1、第二章 DNA重组,2.1 DNA的组成和结构（略）,2.2 天然DNA的制备,2.2.1 天然DNA的来源和用途,2.2.2 天然DNA的提取,准备生物材料,裂解细胞,分离和抽提DNA,1、准备生物材料选择生物种类；选择DNA易提取和含量高的组织；选择DNA得率最高的生长期。如:大肠杆菌质粒DNA：应在对数生长期后期。植物DNA：选幼嫩植株或黄化幼苗。肝脏DNA：要清除胆囊。2、裂解细胞这步是关系到能否提取到DNA以及DNA得率高低和质量的关键步骤。原核细胞：用溶菌酶， NaOH和SDS ，煮沸，冰冻，超声波等方法；结构复杂的动、植物材料：先必须粉碎（液氮冻结后研磨，或捣碎机、研钵直接粉碎）
2、，再参照裂解原核的方法。,3 、分离和抽提DNA提取总DNA：在裂解液中加适量酚氯仿异戊醇或氯仿异戊醇等有机溶液，使DNA与蛋白质分开，用乙醇或异丙醇沉淀DNA，再离心。 提取叶绿体或线粒体等细胞器DNA以及病毒和噬菌体的DNA：须先从裂解液中分离完整细胞器、病毒和噬菌体，抽提前必须经DNase处理，水解附着于其表面的其它DNA。提取质粒DNA：调节裂解液pH12.6，所有DNA都变性沉淀，再调节PH至中性，质粒DNA复性后从沉淀物中释出。 除RNA：用RNase水解除RNA，分离抽提DNA最有效的方法：氯化铯梯度离心（氯化铯溶液中加适量溴化乙锭，紫外灯下DNA带和RNA带都发荧光，但沉降系数
3、明显不同而聚集于不同的氯化铯密度区）,2.2.2.1 大肠杆菌源质粒DNA的提取碱裂解法*：原理：细菌悬浮液暴露在高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，相互缠绕成大型复合物，被SDS包盖，当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心去除后，就可从上清中回收质粒DNA。,实验步骤挑取一些独立的转化菌落进行小规模培养，用无菌牙签或挑种环挑取单菌落于20ml含有相应抗生素的LB液体培养基中，于37剧烈振摇下培养过夜。将1.2ml培养物倒入微量离心管中，于4以5000g离心5min（两次）。吸取并弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。将细菌沉淀重悬于100l
4、 溶液中，剧烈振荡。加200l 溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。确保离心管的整个表面均与溶液接触。不要振荡！将离心管放置与冰上5min。,加150l溶液，盖紧管口，将管倒置，温和振荡20s，使溶液 在黏稠的细菌裂解液中分散均匀，之后将管置于冰上5min。4离心12000g，5min，上清转移至另一离心管中。加等体积酚-氯仿-异戊醇（25:24:1），振荡混匀。4离心12000g，5min，上清转移至另一离心管中。用2倍体积无水乙醇于室温沉淀质粒DNA，振荡混匀，于室温放置2min。4离心12000g，5min。小心吸去上清夜，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附
5、于管壁的液滴除尽。用1ml70乙醇溶液洗涤沉淀，4离心12000，5min，弃去上清，在空气中使核酸沉淀干燥。用50l含无DNA酶的胰RNA酶（20lg/ml）的TE重新溶解核酸，振荡，贮存于-20。,试剂： （1）溶液：50mmol/l 葡萄糖 25mmol/l Tris-HCl（pH8.0） 10mmol/l EDTA-Na2 （pH8.0） 5mg/ml 溶菌酶（临用时加） （2）溶液（新鲜配制）： 200mmol/l NaOH 1% （W/V） SDS （3）溶液（100ml）： 5mol/lKAc 60ml 冰乙酸 11.5ml （pH4.8） ddH2O 28.5ml,2.2.2.
