1、第五章 核酸的分离与 检测 一、核酸的分离、提取通则 核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。 分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排 除其他分子污染。 分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、 核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几 个主要步骤。 1. 细 胞裂解 机械作用： 低渗、超声、微波、 冻 融裂解和 颗 粒破碎 等。不适于高分子量 长链 核酸的分离。 化学作用： 一定 p H 和 变 性条件下， 细 胞破裂，蛋白 变 性沉淀，核酸 水相。 变 性条件： 加 热 、表面活性 剂 (SDS、 Triton X-100 、 Tween 20 、 NP-40 等 ) 、 强 离子
2、 剂 (异硫 氰 酸胍、 盐 酸胍等 ) 。 p H 环 境： 强 碱 (NaOH) 或 缓 冲液 ( TE、 STE 等 )。 金属离子螯合 剂 ( EDTA 等 ) 螯合 Mg2+ 、 Ca2+，抑制核酸 酶 活性。 酶 作用： 溶菌 酶 或蛋白 酶 (蛋白 酶 K、植物蛋白 酶 或 链 酶 蛋白 酶 )破裂 细 胞。降解与核酸 结 合的蛋白 质 ，促 进 核酸的分离。 联 合使用 ： 细 胞、待分离核酸 类 型及后 续实验 目。 2. 酶 处 理 裂解液中加入蛋白 酶 （蛋白 酶 K 或 链 酶 蛋白 酶 ） ，降解蛋白 质 ； 灭 活核酸 酶 （ DNase 和 RNase） 加入 D
3、Nase 和 RNase 去除不需要的核酸。 防止核酸的降解和变性 防止 过 酸、 过 碱 对 磷酸二 酯键 的破坏（一般在 pH 4-10下 进 行） ; 避免 剧 烈 搅 拌； 防止核酸 酶 （ DNase , RNase ）的作用。 抑制 DNase： 可加 柠 檬酸 钠 、 EDTA等金属螯合 剂 ；或加去 污 剂 十二 烷 基硫酸 钠 （ SDS）；或加蛋白 变 性 剂 。 抑制 RNase： 实验 器皿高温，或高 压灭 菌，不能高 压灭 菌的用 具用 0.1% 二乙基焦碳酸 盐 （ diethyl pyrocarbonate, DEPC） 处 理。 加 强 的蛋白 变 性 剂 如
4、硫 氰 酸胍 、 异硫 氰 酸胍 等。 加核糖核酸 酶 阻抑蛋白（ RNasin）等 RNase的抑 制 剂 。 质粒 DNA的提取 碱裂解法 溶液 I： 50 mM葡萄糖， 25 ， 10 mM EDTA， pH 8.0 Tris-Cl pH；葡萄糖 大肠杆菌悬浮； EDTA 金属离子螯合剂。 溶液 II： 0.2 N NaOH ， 1% SDSNaOH 碱 裂解细胞，控制时间，温柔混合 ； SDS 结 合 蛋白。 溶液 III： 3 M 醋酸钾 ， 2 M 醋酸 醋酸钾 PDS 沉淀； 醋酸 中和碱。 3. 核酸的分离与 纯 化 高电荷磷酸骨架比蛋白质、多糖、脂肪等其他生 物大分子物质更具
5、亲水性。 根据理化性质差异，选择性沉淀、层析、密度梯 度离心等方法。 酚提取 / 沉淀法 经 典方法是 酚 :氯 仿抽提法 。 裂解 细 胞；离心分离含核酸水相；等体 积 酚 :氯 仿 : 异戊醇 (25 :24 :1 体 积 ) 混合液抽提，漩 涡 振 荡 混匀 (小分子量核酸 ) /颠 倒混匀 (高分子量核酸 ) ，离心分 离；疏水性的蛋白 质 有机相，核酸 上 层 水相。 缓 冲液 饱 和酚 蛋白 变 性； 氯 仿增加有机相比 重，防止酚流入水相；异戊醇可减少操作 过 程中 产 生的气泡，下 层 的界面更清晰 。 核酸 盐经 有机溶 剂 沉淀 浓缩 酚、 氯 仿抽提后用乙醇沉淀 水相加
6、p H5. 0 5. 5， 终浓 度 0. 3M NaAc 或 KAc （ 钠 离子中和核酸磷酸骨架 负电 荷，在酸性 环 境 中促 进 核酸疏水复性），加 2 2. 5 倍体 积 乙醇， 沉淀核酸。 离心收集， 70 % 乙醇漂洗核酸沉淀除 盐 分。 其他可用于沉淀核酸的有机溶 剂 ： 异丙醇、聚乙 二醇 ( PEG) 等； 盐类 ： 10. 0mol/ L 醋酸 铵 、 8. 0mol/ L 的 氯 化 锂 、 氯 化 镁 和低 浓 度的 氯 化 锌 等 。 分离沉淀 DNA 层析法 利用物 质 些理化性 质 差异建立的分离分析方法。 包括吸附 层 析、 亲 和 层 析、离子交 换层 析等
