1、第九章 植物种质资源的离体保存 种质：是指亲代通过生殖细胞或体细胞直接传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。 植物种质资源（又称品种资源、遗传资源或基因资源）是生物多样性的重要组成部分，是选育优质、高产、抗病 （虫） 、抗逆新品种的物质基础，是生物技术研究取之不尽的基因来源。 种质资源越多，其多样性越丰富，改良品种或选育新品种的潜力就越大。未来的农业生产在很大程度上取决于对种 质资源的占有量和利用程度，故保持生物多样性有重要意义。 种质保存：是指利用天然或人工创造的适宜环境，借以保存种质资源，使个体中所含有的遗传物质保持其遗传完整 性，并且有强的生活力，能通过繁殖将其遗传特性传递下去。 植物
2、种质资源保存的方式有原生境保存和非原生境保存。 原生境保存是指在原来的生态环境中，就地进行繁殖保存种质，如建立自然保护区或保护小区，甚至保护点等途径 来保护作物及经济林木的野生近缘植物物种； 非原生境保存是指种质保存于该植物原生态生长地以外的地方，包括异地保存（种质圃或植物园保存） 、种质库（种 子）保存、离体（试管）保存等。 原生境保存和异地保存固然有其明显的重要性，但要保存大量种质，则需耗费巨大的人力、物力和土地，在实际中 很难实施，而且易受自然灾害、虫害和病害的侵袭，造成植物种质资源的丧失。以种子的形式保存时，所占的空间较小， 并且能够保存很多年，种子容易干燥、包装，便于运输到引种中心和
3、基因库。 种子保存存在的限制因素：种子生活力随贮存期的延长会逐渐丧失；无性繁殖的植物（如苹果、柑橘、甘薯、 马铃薯等）难于采用种子保存；采用无性繁殖来保持其优良性状的植物（如许多果树） ，用种子繁殖后代会发生变异； 顽拗型种子植物（芒果、椰子、油棕和咖啡等）因其种子不易干燥脱水和低温贮藏，不宜用种子保存或保存难度很大； 有些植物种质是不产生种子的，如脐橙、香蕉等；易遭自然灾害袭击而使种质资源丢失。 种质资源离体保存是指对离体培养的小植株、器官、组织、细胞或原生质体等材料，采用限制、延缓或停止其生长 的处理措施使之保存，在需要时可重新恢复其生长，并再生植株的方法。 离体种质保存有以下优点： 所占
4、空间少，节省人力、物力和土地；有利于国际间的种质交流及濒危物种抢救和快繁； 需要时，可以用离体培养方法很快大量繁殖；避免自然灾害引起的种质丢失。 上世纪 70 年代以来，人们把冷冻生物学和植物离体培养技术结合起来，发展了离体种质资源冷冻保存或超低温保存技术。 第一节 植物种质资源的常温限制生长保存 一、常温限制生长保存的概念 在正常条件下的组织培养不适合种质保存。因为在这种条件下，材料生长很快，需经常进行转接。不仅使保存工作 量加大费用升高，也导致在转接中污染和由取样的随机性造成基因资源的丢失。 因此，理想的保存方法是使培养物处于无生长或缓慢生长状态下抑制植物的生长，减少继代次数，达到长期保存
5、目 的。需要时可以迅速恢复正常生长。抑制生长的外植体可以是茎段、茎尖及愈伤组织。 二、常温限制生长保存的方法和原理 （一）高渗保存法 高渗保存法是指通过提高培养基的渗透压，减少离体培养物从培养基中吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程， 从而减缓生长速度，达到抑制培养物生长的保存方法。 （继代培养间隔时间可延长到 1 年） 方法：1）提高蔗糖浓度：10%左右，就可达到抑制培养物生长的目的。由于蔗糖是组培中最常用的碳源和能源，提 高渗透压的同时又对材料生理代谢产生不利的影响。 2）添加惰性物质：如甘露醇、山梨醇等都是优良的渗透压调节物质，这样可以使其限制离体培养物生长的作 用维持更久。一般用 4%