6、2 噬菌体DNA的提取溶源周期 溶菌周期提取DNA的原理：先将溶源菌培养至一定密度，通过热诱导，使DNA从宿主染色体DNA上释放出来，再经过溶菌周期培养，获得大量噬菌体，从中提取线形的DNA。提取过程：溶源菌诱导培养分离噬菌体DNA的提取,2.2.2.3 氯化铯法制备植物基因组DNA材料准备细胞裂解DNA分离抽取,2.2.3 DNA的纯化2.2.3.1 氯化铯溴化乙锭连续梯度离心法2.2.3.2 离子交换层析法用三烃甲基氯化铵层析树脂纯化DNA用羟基磷灰石纯化DNA2.2.3.3 琼脂糖凝胶电泳洗脱法2.2.3.4 “基因纯”试剂纯化2.2.3.5 从DNA样品中去掉EB正丁醇（或异戊醇）抽提
7、法Dowex树脂层析法,2.2.4 DNA的浓缩乙醇沉淀法含一价阳离子的DNA溶液2体积无水乙醇沉淀DNA离心溶于适量TE缓冲液或无菌水。条件：-20，30 min以上；小于1kb或量较少时，于 - 70沉淀，或延长时间。正丁醇抽提法DNA溶液 1体积正丁醇混匀离心（1600 r/min 1min）弃上清重复至所需体积用水饱和乙醚抽提DNA溶液两次（除正丁醇）空气中蒸发乙醚。聚乙二醇浓缩法DNA溶液透析袋置高浓聚乙二醇溶液 4浓缩至所需体积。,2.3 限制性核酸内切酶和DNA片段化,2.3.1 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）定义是一类能识别双链DNA中特殊
8、的核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。类型型限制酶型限制酶型限制酶,（1）型限制酶（无用）分子量：30万dal左右组成：3种亚基特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。修饰亚基：具甲基化酶活性。限制亚基：具核酸内切酶活性。辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM。识别和切割位点：不一致（距识别位点5一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。,（2）型限制酶（十分有用）分子量：2万10万dal（较小）组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。识别和切割位点：相一致。（3）型限制酶（无用）组成：两个亚基M亚基：负责位点的识别与修饰。R亚基：具
9、核酸酶的活性。辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子）。,限制酶的命名,型限制酶的特性 1、不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列；,6个（大多数）：如EcoR 5-GAATTC-3,识别序列,6个：如Not 5-GCGGCCGC-3（8个）,有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶内。 如：Sau3A识别 ： GATC BamH识别 ： GGATCC,有的限制酶识别多种核苷酸序列。 如：Hind识别 4种核苷酸序列： 5-CTPyPuAC-3 （Py嘧啶碱基C或T；Pu 嘌呤碱基A或G ）,2、各种限制酶的识别序列一般都具有回文结
10、构；,类限制酶识别序列特点 回文结构(palindrome),GGATCCCCTAGG,5,3,5,3,限制酶：BamH ,正读与反读都相同。以识别序列的中线为对称轴，左右两侧的碱基互补。为便于书写，识别序列可以以5 3走向的单链DNA表示。,3、各种限制酶的切割类型是各式各样的，切割后形成各种粘性末端或平整末端； （1）粘性末端和平整末端,(a)5P单链延伸的粘性末端,(b)3OH单链延伸的粘性末端,粘性末端（粘端）,G AATTCCTTAA G,GAATTC,CTTAAG,如：Eco R,5,3,5,3,5,3,5,3,CTGCA GG ACGTC,5,3,5,3,5,3,5,3,平头末端
