1、名解 5*2 判断 5*1 选择 10*0.5 填空 40*0.5 问答 5*10 防疫检验检疫技术 第一节 防疫检验的任务与内容 疫：由致病微生物引发的，具有强烈的传染性、病情危重凶险的一类疾病。 特点：其传播能力与病源微生物的种类、传播途径、传播媒介等有关。其既可以只在一个 种属内传播，也可在多个种属间传播。 自然疫源地 natural epidemic focus：自然界中某些野生动物体内长期保存某种传染性病原 体的地区。 常见的人畜共患病：流行性乙型脑炎、禽流感、口蹄疫、链球菌病、炭疽、布鲁氏菌病、 结核病、破伤风、狂犬病、肉毒梭菌中毒病、猪丹毒、李氏杆菌病、钩端螺旋体病、住肉 孢子虫
2、病、血吸虫病、肝片吸虫病、疯牛病等。 人间传染的病原微生物：病毒，160 种；特殊病原体，6 种；细菌、放线菌、衣原体、支原 体、立克次体、螺旋体，155 种；真菌，55 种。 实验室感染原因及其预防：接种、混匀、研磨、移液、开封、离心、注射、搬运等在检验 操作过程中的各个环节都可能产生危险的微生物气溶胶，应采用标准操作方法减少微生物 气溶胶的产生。 接种：无弹性的铂丝。先内焰后外焰 混匀：避免气泡的产生 研磨：先加助研剂。切忌研棒捣击 移液：移液管上端塞上棉花 开封：开封或开启时，减少压力气流的变化 离心：与转速匹配的带塞离心管，底垫完好 注射：针头上加有脱脂棉的小试管 搬运：密封，外表面消
3、毒 微生物检验的质量保证 质量保证是指微生物学实验室所规定的客观而系统的保证检验质量的措施，以便达到和保 持检验工作的最佳水平。 质量控制是保证实验室的检验结果的精确性、可靠性和可重复性的自我控制过程，是质量 保证体系的一个重要方面。 质量控制包括内部和外部两方面。内部质控是指实验室内规定的主要是对培养基、菌种、 试剂、仪器设备等质量监测和评价的措施。对实验室发生的差错或事故以及纠正措施的详 实记录。外部质控是对各实验室间的质量评定，通过国内相关机构的检查，并接受国际检 验质量控制机构的质量检查。 无菌操作：1.防尘源性污染的措施，2.防人源性污染，3.防实验动物和实验材料自身的污染。 微生物
4、学检验的一般程序：1.直接镜检，2.快速诊断和直接药敏试验，3.常规检验，4.报告。 细菌形态学检查方法： 1.不染色检查法（悬滴法： 将特制凹玻片凹窝四周涂少许凡士林。用接种环或尖吸管取 菌液滴加于盖片中部，将凹玻片凹窝对准菌液悬滴扣上，让凡士林贴封四周并迅速翻转。 盖玻片在上，菌液悬于盖玻片下。静置片刻，于高倍镜或油镜下观察；压滴法：将菌液用 接种环或尖吸管滴加于载玻片中央，直接将盖玻片盖压其上，镜下观察，操作时应避开气 泡。压滴法操作简单，不需特制凹玻片，但因液体易干，故观察时间不宜过长。观察烈性 传染病（如霍乱弧菌）时应小心操作，防止液体外溢，造成实验室污染） 2.染色检查法（染色材料
5、准备涂片制备染色；初染媒染脱色复染（革兰氏染色） ； 初染脱色复染（抗酸染色） ；染色时，需要从细菌结构、染液配制、培养条件、药物作 用、电解质含量、菌龄、染色温度及时间等诸多方面进行考虑；常用染料，碱性、酸性、 中性） 3.负染色检查法（背景着色而被观察物不着色的染色检查方法。用于观察活体标本；墨汁 法，背景呈墨褐色，菌体透亮。观察新型隐球菌，高倍镜下可见圆形，厚壁，围绕菌体的 荚膜和芽生现象；刚果红法，背景呈蓝色，活菌无色，死菌可着色；苯胺黑-碱性复红法， 背景黑色，菌体呈红色，荚膜为围绕菌体之亮圈） 。 糖分解产物试验（各种细菌含有发酵不同糖类的酶，分解糖类的能力各不相同，且不同细 菌分
6、解同一种糖的代谢产物也不一定相同。伤寒沙门菌分解葡萄糖产生甲酸等酸性物质； 副伤寒沙门菌在分解葡萄糖时除产生甲酸外，还可产生 CO2 等气体） 。 细菌的酶不一样，对营养物质的分解能力不一样。 糖发酵试验：葡萄糖 HCOOH 脱氢酶 CO2+H2 大肠埃希菌 伤寒沙门菌 葡萄糖 乳 糖 甲基红（methyl red ）实验： 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇（中性） 甲基红 葡萄糖丙酮酸（酸性） 甲基红 VP（Voges-Proskauer）试验： 葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇（）二乙酰红色化合物（） 胍基化合物 葡萄糖丙酮酸 乙酰甲基甲醇（） 蛋白质分解产物试验（细菌对蛋白质的分解一般先由胞外酶将复杂的
