1、单击此处编辑母版标题样 式 单击此处编辑母版副标题样式 * 1 第七章 生物技术与食品安全 和品质控制 第一节 生物传感器及其在食品检测分析中的 应用 由固定化的具有分子识别功能的生物材料、换能器和 信号处理放大装置组成的分析工具或系统。 （一）生物传感器的基本组成和分类 1.生物传感器的基本组成 生物识别元件 ：生物传感器中固定化的酶、微生物细 胞、抗原抗体和组织切片等具有分子识别能力的生物敏感 材料。 换能器 ：能将在生物敏感材料上进行的生化反应产生 的各种信息转换成电信号的装置。 信号处理装置 ：负责信号的分析处理和放大输出。 一、生物传感器的基本概念一、生物传感器的基本概念 2.生物传
2、感器的分类 根据生物敏感材料可分为 酶传感器 、 微生物传感器 、 免疫传感器 、 细胞传感器 、 组织传感器 和 DNA传感器 。 根据换能器的不同，可分为 电化学传感器 、 介体生物 传感器 、 测光型生物传感器 、 测热型生物传感器 、 半导体 生物传感器 和 压电晶体生物传感器 等。 以上两种分类会相互交叉，例如，酶传感器根据换能 器的不同又可分为酶电极、酶热敏传感器和酶光极等。 具体到某一种传感器的命名，一般是采用 “ 功能 +结构 特征 ” 的方法，例如，葡萄糖氧化酶光纤传感器等。 （二）生物传感器的工作原理 通过生物的分子识别作用，生物传感器中的生物敏感 材料和生物样品中的待测物
3、质特异性结合，并进行生物化 学反应，产生离子、质子和质量变化等信号，信号的大小 在一定条件下和样品中被测物质的量存在一定的关系，这 些信号经换能器转换成电信号，电信号再经信号分析处理 系统处理后输出，反映出样品中被测物质的量。 1.分子识别（ molecular recognition） 生物传感器中的分子识别 :指生物敏感材料中生物分 子能选择性地和待测样品中的待测成分进行特异性（选择 性）结合的性质。生物敏感材料包括酶、抗原（体）等免 疫物质、微生物细胞、组织切片和 DNA等。 酶的分子识别 :指酶分子只能和特定的底物分子进行 结合，而不能和其他分子结合的特性。酶分子的识别能力 主要是由酶
4、的活性中心决定，其决定了以酶为生物敏感材 料的生物传感器的分子识别能力。 免疫传感器的分子识别 ：由传感器上的生物敏感材料 抗原或抗体物质的分子识别能力决定，抗原和抗体象酶 和底物一样也能发生特异性（选择性）结合。 DNA传感器的分子识别 ：由 DNA分子中碱基对的互补结 合特性决定。 2.生化反应中量的变化和信号的转换 （ 1）热焓的变化及其转换 （ 2）光效应及其转换 （ 3）颜色的变化及其转化 （ 4）阻抗的变化及其转换 （ 5）生化反应中其他量的变化及其转化 （ 6）直接产生电信号 3.生物放大（ biological amplification） （ 1）酶催化放大 酶是高效专一的催
5、化剂，它可以在很短的时间内催化 大量底物的转化，通过测定酶所催化反应中底物的减少量 或产物的增加量可以推测（判断）反应中比底物减少量或 产物增加量少得多的酶量，或与酶相关联的其他物质的量 ，从而实现生物放大作用。应用这一放大原理可以使检测 方法的灵敏度（最小检出量）比常规检测方法提高 2个 数 量级。 （ 2）底物循环放大 被测物 S1或 S2，在酶 E1和酶 E2之间不断循环，每循环 一次， E1和 E2都要分别消耗各自的底物 C1和 C2，产生对应 的产物 P1和 P2，而循环过程中被测物 S1和 S2的浓度保持不 变，通过分析 C1和 C2的消耗量或 P1和 P2的增加量就可以测 定待测
6、物 S1或 S2的量，实现放大效应。循环的次数越多酶 消耗的底物和产生的产物越多，放大效率也越高（ 图 ）。 （ 3）酶级联放大 生物体内的有些酶（通常为酶原）本身是没有活性 ，在辅酶、另外一种酶或酶的变构效应物等激活剂的作 用下，酶 E1i被激活为酶 E1a， E1a激活 E2i成 E2a， E2a又激 活 E3i或 E3a，由于酶是催化剂可以连续使用，这样经过一 系列的反应，一个分子的辅酶或变构效应物等激活剂就 能够产生成千上万分子的 E3a，然后 E3a催化底物 S3产生产 物 P3，通过测定底物的消耗量或产物的生成量就可以灵敏 地测定辅酶或变构效应物等激活剂的量（ 图 ）。 优点 ：效
