1、山东大学生命科学学院 08 级生命基地2010 年 10 月 31 日星期日质粒 DNA 提取碱变性提取法栾一山 大 南 路 27 号 质粒 DNA 提取- 碱变性提取法2 / 17质粒 DNA 的提取 碱变性提取法实验目的：1 掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。2 掌握碱变性法提取质粒 DNA的方法。仪器和材料；恒温振荡培养箱，高速冷冻离心机，漩涡振荡器；1.5ml 离心管，50ml 离心管；不同型号的的枪尖等。菌体：E.coliDH5 受菌体，具有 AMPr 标记的质粒 PUC19。实验试剂：LB培养基，抗生素，溶液 I，溶液 II，溶液 III，RNase A母液，TE 缓冲液，饱
2、和酚等。试验原理：碱裂解法是较常用质粒的提取的方法。其优点是收获率高，适于多数的菌株，所得产物经纯化后可满足多数的 DNA重组操作。该方法操作简单，易于操作,一般实验室均可进行。十二烷基磺用于进行质粒的小量制备。十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性。用 SDS处理细菌后，会导致细菌细胞破裂，释放出质粒 DNA和染色体 DNA，两种 DNA在强碱环境都会变性。由于质粒和主染色体的拓扑结构不同，变性时前者虽然两条链分离，却仍然缠绕在一起不分开；但后者完全变性分甚至出现断裂，因此，当加入 pH4.8的酸性乙酸钾降低溶液 pH值，使溶液质粒 DNA
3、 提取- 碱变性提取法3 / 17pH值恢复较低的近中性水平时， 质粒的两条小分子单链可迅速复性恢复双链结构，但是主染色体 DNA则难以复性。在离心时，大部分主染色体与细胞碎片，杂质等缠绕一起被沉淀，而可溶性的质粒 DNA留在上清夜中。再由异丙醇沉淀、乙醇洗涤，可得到纯化的质粒 DNA。碱裂解法提取的质粒 DNA可直接用于酶切、PCR 扩增、银染序列分析等.DNA 粗提取所用的三种溶液：溶液 I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液 II，0.2 M NaOH / 1% SDS；溶液 III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸；溶液 I：
4、任何生物化学反应，首先要控制好溶液的 pH，因此用适当浓度的和适当pH值的 Tris-Cl溶液，是再自然不过的了。加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液 I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液 I中葡萄糖是可缺的。EDTA 是 Ca2+和 Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制 DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液 I中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加 EDTA，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速
5、被降解，因为最终溶解质粒的 TE缓冲液中有 EDTA。如果缺少溶液 I，只要用等体积的水，或 LB培养基来悬浮菌体就可以了。不过菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。质粒 DNA 提取- 碱变性提取法4 / 17溶液 II：是用新鲜的 0.4 N的 NaOH和 2的 SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备 0.4N的 NaOH，是为了保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提法。事实上 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜
6、）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用 SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。基因组 DNA的断裂会带来麻烦。溶液 III：它加入后就会有大量的沉淀，大量沉淀的出现，显然与 SDS的加入有关系。如果在溶液 II中不加 SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质
7、。在 1的 SDS溶液中慢慢加入 5 N的NaCl，你会发现 SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是 NaCl而是 KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS） ，而 PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液 III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了 SDS质粒 DNA 提取- 碱变性提取法5 / 17中的钠离子形成了不溶性的 PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。 SDS专门喜欢和蛋白质结