6、6%甘露醇处理培养基，或用 2%3% 蔗糖加 2%5%的甘露醇混合处理。 3）增加培养基中琼脂的用量来提高渗透压，降低培养物的生长速率。 （二）生长抑制剂保存法 在离体种质保存中使用植物生长抑制剂可以延缓或抑制离体培养物的生长，延长继代时间以达到离体保存种质的目 的。 生长抑制剂保存法是指在培养基中加入生长抑制剂或延缓剂如 ABA、青鲜素、矮壮素（CCC ） 、B9 、多效唑、烯效 唑等。 （三）常温限制生长的其他保存法 1低压保存法 通过降低培养容器内氧分压或改变培养环境的气体状况，能抑制离体培养物细胞的生理活性，延缓衰老，从而达到 离体保存种质的目的。 低压保存方法：降低气压和降低氧分压。
7、 降低气压是通过降低培养物周围的大气压而起作用，其结果是降低了所有气体分压，使培养物的生长速度降低。 降低氧分压是在正常气压下，向培养容器中加进氮气等惰性气体，使其中氧分压降低到较低水平，从而达到抑制生 长的目的。 2饥饿法 即从培养基中减去某种或几种营养元素，或者降低某些营养物质的浓度，或者略微改变培养基成分，使培养植株处 于最小生长阶段。 通过调整培养基的养分水平（l/2MS、l/4MS ） ，可有效地限制细胞生长。如菠萝组培苗在 l/4MS 培养基上保存 1 年， 小苗存活率达到 100%。 第二节 植物种质资源的低温保存 一、低温保存的概念 植物种质资源的低温保存是指用离体培养的方式在
8、非冻结程度的低温下（一般为 19）保存种质的方法。低温保存种 质资源具有方法简单、存活率高的特点。 二、低温保存的原理 在植物的生长条件中，温度是一个重要的因素。植物要生长必需有适宜的温度，温度降低以后，植物的生长速度就会受 到抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔而达到保存种质的目的。 三、低温保存的方法 植物对低温的耐受力不仅取决于基因型，也与它们的起源和生长的生态条件有关。在低温保存植物培养物过程中， 正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。 温带植物保存的最适低温在 06，如马铃薯、苹果、草莓及大多数草本植物。 热带植物保存的最适低温为 1520。如木薯、甘薯。 第三节 植
9、物种质资源的超低温保存 一、种质资源超低温保存概述 植物超低温种质保存是指将植物的离体材料经过一定的方法处理后在超低温（一般是指液氮温度，196）条件下 进行保存的方法。 超低温下保存材料的细胞物质代谢和生长活动几乎完全停止，这不仅能够保持生物材料的遗传稳定性，也不会丧失 其形态发生的潜能（保持其再生能力） ，已成为长期稳定地保存植物种质资源及珍贵实验材料的一个重要方法。 植物离体材料的超低温保存是长期保存种质资源的理想方法。组织培养物的超低温保存可以节约大量的人力、 物力和土地，克服长期继代培养导致的再生能力丧失，也便于国际间种质资源的交流。 二、种质资源超低温保存的原理 在液氮中植物细胞与
10、组织的代谢活动停止、不发生遗传变异；当解冻后，细胞重新恢复生长能力。 三、超低温保存的基本程序 基本程序包括：植物材料（培养物）的选取、材料的预处理、冷冻处理、冷冻贮存、解冻处理、细胞活力和变异评 价、再培养等。其中最重要的环节是冷冻和解冻处理。 （一）超低温保存材料的选取 在超低温离体保存种质中，已经研究或应用过的植物材料或培养物主要有三类：愈伤组织、悬浮细胞、原生质体； 花粉和花粉胚；茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植物。 超低温保存离体种质的实际应用中，需考虑培养物的再生能力、变异性和抗冻性。选择遗传稳定性好、容易再生和 抗冻性强的离体培养物作为保存材料是超低温保存离体种质成功的关键。 茎尖、腋