7、率极高，对提高生物传感器的灵敏度极为 有效。 缺点 ：在生物传感器中的应用条件较为苛刻。 （ 4）脂质体技术 脂质体 ：由类似于细胞膜的脂质膜构成的微球体，在 微球体的内部包含有被酶、荧光素或电活性物质标记的抗 原或抗体等标志物，微球体的外膜上结合有抗原（抗体） ，当外膜上的抗原（抗体）与待测的抗体（抗原）发生反 应，并和补体结合时（或在表面活性剂的作用下），微球 体破裂，微球体内的标志物被释放。标志物的量大且容易 测定，通过测定标志物的释放量就可以测定出待测抗体（ 抗原）的量，从而实现生物放大（ 图 ）。 缺点 ：目前还存在着微球体内的标志物容易渗漏和脂 质体的稳定性较差等不足之处。 （四）
8、生物传感器的特点 1.省时省力，简便快速 2.成本低 3.不需添加试剂 4.灵敏度高 5.体积小 6.易于实现自动化 7.易于推广普及 二、生物传感器中生物敏感材料的固定化 和成膜技术 （一）生物材料的固定化技术 指通过物理或化学的方法将酶、微生物细胞和抗原抗 体等生物材料限制在一定的区间内，使生物材料只能在特 定的区间进行生化反应，而反应的底物和产物可以自由扩 散的技术。 生物材料常用的固定化方法包括：夹心法、吸附法、 包埋法、交联法、共价结合法和微胶囊法等（ 图 ）。 （二）成膜技术 1.半导体生物传感器中的成膜技术 （ 1）紫外线照射法 在一个芯片的两个极上均匀涂上（覆盖）一层活性固 定
9、化酶膜，在其中的一极上盖上光防护罩，然后以紫外线 照射，由于紫外线的穿透能力很差，因此有光防护罩一极 的酶保留活性，而另一极上的酶在紫外线的照射下失活， 酶失活的一极就可作为半导体传感器中的参比（ 图 ）。 （ 2）光平板印刷法 在一块芯片上，首先将酶和光敏聚合物（如聚乙烯醇 、聚丙烯酰胺等）的混合溶液涂布于芯片的两极，形成一 层溶液膜 ,以光防护物盖住芯片，在需要有酶膜一极的部位 开一个孔，然后以光照射，一定时间后，开孔一极上的光 敏聚合物和酶的混合物溶液膜在光的照射下聚合形成固定 化酶膜，另一极则仍然为溶液状态。将芯片置于溶剂中以 超声波处理，去除未聚合的聚合物溶液和酶，而光聚合后 的固定
10、化酶膜仍保留在一极上（ 图 ）。 （ 3）喷射法 在计算机的控制下，芯片在特定喷嘴和戊二醛蒸汽室 间来回运动，当芯片上需要成膜的部位到达喷嘴处时，喷 嘴将酶和其他高分子材料（例如牛血清白蛋白）的混合溶 液滴注在该部位，然后进人戊二醛蒸汽室进行适度的交联 成膜。如此重复数次，最后将整个芯片浸入戊二醛溶液中 ，进一步交联。 2.L-B膜技术 一种能在低温低压条件下制备高密度、分子排列方向 一致的单分子层或多分子层薄膜的技术。以这种技术制成 的膜以该技术的发明者 Langmuir和 Blodgett的名字命名， 称为 L-B膜。 基本原理 ：生物大分子，例如脂质分子和某些蛋白质 分子，在特定的条件下
11、，在洁净的水表面展开后能形成水 不溶性的液态单分子膜，小心压缩表面使液态膜逐渐过渡 成为一分子厚度的拟固态膜（ 图 ）。 优点 ： L-B 膜可以很薄（数纳米以下），便于传感 器的微型化而且响应时间短。 L-B 膜的构造和生物体内 的膜构造很相似，有较好的仿生价值，便于制备可以在体 内使用的生物传感器。 三、生物传感器在食品安全和品质控制中的应用 （一）农药和抗生素残留的分析 1.农药残留的生物传感器检测 目前有机磷农药中的马拉松、甲基马拉松、乙基马拉 松、速效磷、久效磷和百治磷等，以及氨基甲酯类农药中 的滴灭威、西维因、灭虫多和残杀威等农药在食品中残留 量的生物传感器检测都有相应的研究报道。
12、 2019年余孝颖等采用离子敏场效应管为基础传感器（ 换能器），将乙酰胆碱酯酶通过戊二醛共价交联固定于场 效应管上，制备得到了 乙酰胆碱 酯酶场效应管传感器，用 于分析敌敌畏等有机磷农药的残留。 原理 ：乙酰胆碱酯酶能催化 乙酰胆碱 水解成胆碱和乙 酸，当存在有机磷农药残留时，它们能够抑制乙酰胆碱酯 酶的活性，从而使底物的分解减少，胆碱和乙酸的产生减 少，其中乙酸的减少量可以通过离子场效应管来测定，且 在一定条件下，乙酸的减少量和有机磷农药的量之间存在 一定的比例关系，因此根据乙酸的减少量就可以计算出有 机磷农药的残留。 2.抗生素残留的分析 青霉素和磺胺是兽药中常用的抗生素，其残留会污染 动
13、物性食品，从而对人类的健康造成危害。 Sternesioes等人采用免疫传感器测定了牛奶中硫胺 二甲嘧啶的含量，灵敏度达到 1ng g，传感器表面经 NaOH 和 HCl处理后可以重复使用。 Avon等用抗体酶共轭物为敏感材料结合光度分析法检 测了牛奶中青霉素的含量。 （二）食品添加剂的分析 亚硫酸盐 是常用的食品防腐剂和漂白剂，但是亚硫酸 盐容易引起哮喘，美国 FDA规定了其在新鲜水果和蔬菜等 食品中的含量不得超过 110 -6mol L。 天冬酰苯丙氨酸甲酯 ，又称甜味素，是人工合成的低 热量甜味剂。 烟碱酸属于 B族维生素 ，可以作为肉类食品的发色剂 ，但是人体摄入过量的烟碱酸会引起瘙痒
