1、1国家标准水稻中转基因成分测定 膜芯片法Detection of Genetically Modified Components in RiceMembrane-based Gene-chip Method编制说明国家标准起草组二一五年一月2国家标准水稻中转基因成分测定膜芯片法编制说明 1.概况：1.1任务来源：本国家标准的制定是根据国家标准委关于下达 2014年第一批国家标准制修订计划的通知 （国标委综合201467 号）的通知，项目计划编号“20140381-T-424”,计划执行完成期为 2015年。标准起草工作组在前期研究、试点验证、修改完善等工作基础上，完成该项标准的研制工作。1.2
2、标准起草单位和标准主要起草人：本标准由四川华汉三创生物科技有限公司、中国标准化研究院共同起草。1.3工作概况：在转基因成分的测定中，已制定一系列国家标准：GB/T 19495.1-2004 转基因产品检测 通用要求和定义GB/T 19495.2-2004 转基因产品检测 实验室技术要求GB/T 19495.3-2004 转基因产品检测 核酸提取纯化方法GB/T 19495.4-2004 转基因产品检测 核酸定性 PCR检测方法GB/T 19495.5-2004 转基因产品检测 核酸定量 PCR检测方法GB/T 19495.6-2004 转基因产品检测 基因芯片检测方法GB/T 19495.7-
3、2004 转基因产品检测 抽样和制样方法GB/T 19495.8-2004 转基因产品检测 蛋白质检测方法这些标准包括：转基因检测通用定义、通用要求、实验室技术要求、抽样、制样、核酸提取、核酸定性 PCR检测、核酸定量 PCR检测、基因芯片检测和蛋白检测。基于核酸的检测方法和基于蛋白的检测方法是目前检测转基因的两种主要方法。传统的转基因检测技术（PCR 技术、ELISA 检测技术）和早期的转基因生物芯片检测方法都很难满足批量大、高效快速的检验要求，且存在易污染、假阳性高、成本高的缺点。相对于现行标准中公布的检测技术，膜芯片方法可以3在进行多指标并行检测的同时，实现快速、灵敏、方便、廉价、准确、
4、高通量、自动化、低假阳性和可视化的转基因成分测定。在制定本标准时参阅了国内外样品制备技术、DNA 的提取、核酸杂交及相关的国家标准、应用及测定有关的技术文献和分析方法，确定本方法的基本原理和试验技术。2.背景及标准概况：2.1转基因水稻概况及当前主要转基因成分测定方法：水稻是我国的主粮农作物，每年消费量近两亿吨。随着转基因技术在农业产业中的应用，多种抗虫基因（Cry1Ab, Cry1Ac, Cry1Ab/Ac等）和抗除草剂基因（BAR 等）被用于转基因水稻的研发。1998 年，我国育成了首例转基因抗虫水稻，之后多个转基因水稻品系相继被研发出来。根据国内及国际的转基因农作物发展态势，我国未来一段
5、时间内很可能大规模推广转基因水稻。转基因水稻产品很可能在未来全球市场中大量涌现。目前转基因产品的潜在风险仍无法定论，多个国家制定了自己的法律法规对转基因产品进行监管。我国建立了转基因标记管理制度，并于 2004年发布相应的转基因检测国家标准，但这时期基于 PCR技术、ELISA 等技术的标准都建立在检测少数转基因产品的基础上，对近期产业化的转基因植物很难鉴别，尤其针对具有多种外源转基因片段的转基因水稻，更无便捷有效的检测方法。传统转基因产品的检测技术主要包括基于蛋白的检测方法和基于核酸的检测方法。酶联免疫吸附法（ELISA）、免疫试纸条和 Western杂交等方法是目前主要的基于蛋白的检测方法