11、（平端）,CCC GGGGGG CCC,5,3,5,3,5,3,5,3,（2）两种特殊的限制酶：同尾酶和同裂酶,同尾酶（isocaudamer） 有些限制性内切酶虽然来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，这一类限制酶特称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端。,Bam H,Bgl,+,+,同裂酶（isoschizomer） 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶特称为同裂酶。同裂酶的切点位置可相同或不同。,+,Bam H,+,Bst,（a）切点位置相同,（b）切点位置不相同,4、某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发
12、生改变。限制酶的第二活性：在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子、酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变时，会导致限制酶的识别序列特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称为限制酶的第二活性，又称星活性。能产生第二活性的酶常在酶名称的右上角加一星号“”，如EcoR 。,2.3.5 限制性核酸内切酶反应系统反应系统包括：酶、底物、反应缓冲液、合适的反应温度等。2.3.5.1 底物DNA 限制酶的催化效率与DNA样品纯度、DNA分子构型、识别序列两侧序列长短以及序列碱基甲基化等密切相关。DNA纯度；DNA分子构型；识别序列侧面的序列；位点偏爱；DNA甲基化。,2.3.5.2 限制性核
13、酸内切酶用量主要取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品1酶活性单位（U）：某种限制性核酸内切酶在最适反应条件下，60 min内完全切割 1g DNA所需的酶活性。酶活性高的用量少，反之则多。能被高效切割的DNA样品用酶量少，反之则多。等量的两种DNA样品，限制酶识别序列密度大的用酶量多，反之则少。,2.3.5.3 限制性核酸内切酶反应缓冲液包含：氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇(DTT)或-巯基乙醇(2-Me)、Tris-HCI或Tris-Ac。,2.3.5.4 限制性核酸内切酶反应温度大多数的最适反应温度是37，而少数酶的最适反应温度高于或低于37。,2.3.6 限制性核酸内切酶的
14、Star活性（见前）几乎所有的限制酶都具有Star活性。Star活性的影响：导致切割中出现非特异性DNA片段，甚至不能获得预计的DNA片段，影响进一步的DNA连接重组。排除方法：如降低反应系统中甘油含量，控制pH中性和高盐浓度下进行反应。,2.3.7 DNA分子片段化天然DNA或化学合成的DNA常需酶切成可连接重组的DNA片段，即DNA分子的片段化。常用的切割方法有单酶切、双酶切和部分酶切等方法。单酶切法：用一种限制性内切酶切割DNA样品。最常用。双酶切法：用两种不同的限制酶切割同一种DNA分子。部分酶切：指选用的限制性核酸内切酶对其在DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。,2.3.8
15、DNA分子的限制性图谱,2.4 特异性DNA片段的PCR扩增,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）即PCR技术，由美国科学家Mullis于1983年发明，又称基因的体外扩增法。也有人称无细胞分子克隆法。PCR技术的用途目的基因的扩增与分离；医疗诊断；基因突变与检测；分子进化研究；环境检测；法医鉴定。,1 PCR的基本原理,一、基本原理,Tm=4(G+C)+2(A+T),9095301,3760301,7075302,二、“长产物片段”和“短产物片段”“短产物片段”是严格地限定在两个引物链5端之间的，正是需要扩增的特定片段；“长产物片段”则带有不需要的“尾巴”。“
16、短产物片段”是按指数倍数增加的；而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计。,三、平台效应在PCR反应中，当引物模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶催化的反应趋于饱和，会出现“平台效应”，即PCR反应产物不再增加。平台效应出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。,2 PCR反应条件的优化,一、标准PCR反应流程（一）反应体系标准PCR反应体系为50100l ，其中包含：1PCR反应缓冲液4种dNTP：各200M两种引物：各0.25MDNA模板：0.1gTaq DNA聚合酶：2U（二）反应步骤,二、PCR反应条件的优化特异性