14、和头痛等中毒症 状，在日本已禁止使用。 其他食品添加剂 ，如防腐剂苯甲酸钠、羟基苯甲酸钠 、过氧化氢，抗氧化剂抗坏血酸、脱氢抗坏血酸、儿茶酚 、儿茶酚胺，发色剂亚硝酸，酸味剂磷酸和乳酸等都可以 用相应的生物传感器来检测它们在食品中的含量。 （三）污染微生物的检测 污染食品的微生物可以分为腐败菌和病原菌。 腐败菌 主要是通过对食品成分的分解和破坏，同时产生有毒有害 物质从而对人体造成危害。腐败菌本身通常不是致病菌。 病原菌 除了能破坏食品的组成成分外，其菌体本身也能使 人致病。 食品中污染微生物的检测方法通常是 平板计数法 ，其 操作繁琐，检测时间长，特别是对于病原菌的检测，有时 长达 l-2周
15、才能出结果，因此各种快速检测方法不断涌现 ，生物传感器检测方法就是其中的一种。 1.腐败菌的检测 酿酒酵母、乳酸菌和枯草芽孢杆菌等是常见的食品腐 败菌。 2.病原菌的检测 常见的污染食品的病原菌有沙门氏菌、大肠杆菌、金 黄色葡萄球菌、李斯特氏菌、产气荚膜梭菌和蜡样芽孢杆 菌等。这些病原菌按常规的检测方法检测时间很长，而采 用生物传感器则能迅速地测定它们的数量。 用来测定病原菌的生物传感器主要是光纤生物传感器 、免疫生物传感器和 DNA生物传感器。 目前，上述病原菌都可以用相应的生物传感器来测定 。 （四）生物毒素的检测 污染食品的生物毒素主要包括细菌毒素、真菌毒素、 藻类毒素以及动植物毒素，其
16、中以细菌毒素和真菌毒素最 为常见。 检测毒素的方法包括色谱法（气相色谱、液相色谱、 薄层层析等）和生物学方法等，这些方法检测时间长，对 样品的前处理复杂繁琐。以免疫学方法和生物传感器检测 方法为代表的各种快速方法备受欢迎。 1.细菌毒素的分析 细菌毒素是由细菌分泌产生于细胞外或存在于细胞内 的致病性物质，有内毒素和外毒素之分。 内毒素 ：革兰氏阴性细菌细胞壁的组成成分之一的脂 多糖，热稳定，抗原性差，不能转化为类毒素，毒性比较 弱，毫克水平才能引起动物死亡。 外毒素 ：细菌（主要是革兰氏阳性菌，也有少数革兰 氏阴性菌）分泌于胞外的一种蛋白质，热稳定性差，抗原 性强，能转化成类毒素，毒性很强，微
17、克水平就能引起动 物死亡。 目前研究报道主要集中在运用免疫生物传感器分析检 测 肉毒毒素 和 葡萄球菌肠毒素 等细菌外毒素。运用生物传 感器能灵敏、准确、快速地检测到它们在火腿和奶油等食 品中的含量。 2.真菌毒素的分析 真菌毒素是真菌分泌产生的有毒次生代谢产物。常见 的污染食品的真菌毒素主要有 黄曲霉毒素 、 赭霉素 、 杂色 曲霉素 、 T-2毒素 、 腐马素 、 镰刀菌烯醇类毒素 、 展青霉素 和 橘霉素 等。 检测食品中污染真菌毒素的方法主要有薄层层析法和 液相色谱法等。近二十多年来免疫学方法在真菌毒素的检 测中得到了较好的应用，以此为基础的免疫生物传感器快 速检测真菌毒素的方法也有研
18、究报道和应用，其中以免疫 传感器用于检测黄曲霉毒素 B1和腐马素 B1的研究报道最多 。此外，也有运用微生物传感器和以纤毛虫为生物敏感材 料的传感器检测展青霉素、黄曲霉毒素 B1和 T-2毒素的研究 报道。 3.其他生物毒素的检测 也有用于检测食品中污染的动植物毒素。 （五）食品新鲜度的分析 1.鱼鲜度传感器 鱼死亡后，鱼肉中 ATP（三磷酸腺苷）在 ATP酶的作 用下分解成 ADP（二磷酸腺苷）， ADP在磷酸激酶的作用 下分解产生 AMP（一磷酸腺苷）， AMP在 AMP脱氨酶的作 用下转化为 IMP（肌苷酸）， IMP在 5- 核苷酸酶的作用 下分解成 HxR（肌苷）， HxR在核苷磷酸
19、化酶的作用下分 解成 Hx（次黄嘌呤）， Hx在黄嘌呤氧化酶的作用下分解 成尿酸。即： ATPADPAMPIMPHxRHx 尿酸 根据鱼死亡后，鱼肉中 ATP分解代谢后各种代谢产物之 间的比例关系，即 K值或 K1值 也能很好地评判鱼的新鲜度。 K值 ：指上述 ATP代谢产物中，肌苷和次黄嘌呤占 ATP代 谢产物总量的百分数。即： K（ %） =（ HxR+Hx）（ ATP+ADP+AMP+IMP+HxR+Hx） 100 鱼死亡后 ATP、 ADP和 AMP的代谢非常快，一般在很短的 时间（ 24h）内，它们在鱼肉中的含量就几乎为零，而一般 在市场上出售的鱼都是死亡 24h以后的鱼， K值可简