7、。 商品 试剂 盒，分离和 纯 化同步 进 行。 一定离子 环 境下，核酸被 选择 性地吸附到硅土、 硅胶或磁珠等表面与其他生物分子分离。 结 合至 固相 载 体的核酸可用低 盐缓 冲液或水洗脱。 核酸 质 量好、 产 量高、成本低、快速、 简 便、 节 省人力以及易于 实现 自 动 化。 Promega 质粒纯化系统 以磁性颗粒为基础：采用磁性技 术高通量纯化直接用于转染及其 它生物学实验的质粒。 以膜为基础：采用硅化膜纯化柱 ，可用离心法进行纯化。 以树脂为基础：利用树脂，真空 法。 DNA在高盐条件下对硅树脂、膜 的高亲和力。 全自动核酸分离纯化系统 Roche MagNA Pure 9
8、6 MagNA Pure LC 2.0 二、核酸含量的测定 核酸是由磷酸、戊糖、碱基所 组 成的核苷酸 的多聚高分子。三者以等分子数而存在，所以 只要 测 定三者中任何一 处 成分的含量，就可推 算出核酸的含量。常用的核酸 测 定方法有 ： 紫外吸收法 、定磷法、定糖法 RNA的定量 测 定：地衣酚法 DNA的定量 测 定：二苯胺法 紫外吸收法中 DNA或 RNA的定量 A260=1.0相当于 : 50g/ml双 链 DNA 40g/ml单链 DNA（或 RNA） 20g/ml寡核苷酸 分光光度计 Biophotometer Nanophotometer Single and multi wa
9、velength measurement combined with kinetic methods. The full wavelength scan (190 nm - 1100 nm) allows curve interpretation for attainment of more detailed scientific knowledge over whole spectrum. sample size as low as 0.5uL. Thermo Scientific NanoDrop 2000c (March 2, 2009) Thermo Scientific NanoDr
10、op 2000 and 2000c Spectrophotometers. These easy-to-use, UV-Vis instruments enable a 5- second measurement time of DNA, RNA and proteins on a sample size as low as 0.5uL. 核酸纯度鉴定 A260/A280 DNA纯 品 : A260/A280 = 1.8 RNA纯 品 : A260/A280 = 2.0 电 泳 核酸的凝胶电泳 当前核酸研究中最常用的方法，常用于 检测 核酸 的分子量、 纯 度、 结 构 变 化、序列分析等 种
11、 类 ： 琼 脂糖凝胶 电 泳（水平 电 泳） 聚丙 烯酰 胺凝胶 电 泳（垂直 电 泳， 分辨率可达 1bp常用于 测 序） 核酸样品的保存 DNA： DNA样 品溶于 pH8.0的 TE， 4 或 -20 保存； 长 期保存 样 品中可加入 1滴 氯 仿。 RNA： RNA样 品溶于 0.3 mol/L NaAc (pH5.2)或双蒸 灭 菌水中， -70 保存 ; 长 期保存可以沉淀形式 贮 于乙醇中 ; 在 RNA溶液中，加 1滴 0.2 mol/L VRC(氧 钒 核糖 核苷复合物 )冻贮 于 -70 ,可保存数年。 三、核酸的检测 PCR：常 规 PCR、 RT-PCR、 荧 光定
12、量 PCR 杂 交：膜 杂 交（ Southern Blot、 Northen Blot）、 组织样 品原位 杂 交 1.荧 光定量 PCR（ real time PCR） 2019，美国 Applied biosystems公司推出：在 PCR 反 应 体系中加入 荧 光基 团 ，利用 荧 光信号 积 累 实 时监测 整个 PCR进 程。 克服了 终 点 PCR法 进 入平台期或叫 饱 和期后定量 的 较 大 误 差， 实现 DNA/RNA的精确定量。 目前确定 样 品中 DNA(或 cDNA)拷 贝 数最敏感、最 准确的方法。 灵敏度和特异性高、能 实现 多重反 应 、自 动 化程 度高、