11、芽原基、胚、幼龄植株等有组织结构的离体材料，是理想的离体保存材料因为其遗传稳定性好，易于 再生，且细胞体积小，液泡小，原生质稠密、含水量较低，细胞质较浓，比含有大液泡的愈伤组织细胞更抗冻。 （二）材料预处理 目的：使材料适应将要遇到的低温，提高自由水含量低的新细胞的生成，避免冷冻过程中细胞内大的冰晶的形成， 提高细胞的成活率和再生能力。 方法：对超低温保存的离体培养物进行加速继代、提高培养基渗透压、加入冷冻防护剂和低温预处理。 预处理时间：一般为 34 周。 1加速继代 加速继代培养以提高新分裂细胞的比例。因为新分裂的细胞小，胞内自由水含量少，在冷冻过程中细胞内不易形成 大冰晶，细胞不易受害。
12、 2提高培养基渗透压 用甘露醇、山梨醇和蔗糖等提高培养基渗透压，以提高培养组织和细胞的渗透压来提高抗寒力。如在含 8%蔗糖的改 良 MS 液体培养基振荡预培养 6d，红豆杉愈伤组织在超低温保存后细胞活力可保持最高。 3添加冷冻防护剂 冷冻防护剂在溶液中能够产生强烈的水合作用，提高溶液的黏滞性，进而保护细胞免遭冻害。用冷冻防护剂对材料 进行预处理可明显提高细胞的存活率和再生能力。 常用的冷冻防护剂：5-8% 二甲基亚砜（DMSO)、甘油、10%脯氨酸。糖类、PEG、乙酰胺、糖醇和福美氧化硫等。 DMSO 是最好的防护剂。 有时常把几种冷冻防护剂混合使用，降低冷冻防护剂的毒性，提高细胞存活率和再生
13、能力。 4低温预处理 低温预处理是将离体培养物置于一定的低温环境中（04） ，使其接受低温锻炼，细胞内可溶性糖及其类似的具有 低温保护功能的物质积累，束缚水/自由水比值增大，原生质的黏度、弹性增大，代谢活动减弱，提高其抗寒能力。 （三）降温冷冻及超低温保存 1传统的降温冷冻方法 传统的超低温冷冻保存方法是通过预培养、冷冻保护剂处理、降温速度和转移温度等关键环节，创造合适的保护性 脱水程度，实现超低温保存种质资源。 从降温方式来看，超低温冷冻保存方法有快速冷冻法、慢速冷冻法、两步冷冻法和逐级冷冻法等几种。 1传统的降温冷冻方法 （1）快速冷冻法：将保存材料从 0或其它预培养温度直接投入液氮中保存
14、。其降温速度在 1000/min 以上。 适于材料：高度脱水的植物材料（如种子、花粉、球茎或块根等） 、经过冬季的低温锻炼抗寒性较强的木本植物的枝条和 芽。 原理：细胞内的水分在降温冷冻过程中，14010是冰晶形成和增长的危险温度区，在140以下，冰晶不再 增长，快速冷冻法就是利用了在液氮中温度骤然降低到最低点（196） ，使细胞内水分迅速通过冰晶生成的危险温度 区，产生的玻璃化状态对细胞结构不产生破坏作用，从而减轻或避免细胞内结冰所造成的危害。 （2）慢速冷冻法：在冷冻保护剂存在下，以 0.110/min 降温速度从 0降到70，接着浸入液氮中进行冷冻保存。 这样可以使细胞内的水分有充足的时
15、间流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减少到最低限度，避免细胞内形成冰晶； 同时又能防止因溶质含量增加引起的“溶液效应”的毒害。 适合材料：大多数植物离体种质的保存，即使是体积较大、液泡大、含水量较高的植物材料，也可以用此法保存得到较 好的保存效果。慢速冷冻法需要配备程序降温器，技术系统昂贵。 （3）两步冷冻法：慢速冷冻和快速冷冻结合起来的一种冰冻方法。在冷冻保护剂存在下，先用慢速冷冻法（降温速度 0.14/min）降到转移温度（一般为7040） ，在此温度下平衡 0.52 h，使细胞达到保护性脱水状态；然后投 入液氮中迅速冷冻。目前，大多采用 0.54/min 的降温速度降到40，然后投入液氮
