1、毕业论文 文献综述 生物工程 白蔹成分及其抗性研究 1 前言 在没有化学合成农药之前 , 最早的农药有不少是从植物中提取出来的 , 有些植物天然活性物质已开发成商品用杀虫剂 , 如鱼藤酮、烟碱等。但自 20 世纪 40 年代以来 , 有机化学合成农药纷纷代替了植物性农药而雄居市场 , 致使植物性农药的研究一度陷入低谷。由于有机农药具有品种多、效果好、见效快和使用方便等突出优点 , 一时普遍认为似乎只有化学药剂才是解决植保问题的有效方法 , 而忽视了使用农药可能带来的多方面不良影响。由于人们对化学农药的不合理使用及其药剂本身的固 有缺点 , 农药在使用中产生了一系列公害问题 , 例如环境污染、人
2、畜中毒、杀伤天敌、破坏生态平衡等严重问题 , 这些不良影响已引起人们的普遍关注 , 因此 , 对农药进行重新评价 , 开发对人畜及环境安全的生物合理性农药是解决上述问题的重要途径之一 。植物源农药作为生物合理性农药的一个重要组成部分 ,正越来越受到人们的重视 , 因为植物是生物活性化合物的天然宝库 , 其产生的次生代谢产物超过 40 万种 , 主要化学物质为萜类、生物碱、黄酮、甾体、酚类及独特的氨基酸和多糖等。目前人们已经从植物、微生物中提取抗真菌、细菌、病毒、 线虫、杀虫、除草的活性物质。因此开发利用植物资源用于有害生物防治的前景十分广阔。从植物中探寻新的活性先导化合物或新的作用靶标 , 通
3、过类推合成或生物合理设计新农药的开发已成为当前农药化学和农药毒理学研究的热点。【 1】 2 白蔹及其组成 2.1 白蔹简介 白蔹又名白根、猫儿卵 ,首载于神农本草经 ,归为下品。具有清热解毒、消肿散结、生肌止痛之功能。中华人民共和国药典 2005 版收载的白蔹为葡萄科白蔹 ( A m pelopsis japonica ( Thunb. ) Makino) 的块根。为了进一步阐明白 蔹的化学成分 ,为植物的深层开发提供依据 ,作者对白蔹的化学成分进行较为系统的研究 ,从其乙酸乙酯提取物中分离得到了 8 个化合物 ,利用理化常数和波谱学方法 ( 1H-NMR、 13C-NMR) 鉴定了它们的结构
4、 ,分别为没食子酸 、原儿茶酸、龙胆酸、白藜芦醇、大黄素、羽扇豆醇、 谷甾醇、胡萝卜苷 。【 2】 2.2 白蔹组成 2.2.1 多酚类 多酚类是白蔹的主要化学成分，也是其主要活性物质。研究白蔹化学成分的首篇报道见于 1 9 9 5 年，俞文胜等用 Sephadex LH-20 柱层析从白蔹的乙酸乙酯提取物中分离得到一系列多酚类化合物，包括没食子酸， 1,2,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,3,6-四氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖， 1,2,4,6- 四氧 - 没食子酰基 - -D- 吡喃葡萄糖， 1,2,3,4,6-五氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，二
5、聚没食子酸， 1,4,6-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，2,4,6- 三氧 - 没食子酰基 -D- 吡喃葡萄糖， 2,3,4,6- 四氧 - 没食子酰基 -D- 吡喃葡萄糖， 6- 氧- 二聚没食子酰基 -1,2,3-三氧 -没食子酰基 - -D-吡喃葡萄糖，槲皮素 -3-氧 - -L-吡喃鼠李糖，槲皮素 -3-氧 -(2- 氧 -没食子酰基 )- -L- 吡喃鼠李糖。这些多酚类物质有的具有较强的抗脂质过氧化活性，有的具有很强的抗毒肝素活性。【 3】 2.2.2 有机酸类 用硅胶柱层析从白蔹的乙醇提取物中分离得到脂肪酸三十烷酸和二十八烷酸。邹济高分离得到十六烷酸和富马酸。此外，白蔹
