1、本科生毕业设计（论文）开题报告毕业设计（论文）题目： 青蒿素的提取分离及鉴定 学生姓名： 乔莹莹 学号： 2011810735 分 院： 理工分院 班级： 应化 1101 指导教师： 王磊 职称： 讲师 填表日期： 2015 年 1 月 2 日 杭州师范大学钱江学院教学部制一、 选题的背景和意义青蒿为菊科植物黄花蒿（Artemisia annua L.)的干燥地上部分 1，青蒿素（Artemisinin C 15H22O5）是从青蒿中提取分离得到的一种无色结晶。青蒿素是继氯喹、乙氨嘧啶、伯喹和磺胺后最热门的抗疟疾特效药，尤其对脑型疟疾和抗氯喹疟疾具有速效和低毒的特点，已成为世界卫生组织推荐的药
2、品。青蒿素在原植物青蒿中含量很低，一般只有 7%左右。青蒿素作为抗痕疾骨干药“奎宁”的替代药物,市场潜力巨大。因此,对青蒿素的提取和应用技术引起了国内外许多研究者的极大关注 2。目前,提取青蒿素的工艺基本成熟,已经工业化生产,但提取效率低,青蒿原料浪费严重,成本偏高 3。同时已有多种测定青嵩素的方法见于文献,但都存在着一定的缺点,如分析速度慢,成本高,过程复杂等，为了使青蒿素能够快速、高效的扩散到提取介质中,得到较高的提取效率,为了找到一种迅速、简便、灵敏度高的青蒿素测定方法,故本实验采用正交试验研究了超声时间、超声功率、超声温度和提取溶剂量对提取的影响，确定了最佳提取条件，提取所得滤液经减压
3、浓缩，除去杂质，重结晶，干燥精制后的青蒿素纯品。1 青蒿及青蒿素1.1 青蒿青蒿（Artemisia annua L.)又称黄花蒿，为常用的中草药之一。青蒿素（artemisinin ,QHS)是中国科学工作者从青蒿中提取、分离、鉴定的一种新型抗疟药，因其结构特殊，疗效高，而毒性很低，引起国内外的重视 4-5。青蒿广泛分布于中国南北各地，资源十分丰富。由于青蒿品种、种植条件、种植技术等的差异，从而导致青蒿中青蒿素含量的不同 6。一般南方地区的青蒿素含量高于北方，以南岭山脉、武夷山脉以南为高含量区，尤其是以广西、广东以及海南北部最高。其最早出现于马王堆三号汉墓出土的帛书五十二病方,而后在大观本草
4、 、 神农本草经 、 本草纲目均有收录，主要用于治疗消暑、泻热、止汗等。黄花蒿的化学成分可分为挥发性和非挥发性成分。挥发性成分主要为挥发油,是一种淡黄色澄明的油状液体。经过研究发现,挥发油中主要含蒿酮、蒲烯、桉油精、左旋樟脑、异蒿酮、丁香稀等 16种化学成分。非挥发性成分中主要含有有青蒿素、青蒿甲素、乙素、丙素、青萬酸、香豆素、黄酮、豆留醇、谷留醇等 7。1.2 青蒿素青蒿素为无色针状结晶，易溶于丙酮、乙酸乙酯，在乙醇、乙醚中溶解，微溶于冷石油醚，几乎不溶于水 8。对热不稳定，易受潮、热和还原性质的影响而分解 9。青嵩素(Artemisinin)是继乙氨啼唆、氣喳、伯喹之后最热的抗培特效药,尤
5、其是对于脑型拒疾和抗氯喹培疾,青蒿素具有速效和低毒的特点,曾被世界卫生组织称做是“世界上唯一有效的拒疾治疗药物” 。它是一种含有过氧基的新型倍半蔽内酷化合物,分子式C15H22O510。1.3 青蒿素的作用青蒿素的主要作用有抗疟疾、抗肿瘤、抗真菌和其他药理作用。青蒿素的抗症疾作用机理主要在于在治疗拒疾的过程通过青蒿素活化产生自由基,自由基与症原蛋白结合,作用于痕原虫的膜系结构,使其泡膜、核膜以及质膜均遭到破坏,线粒体肿胀,内外膜脱落,从而对症原虫的细胞结构及其功能造成破坏,且细胞核内的染色质也受到一定的影响 11;青蒿素能够致使乳腺癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞等多种癌细胞的调亡,对癌细胞的生长