7、蛋白质分解为短肽(或 氨基酸)，渗入菌体内，然后再由胞内酶将肽类分解为氨基酸。明胶液化，凝固血清液化及 牛乳胨化等是蛋白质的分解现象。不同细菌分解氨基酸种类也不同。大肠埃希菌、变形杆 菌能分解几乎所有的氨基酸） 。 吲哚（indol）试验： 色氨酸吲哚玫瑰吲哚 吲哚试剂 尿素酶琼脂斜面 碳源利用试验（碳源利用试验是细菌对单一来源的碳源利用的鉴定试验。 常用的试验 有枸橼酸盐利用试验，丙二酸盐利用试验） 。 枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验： 不能利用枸橼酸盐生长（）绿色；能利用（）蓝色。 IMViC 试验： I吲哚（indol）试验；M甲基红（methyl red）试
8、验；ViVP（Voges- Proskauer）试验； C枸橼酸盐利用（citrate utilization）试验。 试验名称 培养基名称 菌种名称 接种方式 吲哚试验 蛋白胨水培养基 液体 甲基红试验 葡萄糖蛋白胨培养基 液体 伏普试验 葡萄糖蛋白胨培养基 液体 柠檬酸盐试验 柠檬酸盐培养基 大肠杆菌和产气肠杆菌 斜面 分离培养： 大肠杆菌 SS 培养基 中国兰培养基 （发酵乳糖菌落、不发酵乳糖菌落） （发酵乳糖菌落、不发酵乳糖菌落） 肠道致病菌 （挑选可疑菌落进行下一步生化反应鉴定） 初步鉴别：双糖铁培养基 （上层固体斜面：乳糖+指示剂；下层半固体：葡萄糖+指示剂+FeSO 4） 结果：
9、碱性（K） ，酸性（A） K/K：不发酵碳水化合物，为不发酵菌特征。 K/A：葡萄糖发酵，乳糖不发酵，如志贺菌。 K/A（黑色）：葡萄糖发酵，乳糖不发酵并产生硫化氢，如沙门菌。 A/A：葡萄糖和乳糖发酵，如大肠埃希菌和克雷伯菌属。 进一步鉴别： 试管吲哚实验 吲哚阳性细菌分解色氨酸生成吲哚，与科瓦克氏试剂反应，产生红色菌落。 大肠埃希菌为吲哚阳性；肺炎克雷伯菌为吲哚阴性（蛋白胨水，24h，37） 。 甲基红试验 肠杆菌科细菌在葡萄糖发酵时 pH 下降的程度不同。只有使 pH 降至 5 左右的细菌能使甲 基红指示剂变成红色。 大肠埃希杆菌阳性；产气肠杆菌阴性（葡萄糖磷酸酯 / 蛋白胨水，24h，
10、37） 。 VP 试验 某些肠杆菌科细菌发酵葡萄糖，产生乙酰甲基原醇，后者被氧化并与 萘酚反应产生红色。 产气肠杆菌阳性，大肠埃希菌阴性（葡萄糖磷酸酯 / 蛋白胨水，48h，37，加入 萘酚 和 KOH，观察 5min 后） 。 破伤风梭菌培养初期纯培养物 ( 18-24h,革兰染色 ) 破伤风梭菌培养中期纯培养物 ( 24-48h,革兰染色 ) 破伤风梭菌培养晚期纯培养物 “鼓槌状” (48h 后,革兰染色 ) 破伤风梭菌感染早期典型表现：苦笑面容；牙关紧闭“锁口风”；角弓反张。 产气荚膜梭菌双层溶血环：外层 毒素是一种卵磷脂酶，能分解卵磷脂，故 毒素 能损伤多种细胞的细胞膜，引起溶血、组织
11、坏死，血管内皮细胞损伤，使血管通透性增高， 造成水肿；内层 毒素有溶血和破坏白血球的作用，胶原酶能分解肌肉和皮下的胶原 组织，使组织崩解，透明质酸酶能分解细胞间质透明质酸，有利于病变扩散。 Nagler 反应：蛋黄琼脂培养基 毒 素 甘油二酯（浑浊圈） 肉毒梭菌：革兰阳性粗短杆菌；无荚膜，周身鞭毛；芽胞呈卵圆形，位于菌体次极端，宽 于菌体，呈“网球拍状”或“汤匙状”。 食物肉毒中毒（食物中毒）：被肉毒毒素污染的食物种类较固定，肉制品(腊肠,罐头) 及发 酵豆/面制品；神经中毒症状为主（抑制乙酰胆碱的释放 ,导致肌肉弛缓性麻痹） ；鼓盖或胀 袋肉或豆制品，勿食用！ 婴儿肉毒中毒：软弱无力。 新生
12、儿破伤风：强制性痉挛。 可美容的剧毒物：肉毒毒素的去皱作用。 第三章 真菌生物学检验基本技术 真菌（Fungus）：具有典型细胞结构（细胞核、细胞器、细胞壁） ； 细胞壁含几丁质和（或）纤维素； 无根、茎、叶，不含叶绿素； 以腐生或寄生方式摄取养料； 能进行有性生殖和（或）无性繁殖。 对人类致病的真菌分为：浅部真菌 ；深部真菌 生物学性状 （一）形态结构 细胞壁为几丁质(Chitin)（多聚 N乙酰葡萄糖组成） ，并含葡聚糖，甘露聚糖及蛋 白质，某些酵母菌还含类脂体。 细胞内有较为典型的核结构和细胞器。 真菌多糖的分布 真菌多糖主要分布于真菌的菌丝、子实体及其发酵液中。在不同的部位含量有所不同
13、，在 真菌的菌丝体的细胞壁和细胞质中存在较多，其他地方较少。真菌多糖主要是在菌丝体细 胞壁和细胞质中提取。 真菌的形态：单细胞真菌（呈圆形或椭圆形。以出芽方式繁殖。主要为酵母菌和类酵母 菌，如隐球菌、念珠菌） ；多细胞真菌（由菌丝和孢子组成。菌丝分枝交织成团，形成菌 丝体（Mycelium） ，并长有各种孢子。通常称之为丝状菌或霉菌（Mold） ） ；二相性真菌 （dimorphic fungus）：孢子与菌丝可随生存环境（营养、温度、氧气等）的变化发生互 变，如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。 营养菌丝（伸入到培养基内）菌丝 气生菌丝 生殖菌丝（露出于培养基表面） 真菌孢子和细菌芽胞的区别：
