1、中国药典 2015年版无菌检查法的增修订内容 1、无 菌 是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。 2、无 菌检查法 用于检查药典要求无菌的药品、生物 制品 、医疗器具、 原 料 、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 3、无 菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或无菌器械等进行检验 的过程中，能防止微生物污染与干扰的一种常规操作方法 。 4、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其 干扰的一系列操作方法和有关措施，其中包括无菌环境设施、无菌试验器 材 及 无 菌操作。 5、 无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的规定 ,仅表明了供试品 在该检验条件下未发现
2、微生物污染。也就是无菌试验并不能用于保证整批 产 品 的 无菌性，但是它可用于确定批产品不符合无菌要求。 灭菌产品的无菌保证不能依赖于最终产品的无菌检验，它是作 为确定批无菌产品是否无菌的一个检验项目，而产品的无菌保 证要取决于生产过程中采用合格的灭菌工艺、良好的无菌保证 体系和严格的 GMP管理。 1.理论上的局限性 2.统计概率的局限性 3.检验条件的局限性 主要内容 我国药典无菌检查法的历史发展 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异 中国药典 2015年版通则（ 1101）无菌检查法的增修订内容 2015版 中国药典 无菌检查法 医院制剂进行微生物控制的必要性 修 订时间 修 订 内容 1
3、953年版 直接接种法 无阳性 对 照菌 取样量 2支 /瓶 1963年版 直接接种法 三种培养基培养基 阳性 对 照金葡 1977年版 直接接种法 增加了薄膜过滤法（抗生素）。 阳性 对 照金葡 1985年版 直接接种法 薄膜过滤法限培养基为需、厌气菌培养基及霉菌培养基。 阳性 对 照金葡 1990年版 同 1985年版 1995年版 培养基 灵敏度 检查 藤黄、 生 孢 、白念。阳性 对 照：金葡 10 6 ；生 孢 10 6 ；白念 10 5 1998年 阳性 对 照：金葡 10 6 ；生 孢 10 6 ；白念 10 5 2000年版 实验环境为 100级洁净度。要求全过程防止微生物污染
4、，检验量 6 11支 /瓶； 50 毫升 以上大容量液体采用薄膜过滤法检查。首次收载全封闭无菌测试技术。 阳性 对 照：金 葡、生 孢 、白念均 10 100个菌抑 细 菌和抑真菌 试验 2005年版 增收隔离系统，环境洁净度的验证，培养基适用性检查，稀释液冲洗液品种；规定优 先采用薄膜过滤法；检验方法的验证试验；延长培养时间为 14天、取消复试。 2010年版 在 2005版基础上强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性 我国药典无菌检查法的历史发展 2005年版主要 变 化 10000下局部 100级 ，隔离系 统 ， GB-洁净 度 验证 培养基适用性 检查 方法 验证试验 优 先用封
5、闭 式薄膜 过滤 器 增加稀 释 液冲洗液品种 直接接种法 “ 一 对 一 ” 延 长 培养 时间为 14天 对 表 1 强 调 了 “ 每种培养基最少 检验 数量 ” 取消复 试 2010年版主要 变 化 对 无菌 检查 人 员 提出 专业 要求和培 训 增加了可 选 用其它 经验证 的稀 释 液、冲洗液 方法 验证试验 菌：金、大、枯、生、白、黑 冲洗量：少量（ 约 100ml）多次， 总 量不超 过 1000ml 强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性 我国药典无菌检查法的历史发展 我国药典无菌检查法与欧美药典的差异 比较项目 ChP2010 USP35 EP7.0 检验 条件 规 定
6、 总体 10000级、局部 100级 应在无菌条件下进行。 应在无菌条件下进行。 人员要求 具备微生物专业知识，并经过无 菌技术的培训 经培训和认可 经培训和认可 培养基、培养条 件与时间 硫乙醇酸盐流体培养基 30 35 ； 20 25( 三部） 改良马丁培养基 23 28 均 培养 14天 ， 转种后细菌培养 2天、真菌培 养 3天 硫乙醇酸盐流体培养基 30 35 胰酪大豆胨液体培养基 20 25 培养 不少于 14天 转种后培养不少于 4天 硫乙醇酸盐流体培养基 30 35 胰酪大豆胨液体培养基 20 25 培养 不少于 14天 转种后培养不少于 7天 培养基灵敏度 检 查 与方法 验
7、证 用 菌株 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌； 生 孢 梭菌； 白色念珠菌 、黑曲霉 检验 方法 只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法 性状允许的样品采用薄膜过滤 ，利于抗菌影响去除 采用薄膜过滤，利于抗菌影 响去除 稀 释剂 与薄膜 过 滤 冲洗液 1、 0.1蛋白胨水溶液； 2、 pH7.0氯化钠 -蛋白胨缓冲液 3、其他经验证过的溶液 1 0.1%蛋白胨水溶液； 2 0.1%蛋白胨水溶液 1ml 吐温 80 3动物组织消化液牛肉浸 膏吐温 80 1 0.1蛋白胨水溶液 2 0.1蛋白胨水溶液 0.1 （聚乙氧基乙醇、 0.1吐 温 -80） 3十四烷酸异丙酯。 结 果判断与