6、具有显著的抑制作用，青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用主要是依靠诱导细胞的调亡而实现的；青蒿素的査粉剂和水煎剂对炭疽杆菌、表皮葡萄球菌、白喉杆菌均有较强的抑菌作用,对结核杆菌、金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌等也具有一定的抑菌作用。目前青蒿素联合治疗已成为世界卫生组织推荐的治疗疟疾的首选方法 12。2 实验运用技术2.1 超声波提取法超声提取法是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解，显著提高提取效率的提取方法。主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用。当大能量的超声波作用于介质时，介质被撕裂成许多小空穴，这些小空穴瞬时闭合，并产生高达几千个大气压的瞬间压力，即空化
7、现象。超声空化中微小气泡的爆裂会产生极大的压力，使植物细胞壁及整个生物体的破裂在瞬间完成，缩短了破碎时间，同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解，从而显著提高提取效率。超声波提取法用于青蒿素的提取有以下优点 13：无需加热，耗能低，提取时间短，溶剂用量少，溶剂消耗低，提取物的结构没破坏，效果好，操作简单、快捷、方便。但此方法的缺点是噪声大,实验过程中产生大量的热能,有效能源利用率低。2.2 硅胶薄层色谱法薄层色谱法是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术。这是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生
8、物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。利用青蒿素化学性质中的显色反应，对青蒿素进行检测。硅胶薄层色谱法用硅胶作支持剂，其主要原理是吸附力与分配系数的不同，使混合物得以分离。当溶剂沿着吸附剂移动时，带着样品中的各组分一起移动，同时发生连续吸附与吸作用以及反复分配作用。由于各组分在溶剂中的溶解度不同，以及吸附剂对它们的吸附能力的差异，最终将混合物分离成一系列斑点。如作为标准的化合物在层析薄板上一起展开，则可以根据这些已知化合物的 Rf 值对各斑点的组分进行鉴定，同时也可以进一步采用某些方法加以定量。2.3 紫外分光光度法可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，
9、而产生化合物的可见紫外吸收光谱。基于物质对光的选择性吸收的特性而建立分光光度法或称吸收光谱法的分析方法。它是以朗伯比耳定律为基础。 青蒿素由于没有荧光发色基团,.其在波长 205nm处有末端吸收,但是不能直接采用紫外分光光度法检测,需经过前处理形成稳定的,有可见紫外吸收的新化合物以进行检测。中国.药典2010版二部的相关项下通过进行碱处理后在波长 292nm处有明显的紫外吸收,用紫外分光光度法测定 Q292,达到对青蒿素进行含量测定的目的。张海荣 14等用浓度为 0.2%的 NaOH溶液对不同产地青蒿中提取的青蒿素甲醇溶液进行处理,在 50的水浴中反应30min,生产的 Q292化合物在波长
10、292nm处有明显的紫外吸收,并对青蒿素的含量进行了测定。3 实验条件选择3.1 实验条件的选择本实验对超声时间、超声功率、超声温度、提取溶剂用量这四个因素设计正交实验,确定各个因素对青蒿素提取率的影响。3.2 溶剂选择不同溶液对青蒿中青蒿素以及其它成分的溶解度不同，分别以 60mL乙醚、氯仿、正己烷、石油醚(30 60 )为溶剂，在 50 水浴下搅拌提取 2h，结果发现氯仿和乙醚的吸光度均较高；石油醚、正己烷的吸光度则较小。其中氯仿提取产物中杂质峰最强，乙醚次之，此两种溶剂的杂质峰远远大于石油醚。正己烷虽然杂质峰较弱，但提取率较石油醚低。所以 4种溶剂中石油醚为较适宜的溶剂。3.3 原料粒度
11、的影响据研究认为青蒿素主要存在于植物细胞的腺体中 ，属于胞内次级代谢产物。提取介质首先从原料颗粒外部扩散进入颗粒内部和细胞内溶解青蒿素，由于内外青蒿素浓度差异，青蒿素再扩散进入主体溶液，因而原料颗粒大小对提取效率存在影响。结果发现粒度超过 60目以后，粒度影响逐渐不明显。因为过细的原料不仅增加原料预处理成本，而且还会给后续的液-固分离带来困难，实验操作过程中选 60目为宜。二、 研究目标与主要内容（含论文提纲）研究目标：研究运用青蒿素提取分离及鉴定的实验条件的影响因素，通过数据分析，确定最佳的提取条件，提高提取率。主要内容：本实验通过对超声时间、超声功率、超声温度、提取溶剂用量这四个因素设计正