14、真菌孢子 细菌芽胞 抵抗力 不强。60-70 短时间杀死 强。煮沸短时间不死 数目 一条菌丝可产生多个孢子 一个细菌体只形成一个芽孢 作用 为繁殖方式之一 不是繁殖方式 形成位置 可在细胞内外形成 只在细菌细胞内形成 形状 形态、色泽多样 圆形或椭圆形 （二）培养特性：大多数真菌营养要求不高，常用沙保氏培养基 （SDA）培养； 浅部病原性真菌最适培养温度为 22-28，生长缓慢，多于 1-4 周出现典型菌落； 深部病原性真菌最适培养温度为 37，生长较快，经 3-4 天即长出菌落。 真菌菌落类型： 类型 定义 特征 颜色 举例 酵母型菌 落 为单细胞真菌的菌落，形态与 一般细菌菌落相似，以出芽
15、形 式繁殖 光滑、湿润， 一般为乳 白色 新型隐 珠菌 类酵母型 菌落 外观似酵母菌落，但可见伸入 培养基中的假菌丝，由伸长的 芽生孢子形成 光滑、湿润， 一般为乳 白色 白色念 珠菌 丝状菌落 为多细胞真菌的菌落，由许多 管状、分枝菌丝体组成 绒毛状、絮状、粉 末状、颗粒状、石 膏状。 可产生各 种色素。 毛癣菌 （三）变异性 真菌易发生变异，在人工培养基中多次传代或孵育过久，可出现形态结构、菌落性 状、色素及毒力等改变。 （四）抵抗力 真菌对干燥、阳光、紫外线及一般化学消毒剂有一定的耐受力，但充分暴露于阳， 紫外线及干燥情况下大多数真菌可被杀死，且对 2.5%碘酒，10%福尔马林都敏感，
16、一般可用福尔马林薰蒸被真菌感染的房间。 对热敏感，一般 601 小时可杀死真菌菌丝和孢子。 致病性：1.真菌性感染：主要是外源性感染（浅部真菌侵犯皮肤、指甲及须发等组织，顽 强繁殖，发生机械刺激损害，同时产生酶及酸等代谢产物，引起炎症反应和细胞病变；深 部真菌侵犯皮下，内脏及脑膜等处，引起慢性肉芽肿及坏死） 。 2.条件致病性真菌感染：主要是内源性感染（如白色念珠菌） ，亦有外源性感染 （如曲霉菌） （条件：慢性消耗性疾病。糖尿病、白血病、长期应用化疗、皮质类固醇激素 的患者。免疫力低下，菌群失调） 。 3.过敏性真菌病：由真菌性过敏原（如孢子抗原）引起过敏症，如哮喘，变态反 应性肺泡炎和癣菌
17、疹等。 4.真菌毒素中毒症：侵犯害肝、肾、脑、中枢神经系统及造血组织。如黄曲霉毒 素、某些镰刀菌素和黑葡萄穗素。 免疫性：1非特异性免疫：人类对真菌感染有天然免疫力。皮肤分泌短链脂肪酸和乳酸、 血液中转铁蛋白、中性粒细胞和单核巨噬细胞的吞噬作用，以及正常菌群的拮抗作用。 2特异性免疫：真菌感染中细胞免疫是机体排菌杀菌及复原的关键，T 细胞分泌 的淋巴因子、以 T 细胞为主导的迟发型变态反应引起免疫病理损伤能局限和消灭真菌，以 终止感染。 不染色标本的直接镜检：直接采取标本制片、显微镜下直接观察，若发现真菌菌丝或孢子 存在时，即可初步判定为真菌感染。 1）标本制备： 2）检查方法： 3）封固液：
18、 KOH 溶液：本液适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等） 。 墨汁：主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌等） 。 水合氯醛石炭酸乳酸封固液：此液透明力较强，只限于不透明的标本。 生理盐水：为观察真菌的出芽现象可用生理盐水代替氢氧化钾溶液。 注意事项 采取部位要恰当。深部真菌感染可采取脓汁、痰液、血液、脑脊液等。浅部真菌感 染，应刮取病变部位边缘的痂、鳞屑。发癣应取折断的病发等。 标本应新鲜。特别是深部真菌标本，尽量在取材后立即检查，最长不得超过两小时， 如不能立即送检则必须放入冰箱中保存，尽速送检。 应在用药前采集标本。如已用药则需停一段时间药后再采集标本。 标本的采集量要充
19、足。血液和脑脊液不得少于 5ml，胸腔液不得少于 20ml。活体组 织要采取两份，一份送病理科检查，一份送镜检和培养。 避免污染杂菌。必须进行严格的无菌操作，必要时在培养基内加入抗生素类。 染色标本检查： 革兰氏染色： 各种真菌均为革兰氏阳性，为深蓝色。常用于酵母菌、白色念珠菌、孢子丝菌、诺卡 菌及组织胞浆菌等。 乳酸酚棉蓝染色 糖原染色：菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。 嗜银染色（GMS）：染成黑色。 粘蛋白卡红染色法（MCS ）：主要用于新型隐球菌荚膜的染色。隐球菌荚膜和细胞壁呈 红色，细胞核呈黑色。 荧光染色： 主要使用吖啶橙和氢氧化钾来染直接涂片、培养涂片及组织切片