20、化为 K1值 。即： K1（ %） =（ HxR+Hx）（ IMP+HxR+Hx） 100 目前日本等国已制订了根据 K值或 Kl值判断鱼新鲜度 的标准，也成功研制了测定 K值或 K1值的各种生物传感器 。按照日本的标准， K1 0.2时，鱼的品质极好， Kl=0.2 -0.4时，鱼品质较好。 （ 1）多电极传感器系统。主要由四根氧电极组成， 其中一根作为参照，另外三根电极的表面分别固定有黄 嘌呤氧化酶膜，核苷磷酸化酶与黄嘌呤氧化酶膜， 5- 核苷酸酶、核苷磷酸化酶与黄嘌呤氧化酶膜，测定时将 四根电极同时放入样品液中，上述三根酶电极产生的电 信号分别反应了样品液中 Hx的浓度，（ HxR+Hx
21、）的浓度 和（ IMP+HxR+Hx）的浓度，通过计算机处理很容易计算 出 K1的大小。 运用该传感器，只需 20-50L 样品液， 8min就可以 测定 K1值。 （ 2）多酶电极传感器系统。首先将 5- 核苷酸酶、核 苷磷酸化酶与黄嘌呤氧化酶固定在一氧电极上，形成多酶 电极。测试时，样品液先经过一离子交换柱，使 IMP、 HxR 和 Hx分开，然后分别流经有多酶电极的测试室，根据样品 中不同组分流经测试室时电信号的响应情况，运用计算机 分析计算出 K1值。 除了测定 K1值，也有通过生物传感器测定鱼肉中胺类 物质的变化来反应鱼新鲜度的研究报道。另外，采用微生 物传感器测定鱼鲜度的研究也有报
22、道。 2.肉鲜度传感器 和鱼肉一样，其他肉类也可以通过生物传感器来测定 其鲜度。 Kurube等人将单胺氧化酶固定于氧电极上组成了 测定猪肉鲜度的酶传感器，该传感器的响应时间为 4min, 检测的线性范围为 510 -6-1010 -6mo1 L。 Kress等人研 制开发出一种测定肉鲜度的匕首式生物传感器，测定时将 传感器的探头插入肉表面 2-4cm深度，通过测定葡萄糖的 浓度来评价肉的鲜度。 3.牛乳鲜度传感器 主要通过测定牛乳中的微生物数量，牛乳的乳酸增加 量，或牛乳中的脂肪分解成的短脂肪酸的量等来评价牛乳 的鲜度。 第二节 免疫学技术与食品安全检测 （一）抗原 （ antigen） 指
23、进入动物体内能刺激动物的免疫系统发生免疫应答 ，从而引起动物产生抗体或形成致敏淋巴细胞，并能和抗 体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。 1.抗原的分类和基本属性 半抗原 （ hapten） :不能刺激动物产生抗体，只能和对 应的抗体进行特异性结合，即只有免疫反应性，无免疫原 性的抗原。 一、抗原与抗体一、抗原与抗体 完全抗原 （ complete antigen）：既具有免疫原性又 具有免疫反应性的抗原。 超级抗原 （ superantigen）：有些物质，例如某些细 菌毒素，具有非常强的免疫刺激能力，通常可达到一般抗 原刺激能力的 2000倍，只需极低的浓度就可以诱发极大的 免疫反应。 免
24、疫原性 （ immunogenicity） :指抗原进入体内刺激免 疫系统产生抗体或形成致敏淋巴细胞的特性。 免疫反应性 （ immunoreactivity） :指抗原能和对应的 抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的特性。 2.抗原决定簇（ antigenic determinant） 或称为抗原表位，是位于抗原物质分子表面或者其他 部位的具有一定组成和结构的特殊化学基团，能与免疫系 统中淋巴细胞上的受体及相应的抗体分子结合，是免疫原 引起机体特异性免疫应答和免疫原与抗体特异性反应的基 本构成单位。 在蛋白质抗原中， 3-8个氨基酸残基可以构成一个抗 原决定簇，在多糖抗原中 3-6个呋喃环可以
25、组成一个抗原 决定簇。 从结构上抗原决定簇可以分成 顺序决定簇 和 构象决定 簇 。 顺序决定簇 （ sequential determinant）：又称为连 续决定簇，氨基酸的排列顺序决定着这类决定簇的功能基 团。 构象决定簇 （ conformational determinant）：又称 为不连续决定簇，是依赖于蛋白质天然空间构象的决定簇 ，这类决定簇通常由不连续的氨基酸顺序片段经肽链的折 叠卷曲而成，一般位于蛋白质的表面。 研究抗原的决定簇不仅可以揭示抗原与抗体结合的本 质，有助于更好地了解免疫学中的核心问题 免疫识别 和 应答 的机制，而且可以人工合成某些抗原决定簇，这对于 研制疫苗