16、保存。 （4）逐级冷冻法：材料经保护剂在 0预处理后，依次经过10、15、23、40、70等温度处理，在 每级温度上停留一定时间（约 5min） ，然后浸入液氮。 2玻璃化保存法 液体固化方式：形成尖锐的冰晶；进入无定形的非晶体（玻璃化）状态。 玻璃化是指液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。 玻璃化法超低温保存种质资源就是将生物材料经高浓度玻璃化保护剂处理使其快速脱水后直接投入液氮，使生物材 料和玻璃化保护剂发生玻璃化转变，进入玻璃化状态。此间水分子没有发生重排，不形成冰晶，也不产生结构和体积的 变化，因而不会由于细胞内结冰造成机械损伤或溶液效应而伤害组织和细胞，保证快速化冻后细胞仍有活力。
17、 特点：与传统的超低温保存方法相比，玻璃化法操作简单、重演性好，避免了一些种质的冷敏感问题，并且在复杂 的组织和器官的超低温保存方面有较好的应用潜力，因而是一种较理想的超低温保存方法。但由于 PVS（plant vitrification solution）保护剂浓度很高，对材料毒害性极大，因此需严格控制脱水过程及冰冻保护剂的渗透性。 3包埋脱水法超低温保存 包埋脱水法是将包含有样品的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶液，因褐藻酸钙的生成而固化成球状颗粒，然后将包埋后含 有保存材料的藻酸钙小珠在含有高浓度蔗糖的培养基上预培养，使样品获得高的抗冻力和抗脱水力后，结合适当的脱水 和降温方式，最后浸入液氮中保存
18、。 特点：与玻璃化法相比，包埋脱水法采用高浓度的蔗糖预处理样品，对低温保护剂敏感的植物样品有着很大的应用 潜力。包埋脱水法也不需要昂贵、复杂的降温设备，降温过程不甚严格；同时避免了玻璃化中二甲基亚砜等高浓度保护 剂对材料可能造成的损害；样品易于操作，被保存样品体积可以比较大；样品可获得较高的抗冻力，使保存后的样品不 经愈伤组织直接成苗，降低了遗传变异的可能。 4包埋玻璃化法超低温保存 包埋玻璃化法是包埋脱水法与玻璃化法的结合，克服了玻璃化法和包埋脱水法的缺点。 基本操作程序：预培养和包埋玻璃化溶液脱水液氮保存化冻恢复培养。 5其它保存方法 （1）干燥法：干燥法是利用无菌空气流、真空、干燥硅胶饱
19、和溶液表面的气相等对样品进行脱水，然后快速将样品投入 液氮冻存。 （2）预培养法：预培养法是将保存材料在含有冷冻保护剂的培养基上预培养一段时间，以诱导脱水，然后将脱水材料浸 入液氮进行保存。该方法主要用于合子胚和顶端分生组织的保存。 （3）预培养干燥法：此方法是预培养法和干燥法结合的冷冻保存方法。材料先在含冷冻保护剂的培养基上预培养，并 进行干燥，然后浸入液氮保存。有些研究者用高浓度盐溶液和压缩空气流处理，使要保存的材料脱水干燥。 （四）解冻 解冻是将液氮中保存的材料取出，使其融化，以便进一步恢复培养。解冻的速度是解冻技术的关键，可分为快速解 冻和慢速解冻两种方法。超低温冷冻材料解冻时，再次结
20、冰的危险区域是6050。从理论上讲，可借助迅速的解 冻速度通过此温度区，从而避免细胞内次生结冰。 1快速解冻法：快速解冻法是把冷冻的材料取出后，迅速放入 3540（该温度下解冻速度一般为 500700 /min）温水浴中解冻，并小心摇动，待材料中的冰晶完全融化为止。 由于此法融冰的速度快，细胞内的水分来不及再次形成冰晶就已完全融化，因而对细胞的损伤较轻。 2慢速解冻法：把材料置于 0或 23的低温下慢慢融化。少数超低温保存的材料只有采用慢速解冻才能存活， 如木本植物的冬眠芽，因其在慢速冷冻的过程中，经受了一个低温锻炼过程，细胞内的水分已最大限度地渗透到细胞外， 若解冻速度太快，细胞吸水过猛，细