20、。 培养检查 用于确定菌种，辅助直接检查的不足； 通常用沙保氏培养基(Sabouraud, 含 1蛋白胨、4葡萄糖或麦芽糖、2琼脂) （SDA ）,22-28； 深部真菌可用血琼脂或脑心葡萄糖血琼脂 37培养。 小培养法：小培养法是采用真菌培养板或普通载玻片进行真菌培养。培养物可直接于 显微镜下检查，也可经染色后观察。 免疫学试验 用于检测深部感染真菌的抗体，作为辅助诊断组织胞浆菌、念珠菌、曲霉菌。 防治原则 真菌感染尚无特异预防，主要注意公共卫生和个人卫生； 碘化物治疗孢子丝菌病、毛霉菌病有一定疗效； 制霉素、灰黄霉素、克霉唑（三苯甲霉唑）等外用或内服对癣症和白色念珠菌病等 有较好疗效； 近
21、年报道 5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗单细胞真菌感染疗效显著； 二性霉素 B 可用于深部全身真菌感染。 深部感染真菌 白色念珠菌 培养特性：典型类酵母型菌落，表面光滑，呈灰白色或奶油色，有酵母气味。 致病性和免疫性 机体可产生一定免疫力。 可侵犯人体多处部位，可引起： 皮肤念珠菌病：好发于皮肤皱褶处； 粘膜念珠菌病：鹅口疮、口角炎、阴道炎 最多见。 内脏及中枢神经念珠菌病：肺炎、肠胃炎、 心内膜炎、脑膜炎、脑炎等。 新型隐球菌 本菌能分解尿素，以此与酵母菌和念珠菌鉴别。 糖同化及发酵试验：本菌不发酵各种糖类，但能同化葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、 半乳糖、肌醇，不同化乳糖。 第四章 病毒生物学检验基本技
22、术 病毒（virus） 主要特点 1.体积微小，通过细菌滤器；2.结构简单，无完整细胞结构-对抗生素不敏感，对干扰素敏 感； 3.仅有一种核酸（RNA 或 DNA） ；4.严格的细胞内寄生性，只能在一定种类的活细胞中增 殖。但在细胞外有潜在活性； 5.自身缺乏完整的酶系统，却可通过控制宿主细胞的生物合成来完成其核酸和蛋白的复制。 增殖过程 病毒增殖的方式是自我复制。 一般分为吸附、穿入、脱壳、生物合成及装配与释放 5 个阶段，称为复制周期 （replication cycle） 。 病毒的异常增殖 1.顿挫感染 (abortive infection) 病毒进入宿主细胞后，细胞不能为病毒提供所
23、需要的酶、能量及必要的成分，使病毒 在其中不能合成本身的成分；或虽合成部分或全部病毒成分，但不能装配和释放，称为顿 挫感染。 2.缺陷病毒 (defective virus) 因病毒基因组不完整或基因发生改变而不能进行正常增殖所产生的子代病毒称为缺陷 病毒。 3.干扰现象 (interference) 当两种病毒感染同一细胞时，可发生一种病毒抑制另一种病毒增殖的现象，称为病毒 的干扰现象。 与病毒诱导宿主细胞产生的干扰素（IFN ）有关； 病毒的吸附受到干扰或改变了宿主 细胞代谢途径； 缺陷性干扰颗粒（DIP）所引起的干扰。 干扰素：病毒诱导，细胞生成，具有抗病毒活性、免疫调节、抑制细胞分裂和
24、抗肿瘤等生 物学活性的一个系统 理化因素对病毒的作用 病毒失去感染性称为灭活(inactivation) 1.温度： 耐冷不耐热。感染半衰期-60以秒计，37以分计，20 以时计，4以天计，-70 以月计，-196以年计。 2.电离辐射（X、 射线）： 高剂量可使病毒灭活，低剂量可诱发突变。 3.紫外线：除反转录病毒和埃博拉病毒外，可杀灭多数病毒。但可促进人免疫缺陷病毒 (HIV)在感染细胞系中的表达。 4.超声波：灭活作用不明显。 5.pH：多数病毒的活性在 pH6-8 的范围内稳定。保存病毒，以中性或稍偏碱为宜。而酸、 碱溶液则常作为病毒学实践中的消毒剂。如污染脑炎病毒的塑料制品(聚苯乙烯
25、定板等) ， 就可用 1%-3%盐酸浸泡消毒。应用 2%-3% NaOH 溶液或生石灰碱溶液消毒口蹄疫病毒的 污染环境和用具等等。 6.酶类：蛋白酶，包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和灰色 链丝菌酶等，因能除去有囊膜病毒表面的受体，使病毒粒子丧失吸附细胞的能力；或因破 坏病毒粒子的衣壳蛋白，暴露病毒核酸，遭受核酸酶的作用而灭活。 -不同的接触途 径具有不同的感染力。 7.脂溶剂：乙醚、氯仿、去氧胆酸盐等脂溶剂可使有囊膜病毒（如流感病毒、流行性乙型 脑炎病毒等）的囊膜脂质溶解而灭活病毒，但对无囊膜的病毒（如肠道病毒）几乎无作用。 -耐乙醚试验- 鉴别 8.甲醛和戊二醛：0