12、交实验，对各种因素进行优化，得出青蒿素的最佳提取条件。将提取出的青蒿素粗品用丙酮溶解后，硅胶拌样，干法上柱，用洗脱剂洗脱硅胶柱，收集各流分，经硅胶薄层色谱检查，合并有效成分，浓缩至少量体积后静置结晶。青蒿素由于没有突光发色基团,其在波长 205nm处有末端吸收,但是不能直接采用紫外分光光度法检测,需经过前处理可以形成稳定的,有可见紫外吸收的新化合物以进行检测。本实验依据青蒿素在碱性条件下生成青蒿素衍生物,生成的化合物 Q292在波长 292mn处有较为强烈的紫外吸收,通过其吸光度对青蒿素的含量进行测定。提纲：1 引言1.1 青蒿简介1.2 青蒿素简介1.3 青蒿素的作用2 实验运用技术2.1
13、超声波提取法2.2 硅胶薄层色谱法2.3 紫外分光光度法3 青蒿素的测定方法3.1 定性分析3.2 定量分析4 总结及分析三、 拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等本实验以干枯的青蒿叶为原料，将青蒿叶捣碎，进行超声提取。将提取出的青蒿素粗品用丙酮溶解后，硅胶拌样，干法上柱，用洗脱剂洗脱硅胶柱，收集各流分，经硅胶薄层色谱检查，合并有效成分，浓缩至少量体积后静置结晶。根据青蒿素在碱性条件下生成青蒿素衍生物,生成的化合物 Q292在波长 292mn处有较为强烈的紫外吸收,用紫外分光光度计对青蒿素的含量进行测定。本实验主要分为 7步：1.捣碎青蒿叶2.超声提取3.减压浓缩4.硅胶纯化5.定
14、性分析6.定量分析7.数据分析研究方法和手段文献法：是根据一定的研究目的或课题，通过调查文献来获得资料，从而全面地、正确地了解掌握所要研究问题的一种方法。文献研究法被子广泛用于各种学科研究中。实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果联系的一种科研方法。主动操纵实验条件，人为地改变对象的存在方式、变化过程，使它服从于科学认识的需要。实验方案1.提取将 50克干燥青蒿叶捣碎后置 1000ml分液漏斗中，依次用 400,300,200ml丙酮分别超声提取，抽滤，滤液合并后与 3540中减压浓缩，得油状青蒿素粗品提取物。将 95%乙醇 45ml加入到 100ml烧杯中，与 50水浴中
15、溶解青蒿素粗品提取物，冷藏过夜；过滤，滤渣用少量冷乙醇洗涤一次，合并滤液，减压浓缩，得青蒿素粗品。2.纯化称取硅胶（200-300 目）20 克装柱，青蒿素粗品用丙酮溶解后，硅胶拌样，干法上柱，分别用 300ml石油醚和 950ml石油醚-乙酸乙酯（98:2)作为洗脱剂快速洗脱硅胶柱，收集各流分（30ml/流分） 。经硅胶薄层色谱（TLC）检验，石油醚-乙酸乙酯（85:15)为展开剂，5%香草醛-浓硫酸作为显色剂，电吹风加热呈蓝紫色斑点，合并有效成分，浓缩至少量体积后静置结晶。过滤，滤渣以少量石油醚洗涤至白色，干燥得青蒿素纯品。3.显色反应鉴定样品溶液：自制青蒿素少量，以适量三氯甲烷溶解。展开
16、剂：石油醚-乙酸乙酯（85：15） 。用毛细管吸取样品溶液适量，点于硅胶薄层后，用上述展开剂展开。展开剂吹干后，喷洒 5%香草醛-浓硫酸，可观察到黄色斑点，加热后变成蓝紫色斑点。4.标准品溶液的制备精密称取青蒿素标准品 10mg于 100ml容量瓶中，用乙醇定容。分别吸取0、2、4、6、8、10ml 于 50ml容量瓶中，加入乙醇至 10ml，用质量分数为 0.2%的氢氧化钠溶液定容，置于 50水浴中反应 30min，冷却至室温后，用紫外分光光度计测定波长在 292nm处的吸光度。5.样品溶液的制备提取方法提取所得的青蒿提取液取出过滤。用旋转蒸发仪减压蒸干滤液，用乙醇溶解后转移至 10ml的容