13、无 污 染、 实时 和准确。 与常 规 PCR的区 别 常 规 PCR： PCR结 束后 对终 点 产 物 进 行定量分析。 实时 定量 PCR： 实时检测 PCR扩 增，在 扩 增的指数 期 对 起始模板 进 行定量。 两个重要概念 荧 光域 值 （ threshold）： 是在 荧 光 扩 增曲 线 上 人 为设 定的一个 值 ，它可以 设 定在 荧 光信号指数 扩 增 阶 段任意位置上 ，一般 荧 光域 值 的 设 置是 基 线荧 光信号的 标 准偏差的 10 倍。 Ct值 （ Cycles threshold ） ：每个反 应 管内的 荧 光信号到达 设 定的域 值时 所 经历 的循
14、环 数 . Ct值 与模板 DNA的起始拷 贝 数成反比 。 荧 光定量 PCR化学原理 非特异性 荧 光 标记 ： SYBR Green 特异性 荧 光 标记 ： TaqMan SYBR Green I荧 光染料的作用原理 SYBR Green I ： 结 合于双 链 DNA小沟。 PCR 反 应 体系中， SYBR 荧 光染料特异性地 掺 入 DNA 双 链 后， 发 射 荧 光信号，而不 掺 入 链 中的 SYBR 染料分子不会 发 射任何 荧 光信号。 优 点：与所有双 链 DNA 结 合，不必因 为 模板不 同而特 别 定制 通用性；价格相 对较 低；一个 PCR 产 物可以与多分子
15、的染料 结 合，灵敏度很高 。 缺点：能与非特异性双 链 DNA（ 如引物二聚体） 结 合。需要熔解曲 线 分析。 SYBR Green 熔解曲 线 分析 TaqMan探 针 法 TaqMan 探 针 是一种寡核苷酸探 针 ， 设计为 与目 标 序列上游和下游引物 间 的序列配 对 。 荧 光基 团 连 接在探 针 的 5 末端，而淬 灭剂则 在 3 末端。 当探 针 保持完整 时 ， 3端猝 灭 基 团 抑制 5发 射基 团 的 荧 光 发 射。在 PCR的退火期。探 针 模板 发 生 特异性 杂 交。延伸期引物在 Taq酶 作用下延伸， 到达探 针处 ， Taq酶 有 53 外切核酸 酶
16、活性，切 割探 针 ， 荧 光 发 射基 团远 离猝 灭 基 团 ， 荧 光信 释 放。随着 扩 增循 环 数的增加， 荧 光基 团 不断 积 累。即 荧 光 强 度与 扩 增 产 物的数量呈正比关系。 优 点 ：特异性高、重复性好、阴性 结 果确 定、引物 设计 相 对简单 公司网站 缺点：只是用于一个靶基因，成本高。 定量方法 绝对 定量：确定 样 品中某一核酸序列的拷 贝 数。 相 对 定量： 样 品中某一核酸序列相 对 与 对 照 样 本中同一核酸序列的表达。 绝对定量 通 过标 准品定量 绝对 定量的 标 准 样 品：已知拷 贝 数的 质 粒 DNA ，做系列稀 释 。 标 准 样
17、品的种 类 ：含有和待 测样 品相同 扩 增片段 的克隆 质 粒、含有和待 测样 品相同 扩 增片段的 cDNA、 PCR的 产 物 相对定量 通过内标定量 内 标 （ Endogenous Control）通常是 -actin、 GAPDH基因等看家基因 靶基因表达的相 对 量以靶基因相 对 其内 标 的 CT 表示： CT=靶基因 CT-GAPDH CT 不同 样 本靶基因表达的差异以 CT表示，由最高 CT与其他各 CT分 别 相减而得。 靶基因表达的相 对 倍数以 2-CT表示。 阶 段 P311平均 CT GAPDH平均 CT CT CT E14.5 23.650.29 16.490
18、.07 7.160.25 -0.65 E16.5 23.010.49 16.590.25 6.420.24 -1.39 E18.5 24.460.88 18.010.65 6.450.22 -1.36 P5 24.790.62 19.430.14 5.360.48 -2.45 P11 23.500.95 18.920.70 4.570.25 -3.44 P14 24.180.89 19.420.86 4.760.11 -3.25 P30 27.320.60 19.510.25 7.810.28 0 实时 PCR显 示 P311在肺 发 育不同 阶 段的表达 小鼠肺 发 育不同 阶 段 P311