26、和特异性诊断试剂，以及药物合成和抗病毒感染 等方面都有很大的益处。 3.抗原的分类 根据来源抗原可分为 天然抗原 、 人工抗原 和 合成抗原 等三类。 天然抗原 ：是天然的生物、细胞及天然产物，主要来 自动物、植物和微生物，例如血细胞、细菌和病毒、蛋白 质、多糖、脂类和核酸等都可以是天然抗原。 人工抗原 ：指人工化学改造后的抗原，例如半抗原经 化学改造后就是人工抗原。 合成抗原 ：指化学合成的具有抗原性质的分子，主要 是氨基酸的聚合物。 4.抗原的制备 （ 1）抗原的准备。对微生物细胞等 颗粒状抗原 ，只需 对微生物进行扩大培养，然后收集菌体即可。对蛋白质、 多糖、 DNA和脂类等 可溶性胶体
27、抗原 ，应根据其在生物细胞 中的部位进行处理。存在于细胞内的物质首先应破细胞壁 ，使它们释放出来，然后收集含有这些物质的溶液，再采 用各种分离、提取和纯化方法进行分离和提取。对于分泌 于细胞外的这些高分子物质则只需收集胞外液，然后再进 行分离纯化即可。 （ 2）半抗原的改造。通常是将牛血清白蛋白（ BSA）、 卵清白蛋白（ OV）或人工合成的多聚氨基酸等连接在半抗 原分子上，增加其相对分子质量，从而使其转化成完全抗 原（ 例子见书 ）。 将各种半抗原转化成完全抗原的具体操作方式和注意 事项各不相同，但是有一点必须注意，即在操作过程中应 尽可能保持半抗原结构的 “ 完整性 ” ，不能过度破坏其结
28、 构，以保持半抗原的 “ 原始性 ” 。 （二）抗体 （ amtibody, Ab） 1.抗体的定义、分布和分类 由抗原刺激动物的免疫系统后，由免疫系统分泌的能 和相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白（ immunoglobin ， Ig）。 抗体主要存在于动物血清中，也存在于动物的其他体 液和体外分泌液，例如乳汁和细胞分泌液中。另外，抗体 还存在于某些细胞中。 根据 Ig的理化特性和与抗原结合方式的不同， Ig可以 分为类和亚类。 2.抗体的结构 一个抗体分子通常包括两个完全相同的轻链分子（ 1ight chain）和两个完全相同的重链（ heavy chain） 分子，轻链分子大约由 210
29、个氨基酸残基组成，相对分子 质量约为 2.310 4；重链分子大约由 450个氨基酸残基组 成，相对分子质量约为 5.010 4。这 4条链在氢键和二硫 键（ S-S）作用下连在一起，形成 “Y” 字形结构。 在 “Y” 字形的两个支角上，重链和轻链的 N端区域 在一起形成抗原的识别位点。有一段大约 110个氨基酸残 基的区域随抗体结合特异性的不同而变化，这端区域叫 可变区。除可变区外，抗体分子上还有恒定区。 3.抗体的制备 （ 1）多克隆抗体的制备 以抗原免疫实验动物可以获得含有特异性抗体的血清 ，即抗血清。抗血清中的抗体是由不同的抗原决定簇刺激 不同的 B细胞克隆产生，这种抗体又称为 多克
30、隆抗体 。制 备多克隆抗体包括： 实验动物的选择 。用于制备多克隆抗体的实验动物包 括哺乳类的鼠、兔、羊、马、驴、豚、鼠、猪、猴、狗和 禽类的鸡、鸭、鸽子，以及两栖类的蛙等，其中最为常用 的是鼠、兔和羊等。 在选择实验动物时首先应考虑抗原的来源和免疫动物 的亲缘关系。一般来说，两者的亲缘关系越远则产生的抗 体效价越高，相反则抗体的效价越差。 实验动物的年龄和营养状况与抗体的产生也有密切的 关系，年龄太小易产生免疫耐受；而年龄过大或营养不良 则动物的免疫能力低下，也不易产生高效价的抗体。 选择好实验动物后，在注射抗原前应采集少量的动物 血清（阴性血清）和抗原进行血清学反应，选择不和抗原 反应的动
31、物进行免疫实验。 抗原的处理 。除了前面叙述的抗原的分离提纯和半抗 原的改造外，对于可溶性抗原，在注射免疫动物之前通常 还需和免疫佐剂进行混合（颗粒抗原一般无需和佐剂混合 ，可以直接注射），以提高抗原的免疫原性等。 佐剂 （ adjuvant）：是具有增强机体的免疫应答能力 ，延长抗原在机体内的半衰期，降低抗原毒副作用，以使 机体产生高效价抗血清的物质。最常用的佐剂是 福氏佐剂 ，它分为 完全福氏佐剂 和 不完全福氏佐剂 。 不完全福氏佐剂 ：由 1-6份的液体石蜡和 1份羊毛脂充 分混合而成。 完全福氏佐剂 ：在不完全福氏佐剂的基础上，于使用 前添加灭活的（ 2-20mg mL）卡介苗混合而
