1、1第五章 细胞培养单细胞培养体系的建立为研究植物细胞的特征和潜能性提供了一个极好的机会。这种培养体系有助于揭示多细胞有机体中细胞之间的相互关系和相互影响。Haberlandt 的开创性实验没能使游离细胞实现细胞分裂，但他 1902 年发表的研究论文激发了对这一个领域的进一步研究。随后，几位研究者相继报道了促使游离单细胞分裂，甚至从单细胞培养再生完整植株的研究结果，都获得了令人瞩目的成功。植物生物技术研究者对细胞培养具有浓厚的兴趣，他们认识到，通过细胞培养生产天然产物比培养完整器官或完整植株有更多的优点。利用细胞培养研究分析细胞代谢的途径，是最初吸引植物生物学家注意的另一个研究课题。人们不久便认
2、识到，单细胞培养体系对农作物改良具有很大的应用潜力。在培养游离细胞的过程中，可以让各种化学药品和放射性物质很快地作用于细胞，又很快地停止这种作用，从而易于诱导和筛选培养细胞突变体。通过单细胞的克隆化，可以把微生物遗传学技术用于高等植物以进行农作物的改良。此外，在特定的生长周期和培养条件下，培养细胞群体中的单个细胞能稳定地表现细胞遗传和新陈代谢的变异，这种变异被称为空间异质性。这是一项非常有趣的研究，因为将在单细胞再生植株形态发生的过程中，证实细胞间染色体组型和积累次生代谢产物的能力是否存在差异。细胞系筛选技术可适用于培育高产细胞系和优良农业性状的株系。l 单细胞的分离21.1 由完整的植物器官
3、分离单细胞分离单细胞的最佳材料是叶组织，因为叶片中的细胞近似于一个同质细胞群体，很适合用于特定和调控的大规模细胞培养。用机械法或酶解法可以从这种完整植物体器官(如叶组织)分离出单细胞。1.1.1 机械法叶组织是分离单细胞的最好材料。Ball、Joshi 和 Noggle 等曾先后由花生成熟叶片得到了离体单细胞。他们所用的方法是，先撕去叶表皮，使叶肉细胞暴露，然后再用小解剖刀把细胞刮下来。这些离体细胞可直接在液体培养基(成分见 p92 表 6.2)中培养。在培养中很多游离细胞都能成活，并持续地进行分裂。以上是关于由完整的植物器官中获得的游离细胞能在人工培养基里进行分裂的最早报道。但不是所有植物叶
4、片都能通过这种方法得到单细胞。上述人员就没能从所试验过的大多数其他植物的叶片中分离出活细胞。现在广泛用于分离叶肉细胞的方法是先把叶片轻轻研碎，然后再通过过滤和离心把细胞净化。具体做法是：在研钵中放人 10 g 叶片和 40 ml 研磨介质(20mol 蔗糖，10mol MgCl2，20mol tris-HCl 缓冲液，pH 值 7.8)，用研杆轻轻研磨。之后，将匀浆用两层细纱布过滤，在研磨介质中以低速离心将得到的细胞净化。除了双子叶植物外，很多单子叶植物(其中可能包括禾本科植物，但尚未证明)也能通过这个方法产生完整的叶肉细胞。应用类似方法后人由马唐中分离出具有代谢活性的叶肉细胞和维管束鞘细胞，
5、由菠菜3中分离出叶肉细胞，由篱天剑、石刁柏等叶片中分离大量游离薄壁细胞，由大豆子叶分离出了活细胞。和酶解法相比，用机械法分离细胞至少有两个明显的优点：细胞不受酶的伤害；不会发生质壁分离。这点对生理和生化研究来说是很理想的。一般用机械法分离的细胞能够发生分裂并形成愈伤组织。但这种机械分离细胞的方法并不普遍适用，只有在薄壁组织排列松散，细胞间接触点很少时，用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。1.1.2 酶解法利用果胶酶(pectase)处理植物叶片，使细胞间的中胶层发生降解，分离出具有代谢活性的细胞。Takebe 等(1968)最早报道了由烟草叶片通过果胶酶处理分离叶肉细胞的方法（p9899，附录
6、6.2）：首先取烟草植株上充分展开的叶片进行表面消毒，无菌蒸馏水冲洗干净，用镊子撕去下表皮，用解剖刀将撕去下表皮的叶片切成4cm4cm 的小块，放人经过过滤灭菌的酶液(含果胶酶 0.5+甘露醇 0.8+硫酸葡聚糖钾 1)中，用真空泵抽气，使酶液渗入叶肉组织内。在摇床上保温培养，每 30min 更换一次酶液，将第一次30min 后换出的酶液弃掉，第二次 30min 后，酶液中主要分离出海绵薄壁细胞，第三和第四次以后主要分离出栅栏细胞。Takebe 等(1968)证明，在离析混合液中加入硫酸葡聚糖钾可作为原生质膜的稳定剂，降低酶液中核糖核酸酶的活力，保持质膜稳定性，提高游离细胞的产量。用于分离细胞
7、的果胶酶不仅能降解中4胶层，而且还能软化细胞壁。因此，用酶解法分离细胞时，必须对酶溶液给予渗透压保护，防止细胞的胀裂。如果所用的甘露醇的浓度低于 0.3molL，烟草原生质体将会在细胞壁内崩解。酶解法分离细胞能得到较均匀一致的海绵组织细胞或栅栏组织细胞。但在有些物种中，特别是大麦、小麦、玉米等单子叶植物中，很难通过酶解法使细胞分离，因为与双子叶植物相比，这些植物的叶肉细胞较长，并在若干地方发生收缩，细胞间可能形成一种互锁结构，阻止细胞的分离。1.2 由培养组织中分离单细胞用于基础研究和应用研究的单细胞系统，在传统上常常是由离体培养的组织分离得到的，因为这个途径不但方便，而且广泛适用。只要把由经
