1、 1 浅探固定化小球藻在不同培养液中的生长情况 摘 要： 用海藻酸钠 固定化小球藻，将经固定化的小球藻分别放在不同培养液中，在阳光充足的地方进行培养，观察培养液的颜色，浑浊度，定期测定培养液的 PH 值，藻密度，叶绿素含量等。通过对测定数据进行对比分析，确定在实验中的五种培养液中海藻肥培养液最适合固定化小球藻的生长。 关键词： 固定化小球藻 不同培养 生长 藻密度 2 目 录 题目 4 中文摘要 4 1 药品的配制 4 2 固定化小球藻 5 3固定化小球藻的培养 5 4固定化小球藻在不同营养环境中的生长情况 5 5 实验数据与分析 5 (1)固定化小球藻在培养过程中 PH的变化 5 (2)不同
2、培养液对固定化小球藻生长的影响 6 (3)固定化小球藻在各培养液中叶绿素 a和叶绿素 b含量的变化 7 6固定化小球藻培养液中藻密度的测定 8 结论 8 注释 参考文献 8 致谢 9 3 前 言 小球藻（俗称为绿藻）是五亿四千年前就已经在地球上繁衍的一种单细胞的绿色微藻类，不管是生态环境的巨变还 是自然灾害的侵袭，都没能毁灭它，其稳定的基因始终没有改变。生息在淡水中的小球藻被称为“罐装的太阳”，含有丰富的叶绿体，它借助阳光，水和二氧化碳以每隔 20 小时分裂出四个细胞的旺盛繁殖能力，不停地将太阳能转换成蕴含多种营养物质成分的藻体，并在增值中释放大量的氧，其光合能力高于其它植物十倍以上。小球藻的
3、藻体细胞内含有丰富的蛋白质，维生素，矿物质，食物纤维，核酸及叶绿体等，其产品能全面提供给人类健康及疾病康复期间所需的营养物质及微量元素，具有增强人体免疫力，防止病毒增殖，抑制癌细胞增殖抑制血糖上升，降低血清胆固醇含 量，排除毒素，迅速修复机体的损伤等功能，因此，小球藻是一种很好的天然营养健康品，广泛应用于食品，医疗保健，美容等各个领域。 小球藻的培养方式主要是自养培养和异养培养。自养培养主要是指利用光能将无机碳转化为有机碳水化合物的过程，光照可以采用太阳光或人工光源，无机碳源主要包括碳酸盐或 CO2，其最适培养温度为 25 35，最适 PH 6.5 7.5，最适光照强度 2000 50001u
4、x,除此之外还需要在培养基中提供氮源，磷源，镁源和铁及微量元素等。其异养培养即小球藻利用糖，有机酸和醇类等 60 多种有机碳源， 由于更多的能量用于呼吸代谢，限制了细胞物质的合成，但可以使小球藻的脂肪的含量明显地增加，有利于其中脂类转化生物柴油。 小球藻的固定化培养即将小球藻溶液与海藻酸钠混合在纯净 CaCl2溶液的作用下形成固体小球。此包埋制得的小球体有较好的机械性能和防破坏能力 ,而周围营养源可与其内的藻体进行正常接触，保证藻体正常生长的需要。为了探讨固定化小球藻的生长条件，我们首先培养小球藻，进行固定化，然后将其培养在不同的液体营养环境中，并定期对培养液的 PH 值，浑浊度，藻密度，吸光
5、度等进行检测，便可将得到固定化小球藻在不同的环境条 件下生长情况及一系列生长规律而为 固定化小球藻的培养提供基础数据 。 1 药品的配制 (1) 4%的海藻酸钠溶液 200ml (2) 5%的 CaCl2溶液 2000ml(分别装在 5个烧杯中，每个烧杯约 250ml) (3) 培养液的配制 1号 SE 溶液 （药品加蒸馏水） 2号 土壤浸出液 用水浴加热土壤浸出液大约 70三十分钟，二十四小时后重复加热一次，过滤浸出液。 号 硝酸钠 60mg/L,尿素 1.8mg/L,磷酸二氢钾 2mg/L。 号 复合肥溶液 号 海藻 肥 将配置好 的溶液和实验用具放入高压蒸汽灭菌过内进行灭菌处理。 2 固
6、定化小球藻 (1)在超净工作台打开的情况下打开紫外灯对工作台灭菌处理约 20 分钟，并用沾有医用酒精的棉球擦拭双手和工作台面（起灭菌效果）。 (2)将经过灭菌处理过的海藻酸钠溶液和 CaCl2溶液取出，从锥形瓶中取出 15ml海藻酸钠溶液与绿藻溶液置于小烧杯中，用干净的注射器抽取混合溶液再放出，重复几次此动作使液体尽量充分地混合均匀，再将带有针头的注射器吸取大约 5 毫升的混合液，慢4 慢的一滴滴的滴向 CaCl2溶液中，可看到有固体透明球体生成，重复此过程直到将混合液用尽。 (3)分别在五个烧杯中重复步骤（ 2）得到五组固定化小球藻 静置大约 2小时后分别向烧杯中加入无菌蒸馏水使其分别稀释一