26、.05%-0.2%浓度的甲醛可灭活病毒，但保留病毒抗原性、血凝性-常用其 灭活病毒制造疫苗。其它病毒制品如血凝抗原、补体结合抗原、琼扩抗原也常以甲醛灭活 病毒制备。戊二醛对病毒的灭活作用较强。2%碱性戊二醛溶液在 1 分钟内能杀灭所有病毒。 -常用于实验室污染器材如超净工作台、离心机的擦拭消毒。用强化酸性戊二醛( 含 0.25% 乙烯脂肪醇醚)代替常用的 3%-5%石炭酸溶液浸泡污染的吸管、试管等，具有可靠的消毒 效果。 9.烷化剂：氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺、环氧乙烷、环氧丙烷、溴化甲烷、-丙内 酯、乙基乙烯亚胺(EEI)、乙酰乙烯亚胺(AEI) 等，可使病毒的蛋白质和核酸结构改变，功
27、能丧失，从而被灭活。在病毒学中，作用剧烈的烷化剂如环氧乙烷等常用作气体消毒剂。 10.蛋白变性剂：包括石炭酸以及阴离子去垢剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)和去氧胆酸钠等 以及非离子去垢剂，如吐温-20、吐温-80 和 NP-40 等。 石炭酸和 SDS 主要用于病毒核酸 提取。SDS 还有溶解病毒囊膜的作用。 吐温和去氧胆酸钠等去垢剂可破坏病毒的囊膜，但可保存病毒粒子原来的蛋白结构和抗原 性-常用于病毒疫苗和病毒抗原的生产。 去垢剂和脂溶剂结合使用，可有效地灭活有 囊膜病毒-生物制品的病毒灭活。 11.醇类：乙醇和异丙醇是实验室、化验室以及临床处置中常用的皮肤消毒剂，尽管它们对 细菌和其它微生物
28、有较强的杀灭作用，但对病毒的杀灭作用不强，不是病毒学中可靠的消 毒剂。 12.染料的光动力作用：美蓝、台盼蓝、中性红和甲苯胺蓝等染料与病毒接触，并暴露于可 见光时，可迅速灭活病毒。这一作用统称染料的光动力作用。 灭活血液等生物制品中可能污染的病毒。 在蚀斑试验过程中尽量避光，并将细胞培养物放于暗盒内，防止病毒被营养液或覆 盖琼脂层中的中性红或其它染料光动力作用伤害，以保证病毒蚀斑的产生。 13.抗菌素：现有的抗生素对病毒无抑制作用。 待检标本中加抗生素- 抑制细菌、真菌 等微生物，便于病毒的分离。 采集样本时的注意事项 采集时间：越早越好。尽可能在发病的初期，或者在患者住院的当天进行； 采集部
29、位：一般应从感染的部位采取。根据临床症状及流行病学资料； 无菌操作：对本身带有杂菌 (如咽拭子、粪便) 或易受污染的标本，应使用抗生素。 病毒的培养 （一）动物接种 （二）鸡胚接种 （三）组织培养 细胞培养中病毒增殖的确定 包涵体 可在光学显微镜下见到。病毒核酸和病毒蛋白质在细胞内集中合成及装配成病毒粒 子的场所。常可在包涵体内发现病毒粒子或病毒物质。 细胞融合 能够诱发细胞融合的病毒，统称合胞体病毒，但习惯上通常仅指具有合胞作用的 副粘病毒，即呼吸道合胞体病毒。在合胞体病毒的诱发下，不仅同种细胞可以发生融合， 而且异种细胞也能融合。细胞融合现象的发生，不仅决定于病毒的种类，而且与细胞系 （株
30、） 、病毒数量、温度、pH 、离子强度等因素有关。 细胞病变 是特定的病毒与细胞之间相互作用的结果。不仅同一种细胞在感染不同的病毒时 可能呈现完全不同的细胞病变，而且同一种病毒也可能在不同的细胞上引起迥然不同的细 胞病变。虽然营养液成分、培养温度以及病毒感染时细胞的“年龄”和代谢强度等因素会 对细胞病变的产生及其严重程度呈现影响。但是，组织培养细胞内细胞病变的出现，一般 可认为是病毒增殖的确切证据。 免疫学检查 (一)血凝和血凝抑制试验 许多病毒能吸附于一定的哺乳动物和禽类红细胞的表面产生血 凝现象。有的病毒发生血凝要求一定的 pH 值、温度和特定物种的红细胞，这些性质对病 毒鉴定有重要意义。
31、血凝现象还可被相应血凝素抗体所抑制，即为血凝抑制试验，具有型 别鉴定意义。 （二）红细胞吸附试验 有些病毒不引起宿主细胞病变，也不产生血凝素，但产生红细胞 吸附现象（镜下可见成堆的红细胞吸附在细胞表面） 。如副流感病毒，能在猴肾及人胚肾细 胞内繁殖，而不引起明显病变，但能吸附人及豚鼠红细胞。其原因是由于病毒在成熟释放 时，将血凝素插入细胞膜，使受染细胞能吸附红细胞，为病毒的增殖指标。该现象可被相 应的病毒特异性抗体所抑制，称为红细胞吸附抑制试验，可以用来鉴定病毒。 (三)中和试验 将免疫血清与感染培养物感作一定时间后，接触试验宿主，观察敏感指标。 已知病毒或病毒抗原-测知血清内中和抗体的效价；