8、复 试 规 定 一次检出结果为准 (设备及环境不符合要求、实验过程有可能引起污染的因素、阴性对照有菌生 长、分离微生物可明确归因于无菌实验过程中所用的材料或技术错误造成的。单倍量重试 ) 2015版药典无菌检查法的增、修订内容 1、方法应用范围增加 “生物制品 ”。 2、实验环境的修订。 3、培养基体系的修订。 4、检查方法的整合修订。 5、参照 USP 对表 2、表 3的整合修订。 50100200不作规定不作规定290003520000D级 25501002900035200002900352000C级 555102900352000293520B级 111120 3520203520A级
9、 5指手 套 cfu /手 套 接触碟 /（ f55m m） cfu / 5.0 m 0.5 m 5.0 m 0.5 m 表面微生物沉降 菌（ f90m m） cfu /4h(2) 浮游 菌 cfu/ m3 动态静态 微生物监测的动态标准 (1)悬浮粒子最大允许数 /立方米 洁 净 度 级 别 实验环境的重大修订 动态 2010年版 无菌检查 应在洁净度 10000级背景下的局部 100级单向流空气区域内 或隔离系统进行 2015年版 无菌检查 在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。 无菌检查环境修订 2010年版 1.硫乙醇酸盐流体培养基 30 35 ； 20 25 2.改良马丁
10、培养基 23 28 培养。 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 营养肉汤培养基 6. 营养琼脂培养基 7. 改良马丁琼脂培养基 2015年版 1. 硫乙醇酸盐流体培养基 30 35 ； 20 25 培养 2. 胰酪大豆胨肉汤培养基 20 25 培养。 3. 选择性培养基 4. 0.5%葡萄糖肉汤培养基 5. 胰酪大豆胨琼脂培养基 6. 沙氏葡萄糖肉汤培养基 7. 沙氏葡萄糖琼脂培养基 培养基增修订内容 硫乙醇酸盐流体培养基 厌氧菌检查（首选） 需气菌检查。 胰酪大豆胨液体培养基 真菌和需气菌的检查。 适用范围 培养基灵敏度检查实验菌株的修订 2010年版 硫乙醇酸盐流体培
11、养基 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基 白色念珠菌、黑曲霉 2015年版 硫乙醇酸盐流体培养基 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、 胰酪大豆胨液体培养基 枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉 菌液制备用培养基 2010年版 1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物 至营养肉汤培养基培养基 2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基 3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基 4、接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上 2015年版 1、接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜培养物 至胰酪大豆胨液体培养基
12、 2、接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基 3、接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖肉汤培养基 4、接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂培养基 2010版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于 100 cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌 改良马丁培养基接入小于 100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉。 2015版 硫乙醇酸盐流体培养基接入小于 100CFU的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌 、生孢梭菌各 2管 胰酪大豆胨液体培养基接入小于 100CFU的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、 黑曲霉。 方法适用性试验的修订 ICH Q6B， USP、 EP、 BP、 JP无菌检查法中
13、生物技术产品 /及生物制品检 定规程、标准没有对生物制品作出特殊的规定。 整合中的焦点： 培养温度 三部无菌检查法规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养基必须分成双份，分别 置 30 35 、 20 25 两个温度下培养。以致在取样量、检验量、接种 方式、培养温度、阳性对照试验等方面存在与二部不一致的规定。 修订原则： 以国际发展趋势为主导，遵照 2015年版药典编制大纲的要求 进行，以二部为基础，整合稿保留了生物制品无菌检查法的特点 ，在检验数量、检验量、阳性对照、培养温度方面互相兼顾，作 原则性要求而不作具体细则规定。致力于逐步修订完善。 检验数量的整合 2010版 检验数量 是指一次试验所用供试