17、、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR反应的主要影响因素有：（一）循环参数（反应温度与时间）变性退火延伸循环次数,（二）PCR反应成分Taq DNA聚合酶引物dNTP缓冲液模板其它因素高温启动添加剂,3 引物的设计,一、设计原则PCR扩增引物：是指与待扩增DNA区域两端序列互补的人工合成的寡核苷酸短片段，其长度通常在1530个核苷酸之间。它包括引物1和引物2。引物1：又称Watson引物，是5端与正义链互补的寡核苷酸，用于扩增编码链或mRNA链。引物2：又称Crick引物，是3端与反义链互补的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链或反密码链。引物设计的基本原则是最大限度地提高扩增效率和
18、特异性，同时尽可能抑制非特异性扩增。具体的设计原则见书P57。,二、引物长度引物太短可能同非靶序列杂交，得出非预期的扩增产物。引物过长引物同模板DNA的杂交速率下降，结果在反应循环周期内无法完成同模板DNA的完全杂交，从而减低PCR反应的效率。,三、引物的5端修饰法5端附加核酸序列功能基团修饰法放射性核素（修饰三磷酸）非放射性分子（修饰碱基）,4 耐热DNA聚合酶,一、Taq DNA聚合酶热稳定性无3 5外切酶活性反转录活性非模板依赖的聚合活性影响酶活性的因素,二、其它耐热DNA聚合酶（见书P56）Pwo DNA聚合酶Tth DNA聚合酶C. therm.聚合酶vent DNA聚合酶*Pfu
19、DNA聚合酶*,2.5 DNA片段的化学合成,2.5.1 寡核苷酸片段的化学合成的方法磷酸二脂法磷酸三脂法固相亚磷酸三脂法（常用）,2.5.2 化学方法合成的DNA片段 化学方法可合成DNA互补链的引物、寡核苷酸连杆以及基因片段和元件等。合成DNA互补链的引物除PCR引物外，还有测序引物。见下表。,DNA寡核苷酸连杆（linker）linker：是指用化学方法合成的一段由1020个核苷酸组成，具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸片段。linker经限制酶切割后可产生一定的粘末端，可与另一有相同粘末端的DNA片段连接。（附图）化学合成的寡核苷酸中，有的含有一个反向重复序列而形成一个
20、双链发夹结构。在双链部分有一种限制性核酸内切酶的识别序列，切割后产生一定的粘末端或平末端。这种寡核苷酸可兼作连杆和引物，即测序引物连杆。由几十至上百个核苷酸组成，有多种限制酶的识别序列，可作为连杆且被组装在克隆载体上成为多克隆位点（MCS）。这种连杆即多克隆位点寡核苷酸连杆或简称MCS连杆。 （附图）,衔接头（adaptor）adaptor：它是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。（附图）DNA芯片DNA芯片：是DNA片段以预先设计的排列方式固定在载玻片或尼龙膜上组成的密集分子排列。,2.6 DNA片段大小的凝胶电泳检测,方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙
21、烯酰胺凝胶电泳、琼脂糖-聚丙烯酰胺凝胶电泳和脉冲场凝胶电泳等方法。条件：中性或偏碱性的缓冲系统，DNA带负电。运动方向：DNA经过凝胶分子筛移向正极。迁移率影响因素：DNA分子的大小和构型，与DNA碱基组成和顺序无关。检测：溴化乙锭染色，紫外光下发红色荧光。,2.6.1 琼脂糖凝胶电泳参数凝胶缓冲液和电泳缓冲液常用：TAE、TBE、TPE凝胶中琼脂糖含量检测大片段DNA的含量小，反之则大。加DNA样品一般1g以下，多了会使大小接近的DNA带不易分开，少了会影响小片段DNA带的检测。电泳条件注意：靠加样孔一侧为负极。电压：110V/cm（依据分辨力要求、DNA片段大小和电泳时间决定）溴化乙锭（E
22、B）染色和紫外观察注意：溴化乙锭是很强的诱变剂，操作时应带手套！溴化乙锭溶液必须经处理后才能废弃。,2.6.2 DNA片段（分子）大小的估算将待测DNA片段直接与Marker比较；通过Marker的相对迁移距离，推测出待测DNA片段的大小。,M CK 1 2 3 4 5 6,bp20001000750500250100,2.6.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳参数制胶的电泳缓冲液： 90nM Tris-硼酸缓冲液凝胶丙烯酰胺含量：按表2-24进行加DNA样品：加样孔一端为上方。上下电泳槽加入电泳缓冲液，凝胶要完全接触电泳缓冲液，接触处不得有气泡。电泳条件：缓冲液槽在上方为负极，下方为正极，电压5V