7、倍，最后将大烧杯放入冰箱内静止过夜。 3 固定化小球藻的培养 将经过冰箱静置的五组小球藻分别取出放入各个装有灭菌过的培养液的锥形瓶内，盖上牛皮纸放在阳光充足的阳台上使其自然生长 并定期对其生长情况进行观察，对球体成分和培养液检测。 4 固定化小球藻在不同营养环境中的生长情况 (1)培养液的 PH 值检测 定期用玻璃棒蘸取培养液，滴在 PH试纸上检测其 PH值。 (2)固定化小球藻的叶绿素含量 分别从五组实验中取固体小球 0.2 克，吸干水分放置试管内用平头玻璃棒将其捣碎，再分别向试管中加入 95%的乙醇约 5ml 并用封口膜将试管封严，浸泡大约两小时，取其上清液在分光光度计下测定其吸光度值（分
8、别测定其在波长为 649nm 和 665nm 处的吸光度值 A649,A665） ,以此来计算叶绿素 a，叶绿素 b 和总的叶绿素含量（ mg/L） 其中 C 叶绿素 a =13.95A665-6.88A649 C 叶绿素b=24.96A649-7.32A665 总叶绿素浓度（ mg/L） =C叶绿素 a+ C叶绿素 b。 (3)培养液中的藻 密度的测定 取一定量的培养液，测其在 650nm 处的光吸收值，即为其藻密度，表示培养液中的藻体数量的多少。 5 实验数据与分析 （根据下列四副图中数据得出试验结果） (1)固定化小球藻在培养过程中 PH的变化 根据试验测定结果（图 1）可以得出： 2，
9、4号培养组中的培养液在不同培养时期其 PH 值的变化幅度较小（约 0.1 0.2）， 1， 3号培养组中的培养液在培养过程中其 PH变化幅度较大约（ 0.5-0.6）， 5组中培养液的PH值保持不变而 1， 2， 3， 4组总体来看，在培养的中后期其 PH值呈减小趋势。由此分析可以得出 5组的培养其化学稳定性比前四种较好。 各培养组在不同培养时长培养液的 PH 值4 . 24 . 44 . 64 . 855 . 25 . 4培养时长（天）PH值01234561 号液2 号液3 号液4 号液5 号液1 号液 5 . 1 4 . 8 4 . 8 4 . 62 号液 4 . 8 5 . 1 5 .
10、2 4 . 93 号液 4 . 6 5 . 3 5 . 1 54 号液 4 . 5 4 . 6 4 . 7 4 . 65 号液 5 . 4 5 . 4 5 . 4 5 . 41 2 3 4（ 1 1 7 天 2 2 7 天 3 2 9 天 4 4 3 天）图 1各培养组在不同培养时长培养液的 PH值 (2)不同培养液对固定化小球藻生长的影响 5 观察实验组中在培养过程中不同培养时期的总叶绿素含量的变化可得：在培养的初期第 1， 2， 3，组中的单位质量的小球藻中的总叶绿素含量呈下降趋势，而第 1， 5组中的叶绿素的含量呈现缓慢增加的趋势。由此特点可以分析得到在固定化培养的初期，由于小球藻刚转入
11、新的培养环境中，需要对新环境有一定时间的适应，因此体内的叶绿素的合成较缓慢。 再比较中后期的测定结果可得 1， 2， 3， 5组中的叶绿体含量呈增高趋势而 4组中的数值则呈减小趋势，即在 4组中其营养液开始影响小球藻的叶绿素的合成而不适合其生长。 最后纵观全图分析，在整个的培养过程中 5组的总叶绿体含量自始至终呈不断地增加的趋势，且总含量增加迅速，明显，因此可分析的 5组的培养其内的藻体能较快的适应周围的新营养环境，且能较快的合成叶绿素，较适合藻体的生长。 图 2 各培养组不同时长单位质量小球体中总叶绿素的含量（ mg/L） (3)固定化小球藻在各培养液中叶绿素 a和叶绿素 b含量的变化 测定
12、固定化小球藻在各培养液中叶绿素 a 和叶绿素 b含量，结果见图 3，发现：在培养到中期的时候 1， 2， 3组试验中的单位质量的固定化小球其叶绿素 a的含量小于叶绿素 b 的含量 ， 4， 5两组试验中叶绿素 b 的含量小于叶绿素 a 的含量，则在此时小球藻体内的叶绿素 a的合成较叶绿素 b的合成少， 4， 5组中叶绿素 b的含量小于叶绿素 a的含量，在 5组中其相差量较大，即此时期内的叶绿素 b的合成速率远大于叶绿素 a 的合成速率：纵观全图可发现 1， 4， 5中叶绿素 a和叶绿素 b 含量较大，其各个含量差别较明显， 2， 3组中的含量小，差别较小。 培养时长（天）总叶绿素浓度（mg/L