14、品最小包装容器的数量。除另有规定外，出 厂产品按表 1规定；上市产品监督检验按表 2、表 3规定。表 1、表 2、表 3中 最少 检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。 一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法，应增加 1/2的最小检验数 量作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加每种培养基中所接种的量作阳性 对照用。 2015版 检验数量是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。除另有规定外， 出厂产品按表 1规定； 上市产品监督检验按表 2规定 表 1、表 2中 最少检验数量不包括阳性对照试验的供试品用量。 检验量的整合 2010版 2015版 检验量： 是指一次试验所用的供试品总量 （
15、 g或 ml）。除另有规定外，每份培 养基接种的供试品量按表 2、表 3规定 。若每支（瓶）供试品的装量按规定 足够接种两份培养基，则应分别接种 硫乙醇酸盐流体培养基和 改良马丁培 养基。 采用薄膜过滤法时，检验量应 不少于直接接种法供试品的总接种量 ，只要供试品特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤。 检验量 是指供试品每个最小包装接种至每份培养 基的最小量（ g或 ml）。 除另有规定外供试品检验按表 3规定。若每 支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两 种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体 培养基 和胰酪大豆胨液体培养基。 采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许 ，应将所有容器内的全部内
16、容物过滤。 检验量的整合 2010版 检验量是指一次试验所用的供试品总量（ g或 ml）。除另有规定外，每份培养基 接种的供试品量按表 2、表 3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两 份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和 改良马丁培养基。 采用薄膜过 滤法时，检验量应不少于直接接种法供试品的总接种量，只要供试品特性允许， 应将所有容器内的全部内容物过滤。 2015版 检验量是指供试品每个最小包装接种至每份培养基的最小量（ g或 ml）。 除另有规定外供试品检验按表 3规定。若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接 种两种培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基 和胰酪大豆胨液体培
17、养基。 采用薄膜过滤法时，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。 参照 USP 对表 1、表 2、表 3整合修订内容 2010版 表 1. 批出厂产品最少检验数量 。 表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量。 表 3. 固体制剂最少检验及上市抽验样品的最少检验数量。 2015版 表 1.批出厂产品及生物制品的原液和半成品最少检验数量。 注 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。 表 2. 上市抽验样品的最少检验数量 （包括液体和固体制剂）。 注 若供试品每个容器内的装量不够接种两种培养基，那么表中的最少检验数量加倍。 抗生素粉针
18、剂（ 5g) 及抗生素原料药的最少检验数量为 6瓶（或支）。 筒装固体原料的最少检验数量为 4个包装。根据具体情况定 表 3. 供试品的最少检验量（包括液体和固体制剂）。 注 如果医疗器械体积过大，培养基用量可在 2000 ml以上，将其完全浸没。 阳性对照试验 按原二部的规定： 供试品用量同供试品无菌检查每份培养基接种的样品量。 阳性对照试验的菌液制备同方法适用性试验，加菌量小 于 100CFU。 阳性对照管培养 48 72小时应生长良好。 阴 性对照试验 阴性对照试验 按原二部的规定： 取相应溶剂和稀释液、冲洗液同法操作，作为阴性对照。 阴性对照不得有菌生长。 薄膜过滤法 2010版 薄膜
19、过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，也可使用一般薄膜过滤器 水溶液供试品 ： 取规定量，直接过滤，或混合至适量含适宜稀释液的无菌容器中 ，混匀，立即过滤。 如供试品具有抑菌作用，须用冲洗液冲洗滤膜，冲洗次数一般不少于三次，所用的 冲洗量、冲洗方法同方法适用性试验。 2015版 薄膜过滤法应采用封闭式薄膜过滤器。 水溶液供试品 ： 增加： 一般样品冲洗后， 1份滤器加入 100ml硫乙醇酸盐流体培养基， 1份滤器加入 100ml 胰酪大豆胨液体培养基。 生物制品样品冲洗后， 2份滤器加入 100ml硫乙醇酸盐流体培养基， 1份滤器加 入 100ml胰酪大豆胨液体培养基。 直接接种法 2010版 直