8、过表面消毒的器官上刚刚切取下来的一小块组织，置于含有适当比例的生长素和细胞分裂素的培养基上，即可建立起组织培养物。在这样一种培养基上，外植体愈伤组织化。这个过程一般是由切口开始，逐渐扩展到接种组织的整个表面。把愈伤组织由外植体上剥离，转移到成分相同的新鲜培养基上，促使愈伤组织生长，这个过程称做继代培养(subculture)。通过反复地在琼脂培养基上继代，不但可使愈伤组织不断增殖，扩大数量，而且还能提高愈伤组织的松散性，这对于在液体培养基中建立充分分散的细胞悬浮培养物是非常必要的。然而 Wilson 和 Street(1975)观察到，当把新切取下来的橡胶树愈伤组织转移到液体培养基中并加以搅动
9、时，愈伤组织只能破碎成小块，想由此建立高度分散的细胞悬浮液的努力5全部归于失败。于是他们又把在液体培养基中生长的愈伤组织块转回到琼脂培养基上。两个月后形成了很易散碎的愈伤组织，当把这些愈伤组织再转移到液体培养基中以后，产生了很好的悬浮液。由愈伤组织获得游离细胞的具体做法是，把未分化的和易散碎的愈伤组织约 2 g 转移到装有 3050 m1 液体培养基的三角瓶中，在 251，弱光或黑暗中，将三角瓶置于摇床上不断振荡(120 rmin)。初期每 10 d 左右用新鲜培养液更换掉三角瓶中大约 45的旧液，同时将飘浮在原培养液上层的细胞碎片和长弯形衰败细胞淘汰。几个周期之后，培养液由浊变清，开始出现胞
10、质浓密的单细胞和小细胞团。此后不断进行继代培养，直至建成良好的悬浮培养物。在这里振荡至少有两种作用。首先，它可对细胞团施加一种缓和的压力，使它们破碎成小细胞团和单细胞；其次，振荡可以使细胞和小细胞团在培养基中保持均匀的分布。此外，培养基的运动还会促进培养基和容器内空气之间的气体交换。2 细胞悬浮培养2.1 细胞悬浮培养的概念及优点悬浮培养(suspension culture)是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。植物细胞的悬浮培养是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的。自 20 世纪 50 年代以来，从试管的悬浮培养发展到大容量的发酵罐培养，从不连续培养发展
11、到半连续和连续培养。80 年代以来，植物细胞培养作为生物技术的一个组成部分，正在发展成为一门新兴的科技产业体系。6悬浮细胞培养的主要优点是：能大量提供比较均匀一致的细胞，也就是同步分离的细胞；细胞增殖的速度比愈伤组织快；适宜大规模培养，成为细胞工程中独特的产业。2.2 细胞悬浮培养的类型2.2.1 分批培养分批培养(batch culture)是指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。在培养过程中除了气体和挥发性代谢产物可以同外界环境交换外，一切都是密闭的。当培养基中的主要成分耗尽时，细胞停止分裂和生长。分批培养所用的容器一般是 1002
12、50ml 三角瓶，每瓶装 2075ml 培养基。为了使分批培养的细胞不断增殖，必须及时进行继代。继代的方法可以是取出培养瓶中一小部分悬浮液，转接到成分相同的新鲜培养基中(约稀释 5 倍)。也可以用纱布或不锈钢网进行过滤，滤液接种，这样可提高下一代培养物中单细胞的比例。培养用的液体培养基虽因物种而异，但凡适合愈伤组织生长的培养基，除去琼脂，均可作为悬浮细胞培养基。在分批培养中，细胞数目会发生不断变化，呈现出细胞生长周期。在整个生长周期中，细胞数目增加的变化过程大致呈“S”形(图 5-1)。 7图 5-1 在分批培养中每单位容积悬浮培养液内的细胞数与培养时间关系的示意图 (引自 wilson 等，
13、1971)初期增长慢，称延滞期(lag phase)，特点是细胞很少分裂，细胞数目不增加；中期生长快，称对数增长期(logarithmic phase)，特点是细胞分裂活跃，数目迅速增加；到了细胞增殖最快的时期，单位时间内细胞数目增长大致恒定，细胞数目达到最高峰，称为直线生长期(linear phase)；随后由于培养基中某些营养物耗尽，或是有毒代谢物的积累，细胞增长逐渐变慢进入缓慢期(retard phase)；最后生长趋于完全停止，进入静止期(stationary phase)。滞后期的长短主要取决于在继代时原种培养细胞所处的生长期和转入细胞数量的多少。当转入的细胞数量较少时，不但滞后期较