32、成。 动物的免疫 。动物的免疫是一个非常复杂的过程，在 免疫过程中，对抗原的免疫剂量、注射途径、加强免疫的 时间间隔和加强免疫的次数等都需要认真综合考虑。 抗原的剂量 应根据抗原的免疫原性强弱、动物的种类 和大小以及抗原的注射途径等来决定。对于同一种抗原， 在一定的剂量范围内，抗原的注射量与免疫反应的强度成 正相关，抗原量过大或过小都易产生免疫耐受。免疫动物 越大一次注射抗原的量也越多，小鼠一次注射的免疫乳液 量为 1-2mL，家兔的为 2-4mL。 常用的抗原注射途径包括静脉、脾脏、淋巴结、腹腔 、肌肉、皮下和皮内等，它们对抗原的收速度为静脉脾 脏淋巴结腹腔肌肉皮下皮内。 腹腔注射、肌肉注射
33、、皮内注射、皮下注射和淋巴结 注射适合于任何抗原，这些途径主要是通过刺激局部淋巴 结发生免疫应答，初次免疫和加强免疫都可以使用。静脉 注射只适合于可溶性抗原和分散的单细胞悬液，且不能使 用佐剂，其诱发的免疫应答主要发生在脾脏。脾脏注射比 较适合于微量抗原。 抗血清的采集、纯化和特性鉴定 。抗体的分离纯化 方法很多，包括中性盐沉淀法、凝胶柱层析、离子交换 柱层析和亲和层析等。 对收获后的抗血清或纯化后抗体的一些参数，例如 效价、亲和力和交叉反应等进行分析非常必要。 效价又称为滴度 （ titer）：在一定条件下，抗血清 经系列稀释后与定量的抗原反应，以能检测出抗血清存 在的抗血清的最大稀释倍数，
34、是表达抗血清中特异性抗 体相对含量的一个指标。 亲和力 （ affinity）：表示抗原抗体结合程度的指标 ，亲和力的大小可以用抗原抗体反应的平衡常数 K来表示 。 抗血清的交叉反应 ：衡量抗体特性的另一个重要的指 标。理论上讲，抗体只能与产生该抗体的抗原发生反应， 这是抗体特异性的表现，但实际上抗体还可以和其他抗原 发生反应，即所谓的交叉反应。一方面是由于抗原的不纯 造成，另一方面不同抗原间相同或类似的抗原决定簇也是 产生交叉反应的原因。 完全没有交叉反应的抗体是不存在的，但是交叉反应 太强的抗体没有应用价值。 （ 2）单克隆抗体（ monoclonal antibody）的制备 制备原理
35、：免疫致敏后的 B淋巴细胞具有分泌特异性 抗体的能力，但是在体外不能长期存活；而骨髓瘤细胞可 以在体外长期存活但不能产生抗体；如将两种细胞杂交融 合后，经分离筛选获得既能在体外长期存活又能针对单一 抗原决定簇产生特异性抗体的融合子，就可以获得单克隆 抗体。单克隆抗体是通过 B淋巴细胞和骨髓瘤细胞杂交获 得，单克隆抗体制备技术又称为 杂交瘤技术 。 单克隆抗体的制备 小鼠骨髓瘤细胞和 B淋巴细胞的准备 。小鼠骨髓瘤细 胞有很多不同的株系，我国最为常用的是 SP2 0和 NS-1 。 细胞的融合和融合者的筛选 。通常骨髓瘤细胞和 B淋 巴细胞是在聚乙二醇（ PEG）的促进下进行融合的，也可 以采用
36、电融合的方式进行融合。 阳性杂交瘤细胞的检出和单克隆化 。采用酶联免疫 吸附法和放射免疫分析法等方法将阳性杂交瘤细胞检测 出来。 单克隆抗体的扩大培养 。生产大量单克隆抗体的方 法目前常用的主要有 小鼠腹水制备 、 大瓶培养 和 中空纤 维反应器培养 ，前者仅适合于实验室制备单克隆抗体， 后两者适用于工厂化生产大量的单克隆抗体。 单克隆抗体的性质的鉴定 ：获得单克隆抗体后，和 多克隆抗体一样，也需对其效价、亲和力和交叉反应（ 特异性）进行分析。另外，还需对免疫球蛋白的类和亚 类以及结合位点等进行分析。 （ 3）生物工程抗体（ biological engineering antibody） 应
37、用生物工程技术对抗体进行定向改造获得的抗体。 抗体的化学修饰 ：运用双功能交联剂将同位素、酶、 毒素和药物等连接在抗体的 Fc片段上，抗体和抗原的特异 性结合发生在抗体的 Fab片段上，交联后并不影响抗体与 抗原的结合，交联（标记）后的抗体可以作为诊断试剂， 也可以作为药物的定向载体，引导药物或毒素到达抗原存 在部位，使药物或毒素发挥更有效的作用，即所谓的 “ 生 物导弹 ” 。这样可以大大减少药物和毒素等在肿瘤等治疗 过程中的毒副作用，提高治疗效果。 抗体基因文库 （ antibody recombination library） ：将不同重链和轻链的基因随机组合，克隆到适合的表达 载体中，
38、在原核细胞中表达不同的抗体，从而形成一个抗 体文库，运用抗原可以从中筛选到相应的抗体基因。 抗体基因的改造 （ antibody gene modification）： 将不同来源的抗体基因进行重组，可以获得所需要的抗体 。 催化性抗体或抗体酶 ：具有催化活性的抗体。 抗体酶和酶一样具有底物和立体专一性，在反应动力 学和竞争抑制等方面也和酶相似。 二、常用的免疫学方法 （一）免疫学方法的分类 抗原抗体的特异性结合可以发生在生物体内也可以发 生在体外，用于食品卫生和安全检测的免疫学方法都是抗 原抗体的体外反应，通常都需要使用含有特异性抗体的血 清，这些方法又称为 血清学反应或血清学方法 。 根据