20、接接种法 取 规 定量供 试 品分 别 等量接种至硫乙醇酸 盐 流体培养基和改良 马 丁培养基中。 2015版 增 订 ： 直接接种法 适用于无法用薄膜 过滤 法 进 行无菌 检查 的供 试 品，即取 规 定量供 试 品等量接种 于硫乙醇酸 盐 流体培养基和胰酪大豆 胨 肉 汤 培养基中除生物制品外，一般 样 品 两种培养基接种的支 /瓶数相等； 生物制品硫乙醇酸 盐 流体培养基和胰酪大豆 胨 液体培养基接种的支 /瓶数 为 2： 1。 培养及观察整合 2010版 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养 14天； 外观上判断不能从有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新
21、鲜培养基 中，细菌培养 2天、真菌培养 3天 2015版 将上述接种供试品后的培养基容器分别按各培养基规定的温度培养 14天； 增订： 接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应分成两等份，一份置 30 35 培养，一份置 20 25 培养。 修订： 不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液适量转种至同种新鲜培养基 中，培养 3天。 结果判断整合 按原二部的规定 2015版无菌检查法增、修订内容说明 1.无菌检查法收载于 中国药典 三部通则中，一部和二部内容一致 2.以 2010年版二部的 “ 无菌检查法 ” 为基础进行整合和修订 3. 保留了生物制品的特点。如检查数量、 硫乙醇酸
22、盐 流体培养基接种份数和培 养温度等。 4.在无菌条件下进行试验，环境必须达到无菌检查的要求。 5.改良 马 丁培养基修 订为 胰酪大豆 胨 液体培养基。 6.方法 验证试验 修 订为 方法适用性 试验 。 7.由于培养基的改 变 ，培养基的灵敏度和方法适用性 试验 也做了修 订 。 8.修 订 了表一、表二、表三的内容。 2010版 金葡、大 肠 、枯草、生 孢 白色、黑曲 2015版 金葡、大肠、生孢 枯草、白色、黑曲 方法适用性试验的菌株 医院制 剂 当前面 临 的形 势 医院制 剂 微生物 检查 重点 个例 医院制 剂进 行微生物控制的必要性 医院制 剂 当前面 临 的形 势 贯彻 国
23、家 药 品安全 “ 十二五 ” 规 划 ，加 强 对 医 疗 机构制 剂监 督管理。 统 一 标 准、提高 标 准，完成 质 量 标 准修 订 工作，保 证 制 剂质 量。 高 风险 制 剂 制定科学、合理的 质 量 标 准和技 术规 范，确保安全、有效和 质 量可控。 淘汰市 场 巳有供 应 或 疗 效不确等不符合国家注册要求的品种。 医院制 剂 微生物 检查 的 现 状 医院制 剂 微生物 检查 的 现 状 领导 班子有待重 视 。 微生物 检验 人 员 缺乏，技 术 力量薄弱。 基本的 仪 器 设备 空缺。 操作不 规 范， 标 准掌握不透。 部分 单 位没有正常开展微生物 检验 工作。
24、 医院制 剂 微生物 检查 重点 妇 科、儿科及 风险 高、 质 量可控不 强 的冲洗 剂 、眼用制 剂 及 用于 烧伤 、 创伤 等需要 进 行无菌 检查严 格的制定 质 量 标 准 。 微生物 检查应对 其方法可行性，可靠性 进 行 验证 （适用性 检 查 ），以保 证检验 方法的科学性， 检验结 果的准确性。 国家 规 定 滴眼液 应进 行无菌 检查 2010 版 中国 药 典 制 剂 通 则规 定眼用制 剂 照无菌 检查 法 检查 ,应 符合 规 定。 国家局（ 2010） 43号文 “ 关于 实 施 中国 药 典 2010年版有关事宜的公告 ” 五、中国 药 典关于眼用制 剂 无菌要
25、求的具体 执 行 时间 将根据 药 品生 产质 量管理 规 范 实 施的要求另行 规 定。 国家局（ 2012） 106号文，眼内注射液，眼内插入 剂 ，供手 术 、 伤 口、角 膜穿透 伤 用的眼用制 剂 以及眼用液体制 剂应 在 2013年 12月 31日前达到新修 订 药 品 GMP要求，其它眼用制 剂应 在 2015年 12月 31号前达到新修 订药 品 GMP要求 。 滴眼液无菌 检查 薄膜 过滤 法 进 行方法适用性 试验 保 证 采用正确的 检验 方法 对 每株 试验 菌逐一 进 行 验证 。 检验 方法 现 行中国 药 典。 培养基与试验菌株同微生物计数方法 检验 方法 滴眼液
26、无菌 检查 薄膜 过滤 法 方法适用性 试验 取 样 量 批 产 量 200支，每种培养基最少 检验 数量 10支，装量 5ml8 ml, 够 接种两 种培养基 ，加上阳性用量共 15支（瓶）全量 过 膜，每膜 5瓶，每菌 5瓶 过 膜，冲洗，每膜 100ml /次， 总 量不超 过 1000 ml 。 最后一次的冲洗液加 100cfu 试验菌，接种相应培养基。 另取同体积培养基罐，加 100cfu试验菌作阳性。 各试验菌同法操作。 分别置规定温度培养 3 5天 分别加 100cfu 各菌 5支 5支5支5支5支 5支 黑白生 枯金大 硫盐 TSB 大 金 生 枯 白 黑 硫盐 TSB 分别加 100cfu 各菌 对照管比较 置规定温度 培养 3 5天 方法适用性 试验 滴眼液薄膜 过滤 法 0冲洗（无抑菌） 试 验 组 对 照 组
