1、 毕业论文 开题报告 化学工程与工艺 耐尔蓝接技超支化合物用于 DNA 电化学传感器的研究 一 、选题的背景、意义 近年来，人类对基因技术的研究和应用迅速发展，并在卫生防疫、医学诊断等领域发挥重要作用。在多种 DNA检测技术中， DNA生物传感器代表了一种新的检测手段，与传统诊断技术相比，它快速、灵敏、操作和仪器设备简单，尤其是它具有分子识别功能，在基因诊断、治疗，和传染性疾病检测等方面做出了很多贡献，代表了当今生物检测技术的前沿。正在研究和已经应用的 DNA传感器主要包括压电式传感器、化学发光 (荧光 )传感器、微组装免疫传 感器、光学传感器以及电化学传感器等。在 DNA杂交及识别方面，电化
2、学 DNA传感器成本低，设计简单，设备小巧，能耗低，引起人们重视 1。通常，电化学 DNA传感器是通过电极表面同载电化学指示剂标记的 ssDNA来识别与之互补的目标 DNA序列。所使用的电化学指示剂是具有电化学活性的物质，通常使用二茂铁，还有邻苯二胺、阳离子金属复合物有机染料等。但它们往往同时与 ssDNA和 dsDNA结合，选择性不理想。耐尔蓝 用于生物染色，区别脂肪酸和中性脂肪，病理组织中细菌和放线菌染色等等方面效果较好 ，亦有作用为电化学指示剂的实际价 值。 DNA是一类重要的生命物质，是大多数生物体遗传信息的载体，对 DNA的研究是生命科学领域中极为重要的内容，随着人类基因组计划的顺利
3、实施，基于DNA探针的基因传感器、基因芯片的研究正成为基因组研究的一个热点， DNA传感器是用电化学手段选择性检测 DNA的生物传感器，由已知的 DNA片段和电活性指示剂构成。利用电活性分子（杂交指示剂）来指示杂交前后信号变化，选择性地识别靶序列 2。电化学 DNA传感器与通常的标记（放射性同位素标记、荧光标记等）探针技术相比，不仅选择性好、灵敏度高、响应快、操作简单及价格低廉，而 且有无可比你的分离纯化基因的功能，故可望用于临床快速检测基因疾病，探讨各种因素引起的 DNA损伤程度和可能的突变机理以及 DNA为作用靶的药物研究。 二、相关研究的最新成果及动态 李毓琦 3等测试了 一种新型的乙型
4、肝炎抗体膜片。测试时，仅需将 25l被检血清滴注于该膜上，经孵育与洗涤即可制得抗原与抗体复合物膜。用复合物膜组装成免疫电极测定血清样品中乙型肝炎表面抗原古量。电极的线性范围是20320ng/ml，方法的日间相对标准偏差为 10.78%(n=4， m=5),对血清中可能存在的一些其它抗原具有较好的选择 性。 105例临床血清样本，本法与酶联免疫吸附分析法测定结果符合率为 86%。乙肝抗体膜片系一次性使用， 4 可保存半年以上。 牛淑妍 4等在 0.2mol/L pH5.0 Na-HAc 缓冲溶液中，运用电化学方法和荧光光谱分析法研究了硫堇与鲑鱼精 DNA 的相互作用。硫堇与 DNA 作用后，氧化
5、还原峰电流减小，峰电位正移，溴化乙锭 (EB)-DNA 体系在加入硫堇后出现荧光淬灭的现象。结果表明，硫堇与 DNA 的结合方式主要是嵌插作用。以硫堇为电化学杂交指示剂，制得了一种 DNA 电化学生物传感器，该传感器具有良好的选择性，靶 DNA 在 11.3121nmol/L 范围内具有了良好的线性关系，线性相关系数 0。9971，检测限为 5.26nmol/L(3， n=7)。 刘志敏 5等以室温固相合成法制备纳米 ZnO，通过壳聚糖 (CHIT)的成膜效应将纳米 ZnO固定在玻碳电极 (GCE)表面，制得的 ZnO/CHIT/GCE电极成为 DNA固定和杂交的良好平台。 DNA的固定和杂交
6、通过电化学交流阻抗进行表征。以电化学交流阻抗免标记法检测目标 DNA，固定于电极表面的 DNA探针与目标 DNA杂交后使电极表面的电子传递电阻增大，以此作为检测信号可以高灵敏度地测定 目标DNA。电化学阻抗谱检测人类免疫缺陷病毒 (HIV)基因片段的线性范围为2.010-11 2.010-6mol/L，检出限为 2.0 10-12 mol/L。 魏娜 6等基于急性早幼粒细胞白血病 (acute promyelocytie leukemia， APL)中PML/RARA(promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor alpha)融合基因的碱基序列，设