32、已知抗病毒血清或中和性单克隆抗体 - 进行病毒的鉴定。 动物、鸡胚，死亡率；细胞，细胞病变、血凝素或红细胞吸附能力。 注意对照组的设立。 乳鼠 10 只/组。5+2+3。先给血清，再染病毒。 1、用已知血清鉴定未知病毒 2、用已知病 毒鉴定未知血清 (四)干扰试验和干扰抑制试验 一种病毒感染细胞后，可以干扰以后进入的病毒在该细胞 内的增殖，从而阻抑后者的红细胞凝集作用、红细胞吸附作用、蚀斑数量。此外，这种干 扰现象还可被相应病毒特异性抗血清所抑制，即干扰抑制试验。 用干扰试验和干扰抑制试验可以鉴定一些不引起细胞病变、血凝及红细胞吸附的病毒，如 风疹病毒和鼻病毒。 病毒的纯化 1、沉淀 2、层析
33、 3、两相溶剂间分配系数法 4、红细胞吸附法 5、电泳法 6、 超速离心法、超滤法 脂溶剂（乙醚）敏感试验 乙醚、脱氧胆酸钠、氯仿等脂溶剂可以破坏病毒颗粒的囊膜， 使这类病毒病毒失去感染性；而无囊膜的病毒对该处理有抵抗。 用此法可进一步缩小鉴 定的范围。 耐酸性试验 肠道病毒和鼻病毒皆为小 RNA 病毒。肠道病毒对酸有抵抗，鼻病毒对酸敏 感（pH3.0，2h） 。病毒感染滴度较对照组降低 100 倍为敏感，不到 10 倍为耐酸。 病毒与人类疾病的关系： 1.传染性强，流行广泛。占传染病的 80。2.无有效药物；3.持续感染；4.与肿瘤和自身免 疫性疾病的形成有关。 隐性感染（inapparen
34、t or subclinical infection）非显性感染、亚临床感染。病毒侵入机体 内，不引起临床症状的感染 形成原因：病毒毒力弱、机体防御较强，病毒不能大量增殖，未造成细胞、组织严重损伤； 或最终不能侵入靶细胞。 意义：获得免疫力； 隐性感染者、病毒携带者成为感染源； 显性感染（apparent infection） 病毒感染后，患者出现明显的临床症状。可表现为局部和 全身感染； 急性感染：潜伏期短，发病急，病程短，恢复后病毒被彻底清除，机体获得免疫力。如流 感，甲肝等。 持续性感染（persistent infection）：病毒在体内持续存在几个月,几年,几十年，甚至终身 携带，
35、经常/反复有病毒排除体外，但缺乏持续性的临床表现。 分离病毒的病原学意义 （1）从人体组织、脑脊液、血液、眼部、水泡液分离到任何病毒均可认为具有高度病原学 意义。尿液中检出病毒也具有病原学诊断意义。 （2）从呼吸道、阴道、肠道标本分离病毒的病原学意义需要考虑这些病毒是否有无症状携 带者和长期排毒者。如果同时从同一病人的多个部位分离到同一种病毒，其病原学意义较 大；如果仅从某种标本分离到病毒，病原学意义则较小。 （3）分离培养呈阴性结果时，应考虑细胞的敏感性、是否有细菌或真菌的污染、是否接种 量或病毒含量过低等。 （4）结合恢复期血清滴度与急性期血清滴度之比值判断所分离到的病毒与某一特定疾病的
36、关系。 病毒感染的防治 （一）免疫预防 灭活疫苗：乙脑疫苗，狂犬疫苗；流感灭活疫苗，HAV 等 减毒活疫苗：HAV 疫苗，腮腺炎疫苗，风疹疫苗；脊髓灰质炎疫苗，麻疹疫苗 其他疫苗：基因工程疫苗，核酸疫苗，亚单位疫苗等 人工被动免疫：如，免疫血清，胎盘球蛋白，丙球，转移因子等。 （二）药物防治 抗病毒治疗原则： 抑制病毒复制；增强机体免疫应答能力，促进消灭病毒感染的细胞； 抗病毒药作用机理： 与病毒竞争细胞表面的受体，阻止病毒的吸附；阻碍病毒穿入或脱壳；阻碍病毒生 物合成； 增强宿主抗病能力的物质；中草药具有清热解毒功效，有抗病毒作用；如大青叶、板 蓝根 第五章 免疫血清学检验技术 第一节 凝集
37、与沉淀反应 一、 凝集反应及其特点 凝集反应： 细菌、螺旋体、红细胞或细胞性抗原等颗粒性抗原，或可溶性抗原（或抗体） 与载体颗粒结合成致敏颗粒后，它们与相应抗体（或抗原）发生特异性反应，在适当电解 质存在下，形成肉眼可见的凝集现象。 凝集反应过程：抗原抗体的特异性结合；出现肉眼可见的凝集现象 凝集反应特点：IgM 的作用比 IgG 大数百倍；IgG 与抗原结合后，常不出现凝集现象，称 不完全抗体 临床意义： 进行细菌的抗原分析、鉴定及分型，也可应用已知细菌检查未知血清的抗体。 二、 直接凝集反应 直接凝集反应(direct agglutination)： 颗粒性抗原直接与抗体结合，在电解质的作
38、用下， 出现肉眼可见的凝集现象。 （一）玻片凝集试验 方法评价: 定性试验；简便和快速；敏感度低 临床应用: 菌种鉴定；血清学分型； 血型鉴定 （二）试管凝集试验 方法评价： 半定量试验；简便、快速；敏感度低；可有假阳性 临床应用：肥达氏试验：伤寒副伤寒；外裴二氏试验：斑疹伤寒；Wright test:布鲁菌 病；交叉配血试验 三、 间接凝集反应 间接凝集反应(indirect agglutination)： 将可溶性抗原或抗体吸附于颗粒性载体表面， 然后与相应的抗体或抗原反应，在电解质的作用下，出现肉眼可见的凝集现象。 载体种类： RBC（醛化） ；聚苯乙烯胶乳颗粒（羧化） ； 金黄色葡萄球
