1、 本科 毕业设计 （ 20 届） 白蔹提取物核磁共振指纹图谱的研究 所在学院 专业班级 化学工程与工艺 学生姓名 学号 指导教师 职称 完成日期 年 月 2 摘要： 白蔹，又名山地瓜、野红薯、白根、五爪藤等，为葡萄科植物白蔹的干燥块根。分布于华北、东北、华东、中南及陕西、宁夏、四川等地。 春、秋二季采挖，切成纵瓣或斜片晒干。可以清热解毒，消痈散结。 为了进一步规范白蔹用药、比较白蔹药材的内在品质和鉴别特征，本文通过核磁共振对从不同产地的白蔹进行了指纹图谱及成分分析的研究，为白蔹与制剂的鉴别及其质量控制提供依据。 关键词： 1 HNMR；白蔹； 植物图谱 Abstract： Ampelopsis
2、， Another name is Mountain potato、 Wild sweet potato、 white Root、Ipomoea vines and so on. Distributed in north China, northeast China, east China, central China and shaanxi, ningxia, sichuan, etc. The spring and autumn two quarters of acquisition, Cut into longitudinal disc or inclined piece to dry
3、in the sun. Can qingrejiedu, turned carbuncle estate. For the purpose of further regulating the Ampelopsis drug use, Comparison of Ampelopsis quality and distinguishing characteristic, This article through nuclear magnetic resonance (NMR) to the from Ampelopsis different origin for fingerprint and c
4、omposition of the research, In order to Ampelopsis and preparations identified and quality control, provides the basis. Keywords： 1 HNMR ； Ampelopsis； Plant map 3 目 录 摘要 . 错误 !未定义书签。 1 绪论 . 4 1.1 前言 . 4 1.2 中药指纹图谱 进展 . 错误 !未定义书签。 1.2.1 紫外光谱指纹图谱 . 4 1.2.2 红外光 谱 (IR )指纹图谱 . 5 1.2.3 荧光光谱 . 5 1.2.4 薄层色谱
5、 (TLC)指纹图谱 . 5 1.2.5 气相色谱 (GC)指纹图谱 . 6 1.2.6 高效液相色谱 (HPLC)指纹图谱 . 6 1.2.7 高速逆流 (HSCCC)指纹图谱 . 6 1.2.8 毛细管电泳 (CE)指纹图谱 . 6 1.2.9 核磁共振 (NMR)指纹图谱 . 6 1.2.10 分子生物指纹图谱 . 7 1.3 本课题研究的意义和目标 . 错误 !未定义书签。 2 实验部分 . 错误 !未定义书签。 2.1 仪器、试剂 . 错误 !未定义书签。 2.2 实验步骤 与技术路线 . 9 2.2.1 药材来源 . 错误 !未定义书签。 2.2.2 样品制备 . 错误 !未定义书
6、签。 2.2.3 技术路线 . 12 3 结果与分析 . 13 3.1 各提取物氢谱 . 13 3.2 谱图比较 . 14 4 结论 . 15 致 谢 . 16 参考文献 . 17 4 1 绪论 1.1 前言 目前对植物中药指纹图谱研究的必要性以及核磁共振指纹图谱的方法学研究，引起了国内外科研 工作者的广泛关注。本文在研究 1 HNMR 指纹图谱在鉴别中药材白蔹质量方面应用的基础上，进一步扩大中药材的研究范围，利用 1HNMR 指纹图谱对中药白蔹质量控制进行了研究。为此采用 600MHz 超导核磁共振波谱仪来进一步获得植物中药白蔹的 1HNMR 指纹图谱，以达到控制中药白蔹的质量和提高北沙参质