23、/cm，室温。EB染色和DNA片段大小估算（同琼脂糖凝胶电泳）,2.6.4 脉冲场凝胶电泳（CHFE）参数缓冲液： TBE或0.5TBE，蠕动泵驱动循环。凝胶：用0.5%TBE制备的琼脂糖凝胶按图2-16装入电泳槽，加入电极缓冲液，超过凝胶23。加入DNA样品电泳条件：交替改变的电场力，由编程转换装置控制脉冲参数。DNA的EB染色DNA片段大小（分子）的估算：可检测几百万bp的DNA片段。脉冲场凝胶电泳分离片段大小及迁移速度的经验公式见表2-25。,2.7 DNA片段的连接重组,2.7.1 DNA连接酶（DNA Ligase）DNA连接酶：是在1967年发现的一种能够催化双链DNA片段紧靠在一
24、起的3羟基端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶。如果是两个或两个以上不同的双链DNA片段末端连接，则产生重组DNA分子。连接酶的主要类型：E. coli DNA连接酶T4 DNA连接酶,DNA连接酶连接作用的特点DNA连接酶需要一条DNA链的3末端有一个游离的羟基（OH），另一条DNA链的5末端有一个磷酸基（P）的情况下，才能发挥连接DNA分子的作用。只有当3OH和5P彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子，被连接的DNA链必须是双螺旋DN
25、A分子的一部分。,DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口（nick），而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（gap）。由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应，因此，DNA连接酶在进行连接反应时，还需要提供一种能源分子（NAD或ATP）。,2.7.1.1 E. coli DNA连接酶E. coli DNA连接酶只能催化双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA平末端之间的连接。2.7.1.2 T4 DNA连接酶T4 DNA连接酶既可用于双链DNA片段互补黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的
26、连接，但平末端之间连接的效率比较低。,2.7.2 DNA片段之间的连接具互补黏性末端片段之间的连接连接时可用E. coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶。具平末端DNA片段之间的连接连接时只能用T4 DNA连接酶，且需增加酶量。DNA片段末端修饰后进行连接DNA片段末端同聚物加尾后连接（末端转移酶）（附图）黏性末端修饰成平末端后连接（核酸外切酶）DNA片段5端脱磷酸化作用后连接（碱性磷酸酶）（附图）BAP（细菌碱性磷酸酶）：耐热，不易除去，故不常用。CIP（小牛肠碱性磷酸酶）：不耐热，便于终止反应，常用。DNA片段加连杆后连接都具平末端的两种DNA片段加连杆后连接。分别具平末端和黏性末端的
27、两种DNA片段加连杆后连接。分别具非互补黏性末端的两种DNA片段加连杆后连接。,2.7.3 DNA重组类型插入重组置换重组,补充内容：重组DNA技术基本原理,流程演示,以 质 粒 为 载 体 的DNA 克 隆 过 程,演示,谢谢,染色体DNA： 103 106kb 。是生物界含量最丰富的DNA资源，蕴藏着地球上极大部分的遗传信息。用途：分离目的基因和基因表达调控因子；提供构建染色体载体和染色体基因整合平台系统。病毒和噬菌体DNA： 种类很多，可在原核和真核生物宿主内大量增殖。用途：构建基因克隆载体，承载较大片段的外源DNA，经体外包装，导人受体细胞；其编码的结构基因可分离出目的基因及其表达调控因子。,质粒DNA： 存在于很多微生物细胞内，游离于胞质（即染色体外遗传物质）， 1几百 kb。有复制起始位点，能自我复制。用途：构建基因克隆载体；含结构基因的质粒可分离目的基因和表达调控因子。线粒体和叶绿体DNA：真核生物特有的染色体外遗传物质，含有呼吸作用和光合作用相关基因。用途：分离目的基因和基因表达调控因子；构建克隆载体。,MCS连杆,