6、还含有酒石酸， 龙脑酸等。 2.2.3 三萜、甾醇及其苷类 用硅胶柱层析从白蔹乙醇浸膏的乙酸乙酯提取物中分离得到 -谷甾醇、豆甾醇和豆甾醇 - -D- 葡萄糖苷。邹济高等 4分离得到羽扇豆醇。 2.2.4 其 他 白蔹中的蒽醌类主要有大黄素甲醚、大黄酚和大黄素等。 Lee 等用活性追踪法，从白蔹的甲醇提取物中分离得到具有抗肿瘤活性的 momordins，包括 momordin I， Id 和 Ie。白蔹中还含有卫茅醇、淀粉和黏液质等。【 4】 3 抗菌机理 抗菌剂的抗菌作用 , 一般是指抗菌剂对微生物的生命活动所产生的不良影响和后果。这种不良影响和后果最集中的表现就是影响微生物的生长、繁殖以至
7、死亡。也就是说抑制微生物的生长与繁殖或杀死微生物的作用。抗菌剂和微生物之间的关系 ,可以看作微生物与环境关系 ,特别是对微生物有毒性的环境 关系。抗菌作用机制有以下几个方面 : ( 1 )干扰细胞壁的合成。细菌细胞壁的重要组分为肽聚糖 ,抗菌剂对细胞壁的干扰作用 ,主要是抑制多糖链与四肽交联的连结 , 从而使细胞壁失去完整性和对渗透压的保护作用 , 损害菌体而死亡。 ( 2 )可损伤细胞膜。细胞膜是细菌细胞生命活动的重要结构部分 ,因此当细胞膜受损伤、破坏时 ,将导致细菌死亡。 ( 3 )抑制蛋白质的合成。蛋白质的合成需要活化的氨基酸 , 且在各种酶参与下在核糖体上完成。抑制、阻碍和改变其中任
8、何一组结构或其合成环节之一 , 都能导致蛋白质合成过程变更、停止 ,使细 菌死亡。 ( 4 )干扰核酸的合成。总的说是阻碍遗传信息的复制 , 包括 DNA、 RNA 的合成以及按DNA 模板转录 mRNA 等 。【 5】 无机抗菌剂的抗菌机理是抗菌剂缓慢释放出的银、铜、锌等离子作用在细菌细胞膜上。高浓度时 ,金属离子穿透细胞膜 ,与细胞质中的蛋白质的活性中心结合 ,使细胞死亡或丧失分裂增殖能力 ;低浓度和极低浓度时 ,金属离子吸附在细胞膜上 ,阻碍细菌对氨基酸、尿嘧啶等生长必需的营养物质的吸收 ,从而抑制细菌的生长。金属离子抗菌剂、季胺盐的正电荷还吸引细菌细胞膜表面的负电荷 ,阻止细菌的移动
9、, 使其失去营 养而死亡 , 或细胞变形破裂因内容物渗出而死亡。 植物内生真菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活在健康植物组织或器官内部的并不引起宿主植物出现明显病害症状的真菌 1,2。植物内生真菌是一个巨大的活性物质资源库 ,目前从植物内生真菌中探寻新型活性物质日益成为研究热点 ,对于植物内生真菌的开发 ,从中寻找新的抗菌活性物质无论是在医药工业、农业还是在食品工业等方面都有着巨大的潜力 3-5。植物内生真菌普遍存在着抗菌活性 ,近年来人们先后从植物内生真菌中发现了多种抗菌活性物质 ,主要有生物碱、萜类、甾体类、黄酮类、 肽类、脂肪族类、酚类和苯丙素类等。【 6】 4 植物内含物提取
10、方法 有关天然产物的提取方法很多 , 常用的溶剂提取法包括浸渍法、渗漉法、水蒸汽蒸馏法、煎煮法、回流法、连续回流法等。近年来又出现了破碎提取法、超声波提取法、微波提取法、超临界萃取法等新方法。同一种提取方法 , 不同的提取溶剂提取的效果存在差异 , 一般采用系统溶剂进行活性物质的提取 , 包括溶剂连续提取和溶剂平行提取 , 前者可以使植物中活性成分不造成漏筛 , 后者能确定最佳的提取溶剂。林捷等分别用乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚、乙醚在室温下浸提柚皮提取物 , 结果表明用乙酸乙酯提取物抑菌力最强。王维华等用水、95% 乙醇、丙酮提取连翘中抗菌有效成分 , 以 95% 乙醇的提取物抑菌最强。提取
11、中可加入提取辅助剂如酸、碱、表面活性剂、纤维素酶等提高提取效能 , 增大有效成分的溶解度 , 增加有效成分在提取过程中稳定性及除去或减少某些杂质。 N huyen V an Chuyen 等从 Kumaza 提取活性物质时加入一定量的纤维素酶 , 结果可增加提取物的抗菌活性 41 。同时提取效能还与溶剂的比例、提取时间、提取温度等有关。【 7】 5 抗菌性检测 薄层层析 -生物自显影法 (TLC-Bioautography)是近年来应用的一种将薄层层析和生物活性测定相结合的抗菌活性物质检测方法 7-9。利用薄层色谱的分离能力将少量混合物 (如植物提取物、微生物代谢产物等 )在薄层板上通过展开剂
