1、实验八 色素的分离(层析法) 一、目的要求 1掌握薄层板的制备及薄层层析的操作方法。 2掌握吸附剂活度测定的原理及方法。 3. 掌握偶氮苯和苏丹红（III）的分离方法 二、实验原理 薄层层析是将吸附剂或者支持剂（有时加入固化剂）均匀地铺在一块玻璃上，形成薄 层。把欲分离的样品点在薄层板的一端，然后将点样端浸入适宜的展开剂中, 在密闭的层 析缸中展开，使混合物得以分离的方法。由于层析在薄层上进行故而得名。 薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合 物的分离、提纯及含量的测定，还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。 薄层层析根据作为固定相的支持物不同
2、，分为薄层吸附层析(吸附剂)、薄层分配层析 (纤维素、硅胶、硅藻土)、薄层离子交换层析(离子交换剂)、薄层凝胶层析(分子筛凝胶) 等。薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶（氧化铝的 活化温度为 150160，硅胶的活化温度为 105110）。吸附薄层主要是利用吸附 剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分 离。分配薄层层析在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配，由于 各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。 薄层层析选择展开剂视被分离物的极性及支持剂的性质而定。如果薄层层析所用的支持 剂是吸附
3、剂，在同一吸附剂上，不同化合物的吸附性质有如下规律：1.饱和碳氢化合物不 易被吸附；2.不饱和碳氢化合物易被吸附，分子中双键愈多，则吸附得愈紧密；3.当碳氢 化合物被一个功能基取代后，吸附性增大。吸附性较大的化合物，一般需用极性较大的溶 剂才能推动它。选择展开剂的另一个依据是溶剂的极性大小。极性大的化合物需用极性大 的展开剂，极性小的化合物需用极性小的展开剂。一般情况下，先选用单一展开剂如苯、 氯仿、乙醇等，如发现样品个组分的 Rf值较大，可改用或加入适量极性小的展开剂如石油 醚等。反之，若样品的个 Rf值较小，则可加入适量极性较大的展开剂展开，或在原来的溶 剂中加入一定量极性较大的溶剂进行展
4、层。在实际工作中，常用二种或三种溶剂的混合物 作展开剂，这样更有利于调配展开剂的极性，改善分离效果。通常希望 Rf值在 0.2-0.8 范 围内，最理想的 Rf值是 0.4-0.5 之间。 溶剂极性大小的次序是：石油醚 二硫化碳 四氯化碳 三氯乙烯 苯 二氯甲 烷 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 乙酸甲酯 丙酮 正丙醇 甲醇 水。 三、时间安排 步 骤 所需时间/h 薄层板的制备 1.0 硅胶的活度测定 1.0 薄层板的应用 2.0 合 计 4.0 四、实验材料、试剂与仪器 1. 仪器与设备 载玻片、玻璃片、毛细管、层析缸、滴瓶、喷雾瓶、电吹风、喷雾器、烘箱、干燥器、 直尺。 2. 药品 硅胶 G、羧甲
5、基纤维素钠、展开剂、显色剂等。 五、实验方法与步骤 1.薄层板的制备 （1）硅胶（G）薄层板的制备 【调浆】 取硅胶 G 或硅胶 GF（吸附剂）1 份约 3g，置烧杯中，慢慢加入含 0.5%的羧甲 基纤维素钠水溶液 8ml，调成均匀的膏状. 【涂布】 用滴管吸取此糊状，涂布洁净、干燥的玻璃板上（轻轻振动玻璃板，使薄层 面平整均匀，表面光洁） 【干燥】 室温下在水平位置放置 0.5h，待薄层发白近干。 【活化】 将凉干的薄层板置于烘箱中 105活化 0.5-1 h，冷后贮于干燥器内备用。活 化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只 在空气中自然干燥，不经活化
6、即可贮存备用。 青岛海洋化工厂出售的薄层层析用硅胶在吸附剂名称之后加几个字标明的意思是：硅 胶 G（G 是 Gypsum 石膏的缩写，表示加了石膏）、硅胶 H（H 表示不加石膏）、硅胶 GF254（F254 表示加石膏和波长 254 显绿色荧光的硅酸锌锰）、硅胶 GF365（表示加石 膏和波长 365nm 显黄色荧光的硫化锌镉） 铺板的加水量及活化时间 薄层板类型 吸附剂：水的量 活化温度（） 活化时间（h） 活度 氧化铝 G 氧化铝-淀粉 硅胶 G 硅胶-CMC-Na 硅胶-淀粉 硅藻土 1：2 1：2 1：2 或 1：3 1：2（0.7%CMC-Na 液） 1：2 1：2 250 150
7、105 110 110 105 4 4 0.5 0.5 0.5 0.5 - 2. 吸附剂硅胶的活度测定 一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。欧洲药典 1969 年记载用 0.01 %二甲基黄 （Dimethy-yellow. p-Dimethylaminoazobenzene）、苏丹红（Sudan ）、靛酚蓝 （Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline）的苯溶液各 10 l 点 滴于硅胶 G 或硅胶 H 薄层上，以苯为展开剂，展开 10 cm（约 20 min），三种染料应明显 分离，靛酚蓝斑点接近于起始线，二甲基黄斑点
8、在薄层的当中，苏丹红斑点在靛酚蓝与二 甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。 1.点样 取上述方法制备好的薄层板，在距一端 1cm 处，用铅笔轻轻划一条线作为起始线，将样 品溶液用管口平整的毛细管点于起始线上。点样的要求：点样量适当，样点直径小于 2-3 mm；干后间隔反复点样；多个样点时，间隔为 2 cm 且处于同一条直线上。分别点上苏丹红， 偶氮苯以及混合物 【展开】 在层析缸中加入扩展剂 1cm 厚，加盖平衡 0.5 h。当样点上的溶剂充分挥干 后，将薄层板点样端浸入扩展剂，扩展剂液面应低于点样线。盖好层析缸盖，上行展层。 当展层剂前沿离薄板顶端 2cm 时，停止展层，取出薄板，用铅
9、笔描出溶剂前沿界线，用热 风吹干。 要求：密闭容器可选用层析缸、标本缸、标本筒等；展开方式有上行法、下行法之分， 展开方向有单向、双向、多次展开等。 【显色】 如果化合物本身有颜色，就可直接观察它的斑点。如果本身无色，可先在紫 外灯光下观察有无荧光斑点（有苯环的物质都有），用铅笔在薄层板上划出斑点的位置； 对于在紫外灯光下不显色的，可放在含少量碘蒸气的容器中显色或者用适当的显色剂处理 来检查色点（因为许多化合物都能和碘成黄棕色斑点），显色后，立即用铅笔标出斑点的 位置，以方便计算各个斑点的比移值，从而提供定性与定量的依据。 【比移值的计算与定性、定量】 展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各
10、个成分 的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各成分的相对位置（极性）通常以比移值作 为称量斑点位置的指标。 比移值的符号为 Rf： 注意事项：薄层层析的 Rf值受多种因素影响，即使严格按照实验要求做了，结果的重现性 仍较差。因此，薄层定性时常与标准品一起点样进行对比分析。 六、思考题 3. 薄层板的涂布要求是什么？为什么要这样做？ 4. 点样的要求是什么？为什么要这样做？ 5. 展开前层析缸内空间为什么要用溶剂蒸汽预先进行饱和？ 6. 在一定的操作条件下为什么可利用 Rf值来鉴定化合物？ 7. 在混合物薄层色谱中，如何判定各组分在薄层上的位置？ 8. 展开剂的高度若超过了点样线，对薄层色谱有何影响？
