CaCO3 等防止 pH 过度下降； 培养过程中加入基质性酸碱调节剂，如氨水等； 加生理酸性或碱性盐基质，通过代谢调节 pH； 将 pH 控制与代谢调节结合起来，通过补料来控制 pH。3、温度对发酵的影响：在过程优化中应了解温度对生长和生产的影响是不同的，温度对菌的生长和生产的影响的各种因素综合表现的结果。从酶动力学看，温度升高，反
20、应速率加大，生长代谢速度加快，生产期提前，但因酶本身很容易因过热而失去活性，温度越高，酶的失活也越快，表现为菌体易于衰老，发酵周期缩短，影响产物的最终产量。温度除了直接影响过程的各种反应速率外，还通过改变发酵液的物理性质来年影响产物的合成，温度还会影响生物合成的方向，对代谢有调节作用，一般生物的活化能越高，对温度越敏感。最适温度：是指最适于菌的生长或产物的生成的温度，它是一个相对概念，是在一定发酵条件下测定的结果。不同的菌种、不同培养条件以及不同的生长阶段，最适温度会有所不同。由于最适合菌体生长的温度不一定适合发酵产物的合成，故在实际发酵过程中往往不能在整个发酵周期内仅选一个最适培养温度，而需
21、建立二阶段发酵工艺。4、泡沫对发酵的影响及控制：一般在含有复合氮源的通气发酵中会产生大量泡沫，引起“逃液” ，给发酵带来许多副作用，主要表现在：1）降低了发酵罐的装料系数；2）增加了菌群的非均一性；3）增加了污染杂菌的机会；4）大量气泡，控制不及时，会引起逃液，招致产物的流失；5）消泡剂的加入会影响发酵或给提炼工序带来麻烦。控制泡沫的方法有机械消泡和消泡剂消泡。5、高密度发酵：指培养液中工程菌的浓度在 50g 干重/L 以上，理论上最高值可达 200g 干8重/L 。6、呼吸商：指 生 物 体 在 同 一 时 间 内 ， 释 放 二 氧 化 碳 与 吸 收 氧 气 的 体 积 之 比 或 摩
22、尔 数 之比 ， 即 指 呼 吸 作 用 所 释 放 的 CO2 和 吸 收 的 O2 的 分 子 比 。第八章 发酵设备1.通风发酵罐的类型：机械搅拌发酵罐、气升式发酵罐、自吸式发酵罐、伍式发酵罐、文氏管发酵罐2、搅拌的作用：液体通风后进入的气泡在搅拌中随着液体旋转使之所走路程延长，使发酵液中保持的空气数量增加，实际上是增加了传质量；通过搅拌，大气泡被搅拌器打碎，增加比表面积,增加气液接触面积；搅拌速度越快，搅拌雷诺准数增加，增加了传氧速率。3、啤酒发酵罐由于操作失误就可能造成罐内真空甚至被吸瘪?答：因为放料速度和倒灌速度过快，洗涤剂是碱性的，与二氧化碳中和，导致真空。4、通气式搅拌发酵罐中的平直叶涡轮搅拌器为什么要安一个圆盘呢？9答：因为不安圆盘的话，气泡直接将进入发酵罐中，对发酵不利；安装了圆盘的话，可以将气泡打碎，增加气液接触面积，使全体搅拌更均匀，避免造成浪费。清洗也更方便。5、挡板的作用：改变液流的方向，由径向流改为轴向流，促使液体激烈翻动，增加溶解氧。消泡器的作用：将泡沫打碎。辐射的作用：使灌顶和罐底轴之间的缝隙加以密封，防止泄漏和污染杂菌。