39、菌。 （一）间接凝集反应的类型 1、正向间接凝集试验 2、反向间接凝集试验 3、间接凝集抑制试验 4、协同凝集试验 coagglutination test：以金黄色葡萄球菌菌体为反应的载体。人及多种哺 乳动物（猪、兔、豚鼠等）血清中 IgG 抗体的 FC 段与菌体表面的 A 蛋白（SPA）非特异 性结合后，IgG 的两个 Fab 段仍然暴露在菌体表面，保持着结合抗原的活性和特异性。当 与特异性抗原相遇时，能出现特异的凝集现象。 SPA-(Fc)IgG(Fab)-Ab SPA： staphylococcal protein A 六、沉淀反应 precipitation reaction 可溶性
40、抗原( 如细菌、外毒素、血清蛋白等)与相应抗 体特异性结合后，在一定条件(适量的电解质、合适的酸碱度和温度) 下，经一定时间，于 比例合适处形成肉眼可见的沉淀现象。 （一）单向琼脂扩散试验 制成含有适宜抗体浓度的琼脂凝胶板。以适当距离打孔，孔中加入可溶性抗原。抗原 向周围扩散，当抗原与抗体比例适宜时，在琼脂中形成抗原抗体复合物的晶格和沉淀。 沉淀环的直径与抗原浓度呈正相关。 扩散圈出现呈两重沉淀环的双环现象，表明存在但抗原性相同，而扩散率不同的两种 组分。 （二）双向琼脂扩散试验 可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶板的对应孔中，各自向四周扩散， 若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间
41、后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。 （三）对流免疫电泳试验 概念 : 在电场中进行的双向免疫扩散。 原理 : 将抗原加至近阴极孔内，抗体加至近阳极孔内。抗原与抗体在 pH 8.6 的缓冲液中均 带负电荷，通电后，抗原因带负电荷向阳极泳动，而抗体球蛋白等电点高，所带负电荷少， 加之分子量较大，向阳极的位移小于受电渗作用向阴极的位移，形成抗原抗体相向移动。 二者结合，在比例适宜处形成白色沉淀线。 优点 : 快速，只需 1 小时左右；灵敏度提高，约为 10gml。 （四）火箭电泳 Rocket Electrophoresis 又称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的
42、 琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉 淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的 含量。 第二节 放射免疫测定技术 早期的放射免疫技术是基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析(RIA)，稍后又发展了非竞 争性结合的免疫放射分析(IRMA)。该类技术具有灵敏度高、特异性强、重复性好、样品及 试剂用量少、操作简便且易于标准化等优点，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域中 各种微量蛋白质、激素、小分子药物和肿瘤标志物的定量分析。 一、放射免疫分析 1、基本原理： Ab 限量，Ag *定量，Ag *与 Ag 具有等同的与 A
43、b 结合能力，且两者的总量 大于 Ab 结合位点，二者通过竞争方式与 Ab 结合；随着 Ag 增加，Ag *与 Ab 结合形成 Ag*Ab 复合物的放射量降低，二者变化成函数关系。 2、实验方法及测定 二、免疫放射分析 1、基本原理： 以过量 125I 标记抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应, 用固相免疫 吸附剂对 B 或 F 进行分离，其灵敏度和可测范围均优于 RIA 操作也较 RIA 简单。 2、单位点 IRMA 先用 过量标记抗体 与待测抗原进行反应，形成抗原抗体复合物；用 固 相抗原 结合游离的标记抗体并将其分离, 测定 上清液 的放射量 。 3、双位点 IRMA 先用 固相抗体
44、与抗原结合，再用 过量的标记抗体 与抗原的另一决定簇 结合，形成 固相抗体 -抗原 -标记抗体 复合物，洗弃剩余标记抗体，测固相上放射性。 第三节 荧光免疫技术 （一）荧光免疫分析的基本原理 将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检 测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测 定。 （四）荧光酶免疫测定 酶标记抗体或抗原，与固相载体包被的抗原或抗体特异性结合。 洗去游离的酶标物。加入底物，经酶分解后生成荧光产物。 1、双抗体夹心法 固相抗体和酶标记抗体与待检抗原反应，形成固相抗体-抗原- 酶标抗体 复合物，加入底物进行酶促发光反应，发光量与待检抗原含