8、合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组 DNA也一起被共沉淀了。因为基因组 DNA太长了，长长的 DNA自然容易被 SDS给共沉淀了，尽管 SDS并不与 DNA分子结合。那么 2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA一旦发生断裂，只要是50 100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组 DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总 DNA条带。DNA
9、分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH 本来是为了溶解细胞而用的，DNA 分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 SDS沉淀更充分一点。试验准备：1、 溶液:pH8.0 GET缓冲液（50mmol 葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L TrisHCl）；2、 溶液 ：0.2mol/LNaOH(内含 1的 SDS)，这个用的时候需现配。要新配置溶液是为了避免 NaOH接触空气中的 CO2而减弱了碱性。3、 溶液 ：pH4.8 乙酸钾溶液（ 60ml 5mol/L KAc，11.5ml 冰醋酸，28.5mlH2O）；
10、质粒 DNA 提取- 碱变性提取法6 / 174、 异丙醇；采用 PEG（6000 ）沉淀 DNA，大小不同的 DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG 的浓度低，选择性沉淀 DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需 1左右，小分子所需 PEG浓度高达 20。5、 pH8.0TE缓冲液；10mmol/LTrisHCl，1mmol/L EDTA，其中含 RNA酶 20ug/ml。实验步骤1、 配制 LB液体培养基，灭菌枪尖（1000ul/200ul/20ul）、2 个 50ml离心管，吸管，三角瓶等。2、 把 E.coliDH5接种到含 20mlLB和氨苄青霉素培养基中，在 37摄氏度下，过
11、夜培养。（注意无菌操作，防止杂菌干扰试验。）3、 从摇床中取出过夜培养的细菌，轻轻混匀，取 2-3ml菌液转接到含 50ml含有氨苄青霉素的 LB液体培养基中，37 160r/min振荡培养过夜或至对数生长晚期。（经过一夜的培养，液体培养基底部浑浊，菌体大量沉淀。）4、 先称量 50ml灭菌离心管 的质量 m1，然后取一定量的菌体培养液于其中，7000rpm离心 5min，弃上清液，收集菌体。5、 沉淀中加 5ml用冰预冷的溶液 I，充分混合（需要剧烈振荡）。7000rpm离心 5min，弃上清液，收集菌体。离心管倒扣于干净的吸水纸上吸干。称量其质量 m2。（m2-m1 是菌体湿重，干燥时使离
12、心质粒 DNA 提取- 碱变性提取法7 / 17管口向下，直到看不见液滴。加入离心管前，混匀菌体。加入溶液 I时，一定要打散菌泥）。6、按湿菌体质量：溶液 I质量=100mg：1ml 的比例加入用冰预冷的溶液 I，剧烈震荡，使菌体完全分开。冰浴 5min。（打散菌体可用吹吸助溶，或漩涡振荡器。这一步主要是悬浮菌体）7、以二倍溶液 I的体积量加入溶液 II,慢慢颠倒，使之混匀（切勿剧烈震荡！），将离心管置于冰上 5min,此时，溶液粘稠如蛋清。（滴加溶液 II时，要逐滴加入，且要轻振溶液使之混匀，整体动作要快，因为强碱在溶液中停留时间不能过长，它也会破坏质粒 DNA，如果操作慢时，可适当减少冰浴
13、时间。G-细胞壁薄，所以强碱足以损坏细胞壁，不需要额外添加酶。加入溶液 II，轻振后，溶液变得粘稠。 ）8、以 1.5倍溶液 I的体积加入冰浴后的 溶液 III，轻轻颠倒数次混匀，使之在粘稠的细菌裂解物中分布均匀，将离心管置于冰浴 5 min 。（加入溶液 III后，生成了大量的絮状沉淀，在冰上静置后，沉淀沉在溶液底部。溶液 III中和强碱使质粒复性，不可剧烈震荡，可放冰上使它自己混匀。）9、以 4 ， 12000rpm离心 15min，取上清液于另一新离心管中。（白色沉淀聚集在离心管一侧，上清液澄清。取离心管时，不改变其倾斜度，斜着插进枪尖，切勿触碰下部沉淀，吸取时，计算上清液体积。尽可能多
14、的吸取上清液。）10、向上清液中加入 1/10体积的 NaAc和 2倍体积的无水乙醇，混匀，-20下沉降 30分钟。（加入上述溶液后，溶液变浑浊，不过浑浊程度明显小于加入溶液 III。高浓度的盐有利于质粒的沉降。）质粒 DNA 提取- 碱变性提取法8 / 1711、 以 12000rpm离心 15min，小心倒去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有的液体流出。12、向 DNA沉淀中加入 70%冰乙醇 5ml，以 12000rpm离心 5min，（离心管底部 DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上。（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体打到