7、量标准化程度的目的。 白蔹别名山地瓜、野红薯、山葡萄秧、白根、五爪藤，来源为葡萄科植物 白蔹（ Ampelopsis japonica Makino ）的干燥 块根 ，春、秋二季采挖，除去泥沙及细根，切成纵瓣或斜片，晒干。白蔹性状为 纵瓣呈长圆形或近纺锤形，长 4 10cm，直径 1 2cm；切面周边常向内卷曲，中部有 1 凸起的棱线；外皮红棕色或红褐色，有纵皱纹、细横纹及横长皮孔，易层层脱落，脱落处呈淡红棕色。斜片呈卵圆形，长 2.5 5cm，宽 2 3cm，切面类白色或浅红棕色，可见放射状纹理，周边较厚，微翘起或略弯曲。体轻，质硬脆，易折断，折断时，有粉尘飞出 1。气微，味甘。医用功能为清
8、热解毒，消痈散结。用于痈疽发背，疔疮，瘰疠，水火烫伤。 1.2 中药指纹图谱 进展 中药现代化是当代中药发展中的一个最热门的研究方向，已成为国内外医药界一太 热点。其中中药材、中成药的质量标准现代化是中药现代化的一个重要组成部分。如何根据中医药的特点，提出一整套具有中医药特点又具有高科技特征的中药材、中成药现代质量标准是一重要课题，建立中草药单昧药和复方全组成的指纹图谱是种具有先进性的切实可行的方法，现在这方法已成为国际上较勾通用的方法，而且指纹图谱已成勾国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效手段 2。 中国中药指纹图谱的研究已有相当的基础，最早可以追溯到 20 世纪 60 年代，如采用薄层
9、色谱、紫外光谱、红外光谱法来描述中药材主要成分的特征，这是早期的原始的指纹 图谱，具有直观、在简单情况下容易比较差异的优点。随着分析技术的飞速发展和微电脑的广泛应用，基于化学计量法的中药指纹图谱的研究方法向高效、灵敏、专属、智能化、联用型的方向发展，高效液相、高效毛细管电泳、高速逆流色谱、核磁共振、近红外光谱等新兴分析技术的应用和各种数学分析方法的运用，为中药指纹图谱的研究与发展提供了广阔的前景 。 1.2.1 紫外光谱指纹图谱 5 紫外光谱法是 1995 年以前指纹图谱常用的方法 3。由于不同中药所含的不饱和程度有差异，因而导致其紫外吸收曲线的形态、峰位、峰强度亦有差异，以此达到鉴别效果。常
10、用导数光谱及结合各种数学分析法来消除样品中的一些无关吸收，排除原图谱中的某些干扰。 1.2.2 红外光谱 (IR )指纹图谱 红外光谱又称分子振动转动光谱 4，是一种分子吸收光谱。当样品受到频率连续变化的红外光照射时，分子吸收了某些频率的辐射，并由其振动或转动运动引起偶极矩的净变化，产生分子振动和转动能级从基态到激发态的跃迁，使相应于这些吸收区域的透射光强度减弱。记录红外光的百分透射与波数或波长关系的曲线，就得到红外光谱。一般的红外光谱是对整个化合物分子的鉴别，比单纯的官能团的化学定性鉴别专一性更 强。而中药材的红外光谱在本质上与纯化合物红外光谱不同，它是混合物中各个组分红外光谱的叠加。中药材
11、各种化学成分只要在质和量的方面相对稳定，并且样品处理方法按同一要求进行，则其红外光谱也是应该相对稳定的。因此这样得到的混合物红外光谱应该是具有一定的客观性和可重复性。利用上述原理，不同混合物的红外光谱各主要吸收峰归属，只要在 4000 400cm，范围内比较光谱差异即可。这种差异可以表现在三个方面：一是在某一波数处鉴别双方只有一方有明显差异；二是在某一波数内，鉴别双方的光谱中，吸收峰的形状和强度都有明显差异；三是 “指纹区 ”，面貌不同。 1.2.3 荧光光谱 中药注射剂常含荧光性物质，但因不同注射剂所含具体荧光性物质不同，同种注射剂又因厂家的具体配方的差异或制备工艺条件的波动，均会使其特征的