14、长，而且在一个培养周期中细胞增殖的数量也少。如果转入的细胞密度很低，则在加入培养单细胞或小群体细胞所必需的营养物质之前，细胞将不能生长。另外，如果缩短两次继代的时间间隔，例如，每 23 d 即继代一次，则可使悬浮培养的细胞一直保持对数生长。如果使处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长，则会引起细胞的大量死亡和解体。因此，8当细胞悬浮液达到最大干重产量之后，即在刚进入静止期的时候，须尽快进行继代。在分批培养中，细胞繁殖一代所需的最短时间，即在对数生长期中细胞数目加倍所需的时间因不同植物而异，烟草为 48h，蔷薇 36h，菜豆 24h。一般讲，这些时间都长于在整体植株上分生组织中细胞数目加倍所需的时间
15、。在对悬浮培养细胞进行继代时可使用吸管或注射器，但其进液口的孔径必须小到只能通过单细胞和小细胞团(24 个细胞)，而不能通过大的细胞聚集体。继代前应先使三角瓶静置数秒，以便让大的细胞团沉降下去，然后再由上层吸取悬浮液。如果每次继代都依这个办法操作，就有可能建立起理想的细胞悬浮培养物。分批培养对于研究细胞的生长代谢并不是一种理想的培养方式。在分批培养中，由于细胞生长和代谢的方式以及培养基成分不断改变，没有一个稳定的生长期，相对于细胞的数目，代谢产物和酶的浓度也不能保持恒定。这些问题在某种程度上可通过连续培养加以解决。2.2.2 半连续培养半连续培养是利用培养罐进行细胞大量培养的一种方式。在半连续
16、培养中，当培养罐内细胞数目增殖到一定量后，倒出一半细胞悬浮液于另一个培养罐内，再分别加入新鲜培养基继续进行培养，如此这样频繁地进行再培养。半连续培养能够重复获得大量均匀一致的培养细胞供生化研究之用。2.2.3 连续培养9连续培养(continuous culture)是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。连续培养的特点是：在连续培养中由于不断注入新鲜培养基，排掉旧的培养基，保证养分的充足供应，不会出现悬浮培养物发生营养亏缺的现象。连续培养可在培养期间内使细胞长久地保持在对数生长期中，细胞增殖速度快。连续培养适于大规模工厂化生产。连续培养有封闭型和开放型之分。(1)封闭型连续培养封闭
17、型连续培养是指在培养过程中，排出的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。悬浮在排出液中的细胞经机械方法收集后再放回到培养系统中，因此在这种培养方式中，随培养时间延长，细胞密度会不断增加。(2)开放型连续培养在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使培养细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞数相当于培养系统中新细胞的增加数。开放型培养又可分为两种主要方式：一是化学恒定式；二是浊度恒定式。浊度恒定式。在浊度恒定培养中，新鲜培养基是间断注入的，
18、受细胞密度增长所引起的培养液浑浊度增加的控制。可以选定一种细胞密度，当超过这个细胞密度时，使细胞随着培养液一起排出，以保持细胞密度的恒定。10化学恒定式。在化学恒定式培养中，为使细胞密度保持恒定状态，可采用两种方法。一种是以固定速度注入新鲜培养基，将培养基内的某种营养成分(如氮、磷或葡萄糖 )的浓度调节成为一种生长限制浓度，从而使细胞的增殖保持稳定状态。在这种培养基中，除生长限制成分以外的其他成分的浓度都保持在细胞生长所需要的水平上，而生长限制因子被调节在一定水平上，它的任何增减都可由细胞增长速度的增减反映出来。二是控制培养液进入的速度，使细胞稀释的速度正好和细胞增殖的速度相同，因此培养液中细
19、胞密度一直保持恒定状态。化学恒定式的最大特点是通过限制营养物质的浓度来控制细胞的增长速度。此方法在大规模细胞培养的工业上有巨大的应用潜力。连续培养是植物细胞培养技术中的一个重要进展，这种培养技术对于植物细胞代谢调节的研究、各个生长限制因子对细胞生长的影响以及对次生物质的大量生产等都有重要的意义。由悬浮细胞可以再生植株，其再生植株通常有 2 条途径：一是由悬浮细胞直接形成体细胞胚；二是先将悬浮细胞在半固体培养基上诱导形成愈伤组织，然后再由愈伤组织分化植株。2.3 细胞悬浮培养的培养基要获得高质量的悬浮培养物，最初使用疏松的愈伤组织十分重要。由于愈伤组织质地是遗传控制的，所以要获得细胞分散良好的悬浮培养物常常不是一件轻而易举的事情。改变培养基成分和继代培养程序有助于获得松散的培养组织，在培养基中加入 2,4-D、少量