17、量瓶中，并用乙醇定容。精密吸取 2.5ml提取液于 50ml容量瓶中，加入乙醇至 10ml，用质量分数为 0.2%的氢氧化钠溶液定容，置于 50水浴中反应 30min,冷却至室温后，用紫外分光光度计测定波长在 292nm处的吸光度。6.数据处理（1）根据标准曲线方程，带入样品中的吸光度，求得样品浓度，根据体积求得青蒿素含量。（2）比较不同的提取条件，哪一种条件下提取的青蒿素的含量最高。（3）再获得最佳提取条件下青蒿素的含量，取得最终的最佳提取条件。四、中外文参考文献目录（理工科专业应在 10 篇以上，文科类专业应在15 篇以上，其中外文文献至少 2 篇。 ）1 中华人民共和国药典委员会. 中国
18、药典( 一部)M. 北京:化学工业出版 社,2005,137-138.2 李伟,石崇荣 .青蒿素研究进展J.中国药房,2003,14(2):118119.3 周浓 , 段意梅, 陈强. 青蒿素含量测定方法改进及黄花蒿植物质量评价J. 时珍国医国药,2008,19(4):911.4 Tu Youyou.The discovery of artemisinin(qinghaosu) and gifts from Chinese medicineJ. Nature Medicine,2011,10(17):1217-1220.5 国家药典委员会 . 中华人民共和国药典(二部)S. 中国医药科技出版社
19、,2010,420:1156.6 向文, 李琳 , 刘吉华等. UPLC-UV 法测定不同产地青蒿中青蒿素的含量 J. 中国野生植物资源,2012,31(4):28-31.7 杨云, 张晶 , 陈玉婷等.天然产物化学成分提取分离手册M. 北京:中国中医药出版社,2003,4.8 中华人民共和国药典委员会. 中国药典(二部)M. 北京:化学工业出版社,2005,309-310.9 王宗德, 孙芳华. 青蒿素理化性质及其测定方法的研究进展J. 江西农业大学学报,1999,21(4):606-611. 10 韦记青, 蒋运生, 唐辉等. 黄花蒿叶矿质元素含量的研究J. 安徽农业科学,2008, 36
20、(22) : 9597- 9598.11 郑全芳, 杨志刚, 孙红祥. 青蒿素及其衍生物药理作用的研究进展J. 中国兽药杂志,2006,40(1):40-44.12 GRAHAM IA, BESSER K, BLUMER S.Loci affecting yield of the antimalarial drug J. Science,2010,2(327):328-330.13 葛发欢, 陈列等. 黄花蒿中青蒿素的超临界二氧化碳流体提取工艺研究J. 中国医药工业杂志,2000,31(6):250-253.14 王玉春, 吴江, 闭静秀等. 青蒿素提取条件研究J. 中草药,2000,31(6
21、):421-423.五、研究的整体方案与工作进度安排（内容、步骤、时间）研究的整体方案如下：相关文献的查阅与实验方案的制定。 2014.11.10 至 2014.11.25实验的前期准备与探索实验，查找相关的实验条件 2014.11.27 至 2014.12.10实验方法的对比，优化工艺条件 2014.12.15 至 2015.01.10数据处理，毕业论文的初稿撰写 2015.01.20 至 2015.02.15毕业论文的修改及最终定稿 2015.02.28 至 2015.03.20系统验收，提交毕业论文 2015.04.01 至 2015.04.156、研究的主要特点及创新点紫外分光光度法的
22、原理是可见光、紫外线照射某些物质，主要是由于物质分子中价电子能级跃迁对辐射的吸收，而产生化合物的紫外吸收可见光谱。基于物质对光的选择性吸收的特性而建立分光光度法的分析方法。它是以朗伯-比尔定律为基础的。它的仪器简单、操作方便、灵敏度高、有一定的选择性。广泛地应用于物质的常量、微量及痕量组分的定量分析，已作为现代分析化学中“常规武器”的一种。七、指导教师审核意见： 从开题报告完成情况来看，该生完成了研究目标与主要内容的设定；拟采取的研究方法、研究手段及技术路线、实验方案等；中外文参考文献目录；研究的整体方案与工作进度安排；研究的预期目标及主要特点及创新点都做了详细的论述，而且对其有了比较深入的理解。其中技术步骤叙述比较详尽，基本上完成了论文的最初目标。论文整体组织逻辑感较强，结构清晰，内容很详实。同意开题。指导教师签名： 年 月 日