12、展开后 ,使薄层板与含有供试微生物的培养基相接触 ,在一定条件下培养一段时间后 ,非活性部位会被生长出的供试微生物所覆盖而呈现背景色 ;活性部位由于抗菌成分的存在 ,指示微生物的生长受到抑制而呈现抑菌斑点 ,这样就可以初步了解混合物抗菌活性成分的相对极性 ,为活性单体化合物的分离提供依据。采用 TLC-生物自显影法检测植物内 生真菌提取物中抗菌活性成分鲜见报道 7,本文在 TLC-生物自显影的基础上结合细胞活力 MTT 测定方法 ,对种滇重楼内生真菌菌液和菌丝正丁醇提取物中抗菌活性成分进行了检测 ,为进一步分离纯化内生真菌中抗菌活性成分提供了依据。【 8】 生物自显影是一种在色谱上显示抗菌活性
13、的方法 , 已广泛地用于寻找新的抗菌剂。几乎所有已知方法都是以琼脂扩散技术为基础 , 抗菌化合物通过扩散从色层板转移到已接种的琼脂板上 , 再通过适当活休染色 , 使抑制环显示出来。该程序具有某些缺点而且需要使用合适的微生物仪器。本文介绍一种在薄层上简易、道 接检测抗菌化合物的生物自显影方法。 检测原理把悬浮在肉汤里的微生物加到经展开过的薄层板上 , 置潮湿空气中孵育。然后通过脱氢醉活性测定剂即一种四锵盐显示抑制环带。由于活性细菌的代谢作用把四婚盐转变成为相应的深色甲睹 , 因此抗菌化合物对有色背景呈现亮点。 测定方法选枯草杆菌和大肠杆菌分别代表革兰 氏阳性和阴性菌 , 悬浮在肉汤培养基内。将
14、已展开过的薄层板仔细用电吹风吹干 , 完全除去溶剂 , 再用稀释好的细菌悬浮液均匀涂布在薄层板料。上 , 置塑料箱内孵育过夜。然后喷洒对一碘硝基四唑紫水溶液二 , 再在 37孵育 24h。 即可观察结果。 在上述条件下 , 检测重现性很好。同时存在的或普通的无活性、弱活性化合物将不干扰少量具有良好抗菌活性化合物的测定。【 9】 6 结论与展望 目前对白蔹化学成分的研究主要集中在三氯甲烷、乙酸乙酯提取的极性较小的部分，分离到的化合物多为酚类、甾醇类等。以后应加强研究极性较大的甲醇提取部分的成分，以得到新的活性物质。近年，白蔹的药理活性研究在逐步深入。除了抗菌作用，许多新活性如抗肿瘤活性、免疫调节
15、活性及抑制毛发生长作用等不断被发现。但是，多数药理活性研究还处于初级阶段，其作用的物质基础尚未阐明，需进一 步研究。白蔹的抗肿瘤活性尤其值得关注，从植物中寻求抗肿瘤活性物质现已成为抗癌药物的重要研究内容。除了药用价值，白蔹还具有嫩白肌肤的功效，已作为美容护肤品添加剂使用，它在化妆品工业中有着广泛的应用前景。白蔹在我国分布较广泛，对其药理作用及有效成分进行系统分析，可望开发出新的治疗或保健药品。【 10】 参考文献 【 1】植物提取物体外抑菌试验的研究 胡建军 刘利林 黄金奎 余淑珊 许宗运 塔里 木农垦大学学报 2004 年 6 月 第 16 卷 第 2 期 【 2】白蔹的化学成分 赫军，羡冀
16、，宋莹莹，宋少江 沈阳药科 大学学报 2 0 0 8 年 8 月 第 25 卷第 8 期 【 3】植物源抗菌、杀菌活性物质研究进展 (综述 ) 吴新安，花日茂，岳永德，朱有才 安徽农业大学学报 , 2002, 29 (3) : 245 249 【 4】白蔹的化学成分 ( ) 赫军，羡冀，宋莹莹，宋少江 沈阳药科大学学报 2009.03 第 26卷第 3期 【 5】中草药提取物的体外抑菌活性研究 张显忠，郭爱军 2 , 李艳玲，苗 苗 中华医院感染学杂志 2006 年第 16 卷第 5 期 【 6】 Sw ain T. Secondary compounds as p ro tect ive a
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