7、计了一种新型发夹结构 DNA电化学探针，并将此探针固定在玻碳电极表面，采用自行合成的硝基吖啶酮 (NAD)作杂交指示剂，应用循环伏安法与差分脉冲伏安法实现了对人工合成的 APL PML RARA融合基因的检测，同时对检测条件进行优化。结果表明，在 pH 7.0Tris-HCI缓冲液中，杂交前后 NAD氧化峰电流差值与靶标链浓度在 2.0 10-8 1.0 10-7mol/L范围内呈良好的线性关系，检出限为 3.010-9mol/L。 许世超 7等 构建了一个以亚甲基蓝 (MB)为杂交指示剂的电化学 DNA传感体系：通过自组装的方式将巯基改性的单链 DNA 5端 (HS ssDNA)连接到金电极
8、表面形成 Au ssDNA，当检测体系中加入和 Au ssDNA互补的目标单链DNA(CSS DNA)时，会形成一个双链 DNA系统 (Au dsDNA)，加入 MB并通过循环伏安法检测了杂交过程中的信号变化，验证了 Au ssDNA及 Au dsDNA的形成。在 4.010-6 1.010-5moL/L内，检测灵敏度随 MB浓度的增加而升高，当浓度达到 2.010-5mol/L时接近最大值。示差脉冲伏安法检测结果表明，该检测体系对目标 DNA的选择性识别能力高，可区分具有单碱基错配的目标 DNA序列。检测体系对目标 DNA的检测灵敏度随着目标 DNA浓度的增加而增加，在 5.010-101.
9、810-9moL/L内呈线性关系，计算所得对目标 DNA的检测限为 5.010-10moL/L。使用寿命检测表明，经过 5次变性 /杂交循环后，检测信号降低并接近于检测限。 李金花 8等 研究了 DNA夹心杂交和直接杂交体系 ， 将功能化纳米金引入到标记有生物素的杂交双链上 ， 制成具有电化学活性和纳米金放大作用的 DNA电化学传感器 ， 采用循环伏安法测试 /在夹心杂交体系中 ， 靶点 DNA浓度与阳极峰电流关系曲线的相对标准偏差为 3.0%13.0%， 在浓度为 6.910-30.14nmol/L范围内得到良好的线性关系 ， 检测限达到 2.010-3nmol/L实现了对单碱基突变的高灵敏
10、检测和序列识别 。 直接杂交检测限为 2.510-4分别在 2.510-45.010-3nmol/L和5.010-310nmol/L范围内得到峰电量与浓度的良好线性关系 。 并比较这两种体系 。 王桂香 9等用溶胶 -凝胶法在玻碳电极上制备了纳米多孔羟基磷灰石 (Hap)-聚乙烯醇 (PVA)涂层膜固定双链 DNA， 得到了一种新型 DNA电化学传感器，检测了由 Fenton反应引起的 DNA氧化性损伤 。 结果表明，一定量浓 度的抗坏血酸 (AA)能加速 Fenton反应的进行，使 DNA损伤很快达到极限；损伤试剂中 Fe2+的浓度越大，产生的羟基自由基 (OH )越多，对 DNA的损伤就越
11、严重；损伤试剂中 EDTA的浓度越小，溶液中游离的 Fe2+以及与 DNA键合的 Fe2+的浓度则相对越大，对DNA的损伤也就越严重 。 Lei Yang10等通过固定两种纳米 ZnO的方法 构建了转移 ZnO生物传感器和增长 ZnO生物传感器。并且系统地研究和比较了不同的生物传感器之间的性能。增长 ZnO生物传感器的灵敏度高出转化 ZnO生物传感器 52%。相应的，其他性 能也是增长 ZnO生物传感器更好一些，包括响应时间，检测极限和线性范围。试验结果和更多葡萄糖氧化酶被固定在原 ZnO阵列的实际一致，并有更大的比表面积和更直接的电子通道。 Pauliukaite, Rasa11等利用壳聚糖
12、 (Chit)薄膜修饰 石墨环氧树脂复合材料(GrEC)电极用于电化学阻抗谱 (EIS)。少量薄膜修饰并使用了不同的交联剂：戊二醛 (GA)，乙二醛 (GO)，表氯醇 (ECH)和 1-乙基 -3-(3-二甲氨基 ) 碳化二甲基氨(EDC)和亚胺 (NHS)在有电活性的铁氰化钾 ( )和氯化 hexaammineruthenium( )下一起评估每个的特性。固定碳纳米管到壳聚糖模型 (Chit-CNT)使用了相同的交联剂也同样进行了研究。电极的阻抗性能与 (GrEC/Chit-CNT/EDC-NHS)特性一样好并被视为安乃近的传感器和对苯二酚以及为在葡萄糖传感器壳聚糖模型顶部使用戊二醛固定葡萄