12、荧光激发、发射光谱不同或其强度呈现差异；根据注射剂的荧光图谱的差异达到快速鉴别、认定和控制配方、工艺的目的 5。 荧光光谱不像红外光谱那样具有明显的指纹特征，但具有高灵敏度的显著优势，且差异更为一目了然，易于判断，因此，可以作为红外光谱指纹技术的一种补充，用于中药注射液的鉴别和认定，以及生产工艺的控制和成药热稳定性研究等。 1.2.4 薄层色谱 (TLC)指纹图谱 薄层色谱为传统的定性、半定量分析方法 6，在中国有大量采用薄层色谱法进行地道药材的定性鉴别。该法操作简单、分析速度快速、一次分析样品多，提供信息量大，用固定波长对薄层展开的各个斑点进行扫描，所得扫描图谱比目测的层析图谱更6 加客观准
13、确，因此具有较好的指纹鉴别意义。其最大的缺点是重现性以及精密度差，所以在指纹图谱应用中受到限制，但可以作为中药指纹图谱研究的借鉴和补充。 1.2.5 气相色谱 (GC)指纹图谱 气相色谱 最适合于各种主含易挥发性成分药材及其制剂的分析，尤其是 毛细管气相色谱法，分辨率很高，往往一个色谱可以分出百个成分。该法灵敏度高、分离度好，分析速度快，但是分析范围只是局限于低沸点成分，是指纹图谱研究的主要方法之一。 1.2.6 高效液相色谱 (HPLC)指纹图谱 高效液相色谱适用于成分复杂而不易分离的分析对象，具有分离效能高，灵敏度高，分析速度快，不需要气化，检测手段多等优点，是目前指纹图谱技术中用途最广泛
14、的一种方法 7。 1.2.7 高速逆流 (HSCCC)指纹图谱 高速逆流指纹图谱是当前国际流行的新型的液 -液分配技术。应用动态液一液分配原理，利用相对移动 互不混溶的两相溶剂，在处于动态平衡的两相中将具有不同分配比的样品组分离。其特点是不用固相载体作固定相，克服了样品吸附、损失、峰形拖尾问题。操作更为简便，容易掌握。对样品的预处理要求低，仅需一般粗提物即可。该技术的回收率高，能实现梯度操作，亦能重复进样，在中药质量分析控制研究中，尤其在指纹图谱研究中有较好的应用前景。 1.2.8 毛细管电泳 (CE)指纹图谱 毛细管电泳 (CE)又叫高效毛细管电泳 (HPCE)8，以弹性石英毛细管为分离通道
15、，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为的差异而实 现分离的电泳分离分析方法，是近年发展起来的一种新的分离技术，是电泳技术和层析技术结合的产物，兼有高压电泳的高速高分辨率及 HPLC 的高效率等特点，其选择性与高效液相有很大的互补性。因此在指纹图谱研究方面的应用越来越广泛。 1.2.9 核磁共振 (NMR)指纹图谱 核磁共振氢谱 (1H-NMR)是鉴定有机化合物结构的重要的方法之一 9。它可以获得化合物的包括各类质子的化学位移、数量、偶合关系等多个结构信息。如可以用一定程序获取植物类中药的特征性化学成分 (或化学成分组 )的总提取物，同时这些特征的化学成分的含量是相 对固定
16、的，则在规范的提取分离条件下，植物类中药的 1H-NMR 图谱与植物品种存在着严格的对应关系，没有混淆的可能性。图谱中的信号强弱反映了7 混合物中各组分的相对含量。在对特征总提物进一步分离得到单体后，通过结构鉴定和 NMR 研究，可以对指纹图谱中的各特征谱线进行归属 。 1.2.10 分子生物指纹图谱 随着分子生物学技术的迅速发展， DNA 分子技术己越来越多的用于中药材品种鉴别的研究。分子生物指纹图谱是指采用分子标记技术得到的某一中药材品种的 DNA 指纹图谱。如对于人参、西洋参一类中药材的鉴别，用传统的方法 (性状、显 微、理化等鉴别方法 )都显片面性，结果往往很模糊，因而其产地、生长年限
17、、加工方式等因素与其性状和成分不呈很强的相关性，但应用分子生物学技术可以迎韧而解。 1.3 本课题研究的意义和目标 随着现代分析技术的发展，指纹图谱技术是当今国际公认的控制中药质量的质控模式 11。它能从原药材的栽培、引种，中成药生产工艺的规范与优化，到产品质量标准的制定提供全方位的质量保证。近年来国外对草药产品的质量评价也在提倡指纹图谱，随着各种分析技术的创新和提高以及计算机应用技术的不断发展，世界各国对天然药物的了解和研究在不断深入 ，中药指纹图谱技术在国内外已成为一种发展趋势 ,其研究的方法和技术更趋成熟完善，成为国际公认的控制中药和天然药质量最有效的方法和手段。日本汉方药在 20世纪