45、量成正比。 2、双抗原夹心法 固相抗原和酶标抗原与待检抗体反应，形成固相抗原-待检抗体- 酶标抗 原复合物，加入底物进行酶促发光，发光量与待检抗体含量成正比。 3、固相抗原竞争法 待检抗原和固相抗原竞争结合定量的酶标抗体，洗涤除去未结合部分， 固相抗原与酶标抗体形成的复合物被留下来，加入底物进行酶促发光反应，荧光强度与待 检抗原含量成反比 4、细胞表面抗原和受体检测 荧光免疫技术可用于淋巴细胞表面 CD 抗原、抗原受体、补 体受体、Fc 受体等的检测以及淋巴细胞及其亚群的鉴定和计数。 第四节 酶免疫测定 一、基本原理 酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应；酶对底物的显色反应； 对抗原或抗
46、体进行定位、定性或定量的测定分析 （一）常用的酶及其底物 1、辣根过氧化物酶（HRP） 多用于 ELISA 方法。四甲基联苯胺 TMB。反应后显蓝色， 加酸终止反应后变为黄色,测定波长 450nm，稳定，无致癌性。 2、碱性磷酸酶（AP） 对-硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 。经酶作用后的产物为黄色对硝基酚， 最大吸收峰波长为 405 nm。 3、 - 半乳糖苷酶（-Gal） 多用于均相酶免疫测定。 4MUG。经酶作用后生成高强 度荧光物，用荧光计测量。 （二）固相载体及其处理 1、常用的固相载体 塑料制品、微颗粒、膜载体。 通过固相载体可以方便的将非均相酶免技术中游离的和结合的抗体（或抗原）酶
47、标记物迅 速分离。 2、固相载体的处理 包被（coating）：将抗原或抗体结合于固相载体。 封闭（blocking）：用 1%-5%的牛 血清白蛋白或 5%-20%小牛血清消除固相载体表面未结合的位点，消除非特异性吸附。 （三）酶免疫测定的应用 均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。非均相免疫测定中的 ELISA 应用 更为广泛。常用于传染病的诊断：病毒性肝炎（甲肝抗体、 “乙肝三对” 、丙肝抗体、戊肝 抗体） 、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒；结核杆菌、幽门螺杆菌。也用于一些蛋白质的检 测：各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原） 。 二、均相酶免疫测
48、定 酶标记物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变， 不用分离结合和游离酶标记物，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。 常用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定 。 1、酶放大免疫测定技术 EMIT enzyme-mutiplied immunoassay technique 2、克隆酶供体免疫分析 CEDIA cloned enzyme donor immunoassay 三、酶联免疫吸附试验 Enzyme-linked immunosorbent assay （一）基本过程及试剂 1、包被：固相的抗原或抗体 2、反应：加入待测抗体或抗原和酶标抗原或抗体。酶标记物
49、（酶结合物） 3、洗涤：使结合在固相上的抗原抗体复合物与未结合的分离 4、底物显色：定性或定量的 分析。酶反应的底物 （二）ELISA 检测抗原的方法 1、双抗体夹心法 方法：用已知抗体包被，加入待检血清，再加酶标抗体，加底物显色 应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白、HCG 等 2、竞争法 方法：用已知抗体包被，加入待测血清，再加酶标抗原，酶标抗原与待检物竞争与包 被物结合。加底物显色。 应用：用于只有一个抗原决定簇的小分子半抗原（药物、激素等） （三）ELISA 检测抗体的方法 1、间接法 方法：用已知抗原包被，加入待测血清，再加酶标的抗人 IgG（抗抗体或二抗）加底 物显色。 优点：一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应