13、）00 . 511 . 522 . 533 . 541 号液2 号液3 号液4 号液5 号液1 号液 0 . 2 7 3 6 2 0 . 0 8 0 7 6 0 . 2 0 9 1 3 0 . 5 5 6 8 82 号液 0 . 1 6 1 5 2 0 . 1 4 8 2 6 0 . 0 7 4 1 3 0 . 1 0 5 4 73 号液 0 . 2 3 5 6 5 0 . 1 1 8 7 3 0 . 1 5 4 8 9 0 . 4 5 8 0 44 号液 0 . 3 2 9 6 7 0 . 4 4 3 5 8 0 . 3 6 2 8 2 0 . 3 5 4 3 85 号液 0 . 6 8 7
14、 6 7 1 . 4 9 4 0 7 2 . 0 1 8 4 1 3 . 4 5 8 2 21 2 3 4（ 1 1 7 天 2 2 7 天 3 2 9 天 4 4 3 ）天）6 当培养时间在30天时各个培养组中的单位质量的小球藻内含的叶绿素a和叶绿素b的含量00.20.40.60.811.21.41 2 3 4 5培养组（号）叶绿素含量（mg/L）系列1系列2图 3 当培养时间在 30 天时各个 培养组中的单位质量的小球藻内含的叶绿素 a和叶绿素 b 的含量 17 29 30 43 1 号 0.1265 0.03516 0.03573 0.18344 2 号 0.07032 0.04242
15、0.02121 0.04223 3 号 0.09153 0.07013 0.05637 0.15516 4 号 0.15459 0.2595 0.22434 0.16166 5 号 0.41371 0.89755 1.19221 1.61622 表 1各培养组不同时长单位质量小球体中叶绿素 a的含量（ mg/L） 17 29 30 43 1 号 0.14712 0.0456 0.1734 0.37344 2 号 0.0912 0.10584 0.05292 0.06324 3 号 0.14412 0.0486 0.09852 0.30288 4 号 0.17508 0.18408 0.1384
16、8 0.19272 5 号 0.27396 0.59652 0.8262 1.842 表 2 各培养组不同时长单位质量小球体中叶绿素 b的含量（ mg/L） 6、 固定化小球藻培养液中藻密度的测定 取培养 43 天的固定化小球藻培养 液，在 650nm 测定光吸收，结果见表 5，培养液中的藻密度，第 1， 3， 4 号培养液的藻密度较大，第 5 号培养液中的藻密度较小， 2 号则最小。即在第 1， 3， 4 组中有大量的藻体从固体小球中逸出，稳定性较差，而 5 号培养液最为稳定。 时 间 （ 天 ） 组 时 间 （ 天 ） 组 7 各培养组在培养43 天后培养液中的藻密度00.050.10.1
17、50.20.251 2 3 4 5培养组（号）溶液中的藻密度系列1图 4 各培养组在培养 43 天后培养液中的藻密度 结 论 通过对以上实验数据的统计与分析可以发现在 2组培养中培养的固定化小球藻的生长速度较慢，不适合其生长； 1组培养的固定化小球藻其 PH变化幅度较大，化学稳定性较低，而 1， 4 组中会出现藻体的外逸而影响其稳定培养 ； 3 组中虽其球内藻体能 稳定包裹，但随着培养时间的增加其叶绿素的合成速率大大减慢。 5 组中的小球藻能较快适应此营养环境，大量，迅速合成叶绿素，且球体内的藻体稳定性较好，被稳定包裹， PH值较稳定。因此综合以上几组图像分析结果可以确定在此 5种培养液中海藻
18、肥溶液（即5号）是最适合于固定化小球藻的生长培养的。 8 参考文献 刘建文 .养生保健的全营养素：小球藻 .中国社会科学出版社 .2008.1 【 1】小球藻 .彩羽漫天 http:/ 2010 .11 .12 【 2】 9 致谢 在此论文撰写过程中，要特别感谢我的 导师李 X老师 的指导与督促，同时感谢她的谅解与包容。没有 李 X老师的帮助也就没有今天的这篇论文。求学 与与实验研究 历程是艰苦的，但又是快乐的 ，是美好的。 感谢我的班主任 彭 XX老师， 谢谢他在这 三 年中为我们全班所做的一切， 她 不求回报，无私奉献的精神 我很钦佩 ，再次向 她 表示由衷的感谢。在这 三 年的学期中 我所 结识的各位生活和学习上的挚友让我得到了人生最大的一笔财富。在此，也对他们表示衷心感谢。 谢谢我的父母，没有他们辛勤的付出也就没有我的今天，在这一刻，将最崇高的敬意献给你们！ 本文参考了大量的文献资料，在此，向各学术界的前辈们致敬！