19、 mRNA的表达 Bio-Rad iQ5TM荧 光定量 PCR仪 ABI Prism 7500型 荧 光定量 PCR仪 2.核酸 杂 交 膜 杂 交 Southern Blot DNA Northern Blot RNA Western Blot Protein 组织 切片 杂 交 In situ Hybridization DNA/RNA Immunohistochemistry Protein 主要杂交模式： 膜杂交 原理：核酸 变 性和复性 杂 交在持膜上 进 行 核酸印迹 杂 交 分 类 ： DNA印迹 杂 交（ Southern blot ） RNA印迹 杂 交（ Northern
20、blot ） 核酸杂交的基本过程 制 备样 品 待 检测组织样 品： 动 、植物器官、 组织 ，培养 细 胞， 细 菌，病毒等 核酸：分离提取 DNA（ RNA） 酶 切：限制性内切 酶 消化 DNA 电 泳：凝胶 电 泳分离 酶 切 DNA混合物 DNA变 性： 获 得 单链 DNA 转 膜 ：将核酸 样 品 转 移到支持膜上 (硝酸 纤维 素膜 、 尼 龙 膜 ) 限制性内切 酶 消化 DNA 琼脂糖凝胶电泳 变性、转膜 制备探针 探 针 （ probe） : 互 补 于靶基因 顺 序 的 单链 DNA或 RNA片段，通常 带 有 标记 物如：放射性同位素、 荧 光化合物或半抗 原地高辛等
21、，以 检测 目的基因。 杂 交 杂 交 炉 杂交原理 漂洗、检测 检测结果 Mst 酶切位点 (GCTNAGG) 5 3 正常基因 5 3 突变基因 1.15kb 1.35kb 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 Southern Blot：基因的有无 遗传 病、感染性疾病等 + 0.2kb 1.15kb 1.35kb 正常人 突变携带着 患者 镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 电泳方向 限制性片段 长 度多 态 性 菌落原位 杂 交 筛 选 目地基因 斑点杂交 Northern Blot：基因表达的半定量分析 原位 杂 交 应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探 针与组织、细胞中
22、待检测的核酸进行杂交，再 用与标记物相应的检测系统，通过放射自显影 、组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核 酸原位形成带颜色的杂交信号，在显微镜或电 子显微镜下进行细胞内定位的技术。 1）原位 杂 交的分 类 根据所用探 针 和靶核酸的不同： DNA-DNA杂 交、 DNA-RNA杂 交、 RNA-RNA杂 交 根据探 针 的 标记 物是否直接被 检测 ： 直接法 放射性同位素、 荧 光及某些 酶 标记 探 针 间 接法 半抗原 标记 探 针 ，免疫 组织 化学法 对 半抗原定位 DNA-DNA杂 交 灵敏度 较 低。 主要用于外源性基因 检测 （病毒的 检测 ）。 杂 交 时 需先在高温
23、80-95 短 时处 理，使 DNA 探 针 及 细 胞内靶 DNA变 性，解离成 单链 ，迅速置 于冰上冷却。然后置于 3742 杂 交 过 夜。 宫颈 息肉 HPV DNA探 针 原位 杂 交 人 类 染色体端粒 DNA的 荧 光原位 杂 交 DNA-RNA杂 交 灵敏度高（ cDNA中无内含子、高度 重复序列；无靶基因自身复性） cDNA探 针 制 备 困 难 RNA-RNA杂 交 避免了 应 用双 链 DNA探 针 在 杂 交反 应 中存在的 两条 链 之 间 的复性和第二条 链 的 竞 争性 杂 交 问题 cRNA-RNA杂 交体 较 DNA-DNA、 cDNA-RNA 稳 定，在
24、杂 交后可用 RNA酶 除去未 结 合的探 针 ， 因此特异性更 强 。 灵敏度 较 高 RNA原位 杂 交 检测 和分析的主要 为 内源性基 E18.5lung-VEGF 2） RNA原位核酸 杂 交方法 u DNA-RNA杂 交 u RNA-RNA杂 交 原位杂交技术的基本方法 杂 交前准 备 ：取材、固定、玻片和 组织 切片 处 理 （增 强 探 针 的穿透性、减低背景染色、 RNase等） 杂 交：一定温度下，探 针 与靶 RNA的 结 合 杂 交后 处 理：去除未 杂 交探 针 显 示 ：放射自 显 影和非放射性 标记 的 组织 化学或 免疫 组织 化学反 应显 示 杂 交 结 果