13、糖氧化酶 (GOx)。对模型和等效电路进行了分析，并重点对扩散特性和光谱特征进行了讨论。 白燕 12等利用自组装单分子膜技术将巯己基修饰的单链 DNA固定在金电极表面，以电活性的 Hoechst33258为指示剂，考察了单链 DNA修饰 电极 (ssDNA/Au电极 )、双链 DNA修饰电极 (dsDNA/Au电极 )的指示剂氧化峰电流，并利用其差值( ip)与互补 DNA浓度成线性关系对待测 DNA浓度进行定量。因此， DNA电化学传感器可用于特定 DNA序列的识别和测定。 三、课题的研究内容及拟采取的研究方法（技术路线）、难点及预期达到的目标 1、 课题的研究内容 利用超技化合物中的大量活
14、性基团接枝活性染料，使嵌入 DNA 的指示剂有更多的电活性基团暴露在外面，在溶液中的电信号会大幅度增强，从而实现超灵敏的电化学检测目的。探讨反应条件，并研究影响测定的干扰因素 ，建立一种测定特定序列 DNA 的新方法， 2、 拟采取的研究方法、技术路线及研究难点： 2.1 单链 DNA电化学生物电极 的制备； 2.2 研究 杂交 DNA在电极表面的响应以及嵌入染料 -超支化合物在电极表面的电化学信号； 2.3 研究实验的条件改进和电极的优化 ； 2.4 建立一种 新型 DNA电化学生物传感器 。 研究难点： DNA 电极的制备与性能研究。 四、论文详细工作进度和安排 1、 2011 年 3 月
15、 1 日 2011 年 3 月 15 日：完成资料的检索和整理及汇总。 2、 2011 年 3 月 19 日 2011 年 3 月 23 日：完成开题报告及答 辩工作。 3、 2011 年 3 月 26 日 2011 年 5 月 20 日：基本完成论文所需的实验工作。 4、 2011 年 5 月 21 日 2011 年 5 月 30 日：完成论文的写作以及答辩工作。 五、主要参考文献 1 崔康 . 新型电化学传感器的研究 . 江西师范大学 -硕士学位论文 .2009 2 徐桂云 . DNA电化学传感器的制备及其在转基因植物产品检测中的应 . 中国海洋大学 -博士学位论文 .2007 3 李毓琦
16、 ，陈开全，何俊，魏素萱，牟家婉，肖志芳，雷厚成，李明远 . 新型免疫电极法测定乙型肝炎表面抗原分析化学 .1993,2l(2):129-133 4 牛淑妍 ， 韩彬 . 硫堇与 DNA的相互作用及用于 DNA电化学传感器 . 青岛科技大学学报 (自然科学版 ).2009.30(5):412-414 5 刘志敏，李哲建，康宁 .基于纳米 ZnO/壳聚糖复合膜 DNA电化学传感器用于HIV基因的免标记检测 . 分析科学学报 .2010.26(1):51-54 6 魏娜，陈敬华，王昆，李光文，罗红斌，蔡婉婷，林新华 . 发夹结构 DNA探针用于检测白血病 PML RARA融合基因的电化学传感器的研
17、究 . 分析测试学报 .2008.27(9):907910 7 许世超，张纪梅，姚翠翠，代昭，郑帼，孙波，佟魏，齐鲁 . 以亚甲基蓝为杂交指示剂的 DNA电化学传感器 . 精细化工 2008.25(12):1184-1197 8 李金花， 胡劲波 ， 丁小勤 ， 李启隆 . 功能化纳米金放大的 DNA电化学传感器研究 . 高等学校化学学报 .2005.26(8):1432-1436 9 王桂香，潘芊秀，王怀生 . 新型 DNA电化学传感器的研制及其用于 DNA氧化性损伤检测的研究 . 高等学校化学学报 .2005.26(10):18121816 10 Lei Yang, Yan Xiaoqin
18、 , Zhao Jing, Liu Xi, Song Yu, Luo Ning, Zhang Yue. Improved glucose electrochemical biosensor by appropriate immobilization of nano-ZnO. Colloids & Surfaces B: Biointerfaces.2011.82(1):168-172 11 Pauliukaite, Rasa. Ghica, Mariana E. Fatibello-Filho, Orlando. Brett, Christopher M.A.Electrochemical impedance studies of chitosan-modified electrodes for application in electrochemical sensors and biosensors. Electrochimica Acta. 2010.55(21):6239-6247 12 白燕，马丽，刘仲明，刘芳 .DNA电化学传感器的研制 . 传感器技术 .2002.21(9):62-64