39、给出的检测结果是定性的还是定量的，免疫学方 法（血清学方法）可以分为 定性免疫学方法 和 定量免疫学 方法 。 定性免疫学方法 ：能给出分析样品中是否含有某种特 定的抗原或抗体，或者特定抗原或抗体的含量是否高于或 低于某一数值。 定量免疫学方法 ：能给出样品中特定的抗原或抗体的 准确数量。 根据免疫分析过程中是否需要将结合在一起的抗原抗 体复合物和没有结合的游离的抗原抗体分离开来，免疫学 方法可以分为 均相免疫学方法 和 非均相免疫学方法 。 均相免疫学方法 ：无须将抗原抗体的复合物和游离的 抗原抗体分开，一般在较短的时间内就可以得到分析结果 ，操作比较简便，但是通常灵敏度较低，一般仅适合于定
40、 性分析。 非均相免疫学方法 ：需要将抗原抗体复合物和游离的 抗原抗体等物质分开，反应时间较长，操作比较复杂，但 是在去除游离抗原抗体的同时也去除了分析样品中的一些 杂质，减少了样品杂质对分析结果的干扰，因此灵敏度和 特异性都比较高，适合于定量分析。 根据免疫反应过程中的现象和特征等，免疫学方法又 包括 凝集反应 和 沉淀反应 等。 凝集反应 ： 颗粒抗原 （例如细菌、血红细胞等）或可 溶性抗原（抗体）结合于不溶性的载体微粒上后与相应的 抗体（抗原）在适当的条件下，经一定时间后凝集成肉眼 可见的 凝聚物 。 沉淀反应 ： 可溶性抗原 （例如蛋白质、多糖、类脂或 它们的复合物）与相应抗体在适量的
41、电解质存在的条件下 发生特异性结合，形成抗原抗体复合物并出现肉眼可见的 沉淀 ，这种可见的沉淀只有在抗原抗体比例适合时才能形 成，在固体（或半固体）载体中这种沉淀表现为沉淀线， 在液体中则常表现为絮状沉淀。 标记免疫学技术 ：指抗原（抗体）被酶、同位素和 荧光素等标记（连接）后与相应的抗体（抗原）反应， 通过测定酶催化反应的产物量、同位素的放射性强度或 荧光素产生的荧光强度来计算抗原抗体的结合量，进而 计算出待检测物质（抗原或抗体）量的方法。 根据标记物的不同，标记免疫学技术可以分为 酶免 疫分析 （ enzyme immunoassay）、 放射免疫分析 （ radioimmunoassay
42、）和 荧光免疫分析 （ fluorescent immunoassay）。 （二）酶免疫分析方法 （ enzyme immunoassay） 与荧光免疫方法和放射免疫方法 （ RIA） 相比，酶免疫 方法 （ EIA） 有很多优点。目前，前面两种方法正逐步被酶 免疫方法所取代。 1.灵敏度 EIA的灵敏度比 RIA的更高，用于 EIA的酶的检测限值可 以达到 0.00210 18 110 18mol/100min,个别报道甚至 可以检测出一个酶分子； 125I及其标志物最低检测限值为 510 18 1010 18mol/100min。 2.对人的危害 EIA中酶标物对人体和环境均无害，使用不受
43、限制； RIA使用的放射性标志物对人和环境均可能造成危害，使 用将可能受到越来越严格的限制。 3.检测仪器 EIA简便，可自动化也可以半自动化，甚至凭肉眼 也可以判读结果； RIA检测仪器价格较贵，难以自动化 ，肉眼一般不能判断结果。 4.试剂的稳定性 在合适的保存温度和介质中，酶标试剂即使在稀释 的溶液中也可以保存一年至数年之久；放射性标志物由 于受到放射性元素半衰期的限制一般保质期较短。 5.多样性 EIA可以用于制备标志物的酶种类很多，酶标物的种 类多。另外，一种酶标物由底物的不同又可以产生多种检 测信号； RIA可用于制备标志物的放射性元素较少，最常 用仅有 125I。 6.反应体系要
44、求 酶标物反应时对 pH值、温度等要求较严格。另外，酶 标物需要和底物反应一段时间后才能判读结果；放射性标 志物对反应体系的要求不高，可以即时判读结果。 三种方法最本质的区别是标记物的不同 ，荧光免疫分 析以 荧光素 为标记物，放射免疫分析以 同位素 为标记物， 酶免疫分析以 酶 为标记物。由于标记物的不同，具体的分 析操作过程也有许多不同。 三种方法的基本的原理相同 ，都是以标记物（荧光素 、同位素或酶）标记抗原或抗体，之后和相应的抗体或抗 原反应，形成带有标记物的抗原抗体复合物，测定复合物 中标记物产生的各种信号，即荧光的强度、放射性强度或 酶催化底物产生的产物量，在一定的范围内信号的强弱