18、80年代就采用高效液相指纹图谱控制质量。欧共体也将指纹图谱监控技术应用于植物药质量控制，美国食品药品管理局允许草药保健品申报资料时提供色谱指纹图。世界卫生组织在 1996 年草药评价指导原则中也规定：如果草药的活性成分不明，可以提供色谱指纹图以证明产品质量的一致性。在英国、印度、加拿大等国家在植物药的研究中，也对指纹图谱十分重视。在许多国家的药典中，色谱指纹 图谱已成为主要的分离分析方法。而我国药典的中药部分，这一分析技术还未占主导地位。在医药科技 “十五 ”计划中，重点提出解决中药材质量规范化问题。 2000年国家药品监督管理局颁布了中药注射剂指纹图谱研究的技术要求，要求中药注射剂必须进行指
19、纹图谱的研究，并建立其相关的标准。规范了中药指纹图谱的研究，从而促进了国内近几年来对指纹图谱的研究热潮。而国外许多研究机构对中药指纹图谱的研究主要为建立指纹图谱与药效的相关性研究，是以中药理论和新药开发研究体系为主的模式。我国对中药指纹图谱的研究尚处于初级阶段，与发达国家相比 有一定差距。目前主要为使用各种方法建立中药材及制剂的指纹图谱，以及对相应信息进行数字化处理，使其能够评价和控制中药材及制剂的质量。 建立以智能统一液相色谱法为基础的中药组成指纹数据库，以及直接用质谱、光谱等手段测定中药组成数据库，迸一步利用8 色谱和质谱、光谱等的联用技术建立分离后各组分的质谱和光谱数据库。对数据进行比较
20、、归纳，形成色谱、质谱光谱综合数据库并合色谱、质谱和光谱的规律。专家系统及化学计量学理论对数据库进行管理，形成智能统一数据库是未来 5 10年内中药发展的目的和方向。在这一过程中必将采用最新发展的 各种色谱、质谱、光谱手段，对中药及复方进行定性、定量研究。同时要采用飞速发展的计算机技术和化学计量学进行大量的信息处理。这工叉将极大的推动色谱、质谱、光谱和化学计量学等学科的全面发展。同时形成各种分析手段密切合作共同解决复杂体系分析的良好局面反过来又指导实际指纹图谱的测定，使指纹图谱不断的完善和充实。 9 2 实验部分 2.1 仪器、试剂 实验用到的主要仪器的型号及制造商见表 2-1， 主要试剂的纯
21、度及制造商见表 2-2 表 2-1 仪器的型号及制造商 仪器名称 型号 制造 商 国别 电子天平 AL204 梅特勒 -托利多 瑞士 旋转蒸发仪 RE-52AA 上海亚荣 中国 循环水式多用真空泵 SHB- 郑州长城 中国 电热恒温水浴锅 DK-S24 上海精宏 中国 核磁共振仪 Avance 400MHZ Bruker公司 瑞士 表 2-2 试剂的纯度及制造商 试剂名称 纯度 制造商 国别 石油醚 分析纯 杭州试剂 中国 正丁醇 分析纯 双林试剂 中国 乙酸乙酯 分析纯 青山试剂 中国 甲醇 分析纯 杭州试剂 中国 乙醇 95% 嘉兴学院 中国 2.2 实验步骤与技术路线 2.2.1 药材来
22、源 白蔹实验药材分别来自于 四 川、湖北、陕西。 2.2.2 样品制备 先将白蔹实验药材用电子天平称取 120g，将称取好的白蔹放入粉碎机中粉碎，把粉碎好的白蔹药材粉末放入 2L圆底烧瓶中并加入浓度为 95%的乙醇溶液。将装有药材的圆底烧瓶放入电热恒温水浴锅中，将电热恒温水浴锅温度调节至 90 水浴加热回流 3 4次，每次 lh，滤取提 取液装入桶中。 把 旋转蒸发仪 的温度调节至 55后使 收集好的白蔹提取液 进行浓缩，得到粘稠状的浓缩溶液。将得到的浓缩溶液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取操作，分别取分液漏斗的上清液装入贴好标签的瓶中。使用 旋转蒸发仪 分别将石油醚、乙酸乙酯和10 正丁醇的萃取液进行浓缩得到粘稠状得浓缩溶液分别放入贴好标签的试管中，将试管放入干燥箱中在 60干燥使试剂完全挥发。最后使用 核磁共振仪 对正丁醇的浓缩物质进行白蔹指纹图谱的绘制。 2.2.3 技术路线 不同产地白蔹 药材粗粉 四川样品浓缩产物 湖北样品浓缩产物 陕西样品浓缩产物 95%乙醇回流浓缩 四川样品正丁醇提取物 1H NMR 测定 陕西样品正丁醇提取物 1H NMR 测定 湖北样品正丁醇提取物 1H NMR 测定