15、沉淀的对面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。离心时，小心放置离心管位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。粗提取的质粒呈浅黄色，随着水分的减少质粒变为无色。所以为了完全溶解质粒，在离心管上标记质粒所在位置是必要的。）13、将 DNA沉淀溶于 1mlTE缓冲液中，转移到一个 Eppendorf管中，加入RNase A（纯浓度 50ug/ml），37 保温 1小时。（加入 TE溶液溶解质粒时，可以用 600ul溶解，400ul 冲洗未完全转移的质粒。吹吸助溶时，用黄色枪尖吸取溶液，打在刚刚标记的质粒位置的上面，由于质粒本身黏着，容易产生气泡，枪尖溶液快打完时，不要把枪尖插入溶液中。加入酶后混匀溶液
16、保温。）14、将上述的溶液平均分配到 2个 1.5ml的微量离心管中，每管 0.5ml，分别加入与溶液等体积的饱和苯酚溶液，振荡混匀，以 4，7 000rpm,离心5min，取上层水相到一洁净的 Eppendorf管中。（苯酚是经 Tris饱和后的，显黄色。苯酚加入后，溶液分层，苯酚向下，下层呈浅黄色，上层溶液无色，在中间产生大量白色沉淀，此为变性后的蛋白质。通过两个离心管液体高度的比较，加入与原来溶液相同体积的苯酚。苯酚加入后，放平离心管，混合均匀。离心后，取离心管时不改变离心管的倾斜角度，用黄质粒 DNA 提取- 碱变性提取法9 / 17色枪尖吸取上层清液。尽可能多的吸取上清液，但不要吸入
17、蛋白质。）15、加入等体积的苯酚/氯仿溶液（ 1:1），振荡混匀，以 4，7 000rpm,离心5min，取上清液到一洁净的 Eppendorf管中。（此时溶液中已看不到明显的白色沉淀，但相信仍有蛋白质的存在。）16、加入等体积的氯仿溶液，振荡混匀，以 4 ，7 000rpm,离心 5min，取上清液到一洁净的 Eppendorf管中。（苯酚是强的蛋白变性剂，但是苯酚留在质粒溶液中会影响 DNA的酶切，它本身易被氧化，会损伤质粒。氯仿也是蛋白变性剂，但是比酚弱，且能溶解质粒中的脂类，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。）17、向上清液中加入 1/10体积的 NaAc和 2倍体积的无水乙醇，混匀，-20
18、下沉降 30分钟。以 12000rpm,离心 15min，弃去上清液。（加入高盐和乙醇后，有少量的 DNA生成，相对于粗的质粒，含量少了不少。）18、向 DNA沉淀中加入 70%冰乙醇 200ul，以 12000rpm离心 5min，（离心管底部 DNA沉淀所在面应与收集沉淀面一致。）去掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，室温干燥。（加入乙醇时，不打散沉淀洗涤盐分。枪尖深入离心管中，把液体打到沉淀的对面，然后转动离心管，使沉淀被液体覆盖。离心时，小心放置离心管位置，不改变质粒沉降位置，沉淀面朝外。此时质粒呈白色。）19、用 100ulTE溶解质粒（先把溶液加入其中一个离心管中，打散沉淀，充分混合
19、，然后把溶液转移到另一个离心管中。）20、按所分离的 DNA分子的大小范围，称取 0.36g的琼脂糖粉末，放到一锥形瓶中，加入 40ml的 1TBE电泳缓冲液。然后置微波炉加热至完全溶化质粒 DNA 提取- 碱变性提取法10 / 17，溶液透明。摇匀，得胶液。冷却至 60左右。（加入电泳缓冲液液后，在三角瓶上标好液面位置，再加入 5-10ml重蒸水，以补充在溶胶过程中损失的水分。加热时，放置在微波炉轮盘边缘，用中火加热 3min，加热后，若液面低于标线，用枪尖沿着三角瓶边缘慢慢加入。）21、取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。22、水平放置胶
20、槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至 60左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。23、待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。24、在槽内加入 1TBE 电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面25、把待检测的样品，按以下量在洁净载玻片上小心混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。(1l 加电泳载样液 +3l待测 DNA样品.)26、接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，开始电泳。点样端放阴极端。根据经验调节电压使分带清晰。电泳 1h。27、观察溴酚兰的带（蓝色）的移动。当其移动至距胶板前沿约 1cm处，可停止电泳。28、染色：把胶槽取出，小心滑出胶块，水平放置于一张保鲜膜或其他支持物上，放进 EB溶液中进行染色，完全浸泡约 3-5min。29、在紫外透视仪的样品台上重新铺上一张保鲜膜，赶去气泡平铺，然后把已染色的凝胶放在上面。关上样品室外门，打开紫外灯（360nm 或 254nm），通过观察孔进行观察。