45、反 映了抗原抗体复合物的量，根据信号的强弱可以计算出和 标记抗原抗体结合的待测物（抗体或抗原）的量。 酶免疫方法至少包括 酶标记免疫方法 、 非标记酶免疫 方法 和 酶免疫电镜方法 。酶联免疫吸附方法（ ELISA）是目 前应用得最为普遍的一种酶免疫方法。 2.酶联免疫吸附方法（ ELISA） （ 1）原理 以 96孔、 48孔或 40孔的聚丙乙烯塑料微孔板（酶标板 ）为载体，在适当的条件下使抗原或抗体上包被（吸附） 在酶标板微孔的内壁上成为包被（固相）抗原或抗体，没 有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去。 然后直接加入酶标记抗体或抗原形成酶标记的抗原抗 体复合物固定在微孔或试管，没有吸附
46、的酶标记物洗涤去 除。 加入酶底物溶液（通常没有颜色）于微孔中，复合物 上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的产物。 在一定的条件下，复合物上酶的量（也反应了固定化的抗 原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可 以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和 抗体的含量。 （ 2）分类 直接法 （ direct ELISA） :指酶标抗原或抗体直接与 包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复合 物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在 酶标板上的抗体或抗原的量（ 图 ）。 间接法 （ indirect ELISA） :将酶标记在二抗上，当 抗体（一抗）和包
47、被在酶标板的抗原结合形成复合物后， 再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色 可以反映一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体 的量（ 图 ）。 夹心法 （ sandwich ELISA） :先将未标记的抗体包被 在酶标板上，用于捕获抗原，再用酶标的抗体与之反应形 成抗体抗原酶标抗体复合物；也可以像间接法一样应用 酶标二抗和抗体抗原抗体复合物结合形成抗体抗原 抗体酶标二抗复合物（ 图 ），前者称为直接夹心法， 后 者称为间接夹心法。 竞争法 ：在抗原抗体反应过程中有竞争现象的存在。 例子：直接法中的酶标抗原竞争法 （ 见书 ）。 （ 3） ELISA的操作过程 试剂的准备 ：主要试
48、剂有抗原抗体、酶标抗原或抗体 、酶和底物等。酶标抗原或抗体是 ELISA的核心试剂，这 些试剂可以自己制备也有现成的试剂（例如酶标二抗）， 可以购买。在自己制备酶标物时，除了应准备好纯化的抗 原和抗体外，还应准备好纯化的酶，酶可以自己从动植组 织或微生物中提取，但过程复杂，而且纯度和活性通常很 难保证，最好从试剂公司购买。 酶和抗原或抗体连接方法的基本原理和酶固定化方 法的原理相同，常用的方法包括：以戊二醛为交联剂的 戊二醛法和以过碘酸盐为氧化剂的过碘酸氧化法等。 ELISA中常用的酶包括 辣根过氧化物酶 （ HRP）、 碱 性磷酸酶 （ AP）、 葡萄糖氧化酶 （ GOD）、 -D- 半乳糖
49、 苷酶 （ BG）、 脲酶 （ urease）等，其中 HRP和 AP应用最多 。 HRP的底物很多，在 ELISA中常用是邻苯二胺与双氧水 和 5-氨基水杨酸与双氧水等。 AP常用的底物是对位硝基 酚磷酸酯和酚酞单磷酸酯等。 ELISA的操作过程 ：间接竞争 ELISA测定黄曲霉毒素 B1 （ AFB1）。 抗原的包被 （ antigen coating）。将 AFB1与牛血清蛋 白（ BSA）的连接物 AFB1-BSA（也可以是卵清白蛋白的连接 物 AFBl-OV）溶解于 0.1mol L pH9.5碳酸盐缓冲液中，将 溶液加入酶标板的微孔内，通常每孔加 200L ， 4 放置过 夜，取出恢复至室温，倾去微孔内溶液（包被液），以含 有 0.05%的 Tween-20的 pH7.0的 0.05mol L的磷酸盐缓冲溶 液生理盐水（ PBST）满孔洗涤三次，每次 5min，扣干，即 得到包被有 AFB1-BSA的酶标板。在这个过程中 AFB1-BSA通 过物理吸附包被（黏