25、取材 新 鲜组织 、 细 胞；尽快冷 冻 或固定 杂 交前所有用具 RNase free 固定 目的：保持细胞形态结构，最大限度地保存细 胞内 RNA水平；使探针易于进入细胞或组织。 最常用多聚甲醛（ 4% ）固定组织，因其不会与 蛋白质产生广泛的交叉连接，不会影响探针穿透 入细胞或组织。 醋酸、酒精的混合液和 Bouins固定剂 包埋、切片 石蜡切片：固定组织用 PBS冲洗后，经梯 度酒精脱水、二甲苯透明和浸蜡包埋切片。 冰冻切片：组织固定后， 30% 蔗糖处理过 夜， OCT包埋、切片， -80 保存备用。 OCT-optimum cutting temperature compound
26、聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶 性混合物 在冰冻切片时支撑组织，以 增加组织的连续性，减少皱 折及碎裂。 漂片时可溶于水，不增加背 景染色。 全自动脱水机（ Tissue Prosessing） 石蜡组织包埋机（ Embedding） 包埋用具 包埋后的组织蜡块 石蜡切片机（ Microtome） 展片机 冰 冻 切片机 （ Cyrostat） 探针的制备 特异性 cDNA探针： 制备困难 cRNA探针： 以 cDNA为模板，体外转录获得，单 链探针， cRNA RNA杂交体稳定； RNase敏感 人工合成寡核苷酸探针 ： DNA合成仪合成，不需 要纯化，组织穿透性极好；长短控制，过长 错配，过短
27、特异性差 探针长度： 500碱基 探针标记方法 末端标记法： 将标记物导入线型 RNA的 5端或 3 端，适用于合成寡核苷酸探针的标记，一般携带 的标记分子较少。 体外转录法： 模板 线性化质粒 DNA/PCR产物 （含 T7、 T3或 SP6启动子）， RNA聚合酶， NTP （一种标记带标记）所有的 RNA就被标记。 末端标记法 碱性磷酸 酶 T4多聚核苷酸激 酶 T4 多核苷酸激 酶 是一种磷酸化 酶 ，可将 ATP 的 g-磷酸基 转 移至 DNA 或 RNA 的 5 末端。 体外转录基因克隆载体 体外转录标记 标记物 同位素 非同位素标记技术有生物素、地高辛、碱 性磷酸酶、辣根过氧化
28、酶和荧光素 直 接标记、间接标记 地高辛标记技术 Digoxigenin （ DIG），源于从洋地黄类植物中提 取的类固醇。洋地黄花和叶片为 Digoxigenin在自 然界中的唯一来源，抗 DIG的抗体不会与其他的 生物物质结合，高特异性。 灵敏度高。 DIG检测灵敏度接近同位素而无放射 性危险、相比荧光则不需要特殊检测设备，相比 生物素则没有样本内源干扰之苦。 地高辛的结构 Structure of Alkali-liable Digoxigenin(DIG)-dUTP AP（碱性磷酸 酶 ） 标记 抗 -DIG抗体 检 测 碱性磷酸酶显色试剂 BCIP/NBT BCIP (5-Bromo
29、-4-chloro-3-indolyl phosphate) 5- 溴 -4-氯 -3-吲哚 基 -磷酸 盐 NBT (四 唑 硝基 蓝 ) 是 碱性磷酸 酶 最佳的底物 组 合之一。 在碱性磷酸 酶 的催化下， BCIP会被水解而 产 生 强 反 应 性的 产 物， 该产 物与 NBT发 生反 应 ，形成 不溶性的深 蓝 色至 蓝 紫色化合物。 相关设备 杂交炉 杂交 脱蜡 ：二甲苯脱蜡 ，逐级梯度酒精 (100% 、 95% 、 90% 、 80% 、 70%) 清洗，蒸馏水洗。 固定 通透 ：蛋白酶（蛋白酶 K/proteinase K，链霉蛋白 酶 /pronase和胃蛋白酶 /pepsin)消化包围靶 RNA的 蛋白质，促进探针渗透，提高杂交信号。过度消 化引起细胞形态结构的破坏、靶核酸的减少、导 致标本从载玻片上的脱落。 再固定 酸 酐处 理：防止探 针 与 组织 中碱性蛋白之 间 的静 电结 合，以降低背景 脱水 预杂 交 ：阻断玻片和 标 本与探 针 的非特异性 结 合减低背景 杂 交：探 针变 性， 过 夜，温度、湿度 洗 涤 ： SSC缓 冲液洗除未 杂 交探 针 显 色：抗体（ anti-dig-ap 碱性磷酸 酶 ）孵 育，底物 显 色；复燃（ 苏 木精、快 绿 ） 脱水、封片