21、胞膜就会受到强烈的渗透冲击而破裂，进而导致材料死亡。 解冻时应注意问题 选择快速解冻还是慢速解冻，不仅与材料的特性有关，也与材料原来冷冻速度有关。一般来说： 冷冻速度超过15/min，解冻时宜采用快速解冻，否则应采用慢速解冻。 液泡小和含水量少的细胞（如茎尖分生组织）可采用快速解冻方式，而对于液泡大和含水量高的细胞，脱水处理 后的干冻材料以及木本植物的冬眠芽则宜用慢速解冻法。 试管中的冰一旦溶解，就应该将试管转移到 20水浴中，并尽快洗涤和再培养，以免造成再伤害。 样品在冻存前如果加入了冷冻保护剂，解冻后一般要洗涤若干次，尽量清除材料表面和组织内部的冷冻保护剂，以 减少其毒害作用。 最常用的洗
22、涤方法是用含 1.2mol/L 蔗糖溶液的培养基洗涤 1020min（25） ，也可用含 1.52.0mol/L 山梨醇的 培养液洗涤。 而有些材料洗涤后反而存活率降低，如对解冻后的玉米细胞重新培养时发现，不清除保护剂比清除的存活率高。 其原因可能是在冲洗时，细胞在冷冻过程中渗漏出来的某些重要活性物质也被冲洗掉了。 （五）再培养 由于冷冻与解冻的伤害，冻后细胞在生理与结构上都不同于未冷冻的细胞，因此适于两种细胞生长的培养基成分是 不同的。 为提高再培养时的存活率，对冷冻保存后的材料重新培养时，需要一些特殊的条件。例如： 为了减少再培养中的光抑制，利于离体材料恢复生长，冻存的材料解冻洗涤后一般先
23、在黑暗或弱光下培养 12 周， 再转入正常光下培养。 再培养所用的培养基一般是与保存前的相同，但有时需将大量元素或琼脂含量减半，有时则在培养基中附加一定 量的 PVP、水解酪蛋白、赤霉素和活性炭等成分以利于恢复生长。 （六）超低温保存后细胞或组织活力检测 超低温保存植物种质资源，其目的是要长期保持植物具有高的活力、存活率以及遗传稳定性，能通过繁殖将其遗传 特性传递下去。因此，对冷冻保存后细胞活力、存活率以及遗传稳定性的检测是非常重要的。 细胞活力的检测一般采用 TTC 还原法、FDA 染色法、伊凡蓝染色法等。由于染色法是根据细胞内某些酶与特定的化 合物反应表现出的颜色变化来测定酶的活性，从而检
24、测细胞的活力，因此，不能全面反映细胞重新生长状况及其保存效 果。细胞的再生长才是最终检验细胞活力的唯一可靠方法。存活率是检测保存效果的最常用的指标。 目前对超低温保存材料的遗传变异情况的检测方法很多: 形态学观察是最简便、最直观的方法； 细胞学则可通过核型分析或原位杂交等来观察染色体数目和结构变异； 同功酶变化判断变异的情况。 分子生物学方法最理想的，如基于 PCR 扩增的 RFLP 和 RAPD 等分子标记技术，越来越多地应用于组织培养中体 细胞无性系变异的检测。 超低温保存的基本程序： 1、植物材料（培养物）的选取（遗传稳定性好、容易再生和抗冻性强的离体培养物作为保存材料） 2、材料的预处
25、理（加速继代、提高培养基渗透压、加入冷冻防护剂和低温预处理） 3、冷冻处理 4、冷冻贮存 5、解冻处理 6、细胞活力和变异评价、再培养等。 小 结 第一节 种质保存的方法 1、种质（germplasm）：指亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代的遗传物质。 植物的各种栽培品种及原始品种，构成了丰富的种质库，对植物育种是个无价之宝，同时保存生物多样性(biodiversity) 对生态平衡、人类的生存和发展有极为重要的意义。 目前，这些植物的存在正受到不断引进的新品种的排挤，遗传资源受到变异及濒临灭绝的危险。 为了保证对栽培植物遗传资源搜集、保存和评价，并能使世界上任何地方的育种家都可能利用，在 1974 年建立了一个 全球性遗传资源中心网，由国际农业研究顾问组织决定建立植物遗传资源国际委员会。负责对全球植物种质资源的保存。 第二节 离体保存种质遗传稳定性的影响因素 遗传稳定性检测：细胞学、遗传学（生化指标、分子标记等） 、形态指标。 影响因素：外植体的类型、培养基的成份、保存方法、保存时间