6、，其共同特点是需要通过一定的处理步骤从样品中释放出目标蛋白（抗原），然后利用抗体特异性的结合抗原蛋白，最后通过酶标或金属标偶联抗体与抗原抗体复合物结合，从而产生可检测的信号，该类方法的优点是检测速度快，缺点是检测灵敏度相对较低，并且需要制备高特异性抗体，同时检测容易受到多种因素的影响，出现假阳性。而基于核酸的检测方法是目前最普遍、最准确的转基因检测技术，检测方法主要包括 PCR（聚合酶链式反应）技术和基于分子杂交的基因芯片技术。目前仍以 PCR技术应用最为广泛，其常用的技术方法包括普通定性 PCR、巢式 PCR、多重 PCR、荧光定量4PCR等方法。普通定性 PCR方法检测效率低，尤其检测多基
7、因对象时更加费时费力；巢式 PCR可以显著的提高检测灵敏度，但步骤较繁琐，同样存在检测效率的问题；多重 PCR方法可以在一个反应中同时检测多个基因，实现多指标的并行检测，但常规的电泳检测结果很难判断，容易出现假阳性和假阴性结果；荧光定量 PCR方法灵敏度高，但其成本高，并行检测的指标少，并且需要特殊检测仪器。基因芯片也是常用的转基因产品检测技术，目前一般采用玻璃片作为固相支持物，杂交点荧光强度作为读出信号，其操作相对复杂，检测成本高，实验过程需要相应的特殊仪器，如点样仪和激光共聚焦检测系统等。因此目前需要开发一种快速、方便、灵敏、廉价、可视化、自动化和高通量的转基因检测技术。2.2膜芯片技术及
8、应用：膜芯片技术是一种基于膜如硝酸纤维素膜或尼龙膜等的基因芯片技术。其工作原理是首先将人工合成的碱基序列即基因探针固定到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，根据碱基互补的原理，利用基因探针到基因混合物中识别特定基因。膜芯片技术通常和多重 PCR技术联合使用，即通过多重 PCR同时扩增多个靶标基因，然后将 PCR产物和已固定有产物相应探针的膜芯片杂交，这样 PCR产物中的靶基因序列就会和膜上的探针杂交，经洗涤去除未结合的 DNA样品，由于待测 PCR产物的 DNA上带有分子标志，如生物素等标志，结合了待测 DNA的探针点就偶联上了分子标志物，再经过相应的显色反应就能读取对应的杂交信号。由于支持膜上可以同时固
9、定多个探针，多重 PCR反应亦能同时扩增多个靶标基因，这样基于多重 PCR反应的膜芯片技术就具有了较高的通量，可在单个实验中同时检测多个指标，且结果可靠。另外由于整个实验只是用到普通 PCR反应试剂，硝酸纤维素膜或尼龙膜，外加极少量人工合成的基因探针，成本十分低廉。如果再结合上自动的膜芯片杂交仪器，整个系统即实现了快速、准确、低成本和自动化。正是由于上述优点，膜芯片技术在各个领域中均有广泛的应用。在临床检测中，膜芯片技术主要用于病原体快速筛查、耐药性突变位点分析和遗传疾病基因快速核酸检测。比如利用膜芯片法进行乙肝临床诊断，快速鉴定分枝杆菌菌种和耐药结核分枝杆菌基因型，诊断 -地中海贫血等。在农
10、业和畜牧业中，5膜芯片法被用于物种的快速分类鉴定，比如对不同种类的海参进行快速准确的鉴定。在环境检测领域膜芯片被广泛用于环境微生物的监控，比如水体中赤藻类的快速检测，饮用水中沙门氏菌和大肠杆菌等病菌的检测等。在现代农业中，膜芯片技术可以被用于农作物的品种鉴定，寻找高产量、抗病虫、抗干旱、抗冷冻的种子资源，也可以用于商品检验检疫及转基因产品的监测等。将膜芯片技术应用于转基因水稻及其相关制品的检测是合适且可行的。3.标准制定原则：国内文献报道：杨立桃，赵志辉，丁嘉羽等发表于中国食品卫生杂志 ，2005年第 17卷第 2期“利用实时荧光定量 PCR方法分析转基因水稻外源基因拷贝数” ；王渭霞，赖凤香
11、，洪利英等发表于中国测试 ，2009 年 11月第 35卷第 6期“应用多重 PCR 技术快速检测抗虫转基因水稻” ；王紫萱,易自力,王志成等发表于遗传 HEREDITAS ，2007 年 4月第 29卷第 4期“带 npt-基因转基因水稻快速检测技术的建立” ；陈春燕，赵颖文，李晓发表于中国农学通报 ，2013 年第 29卷第 27期“转基因水稻发展态势研究” ；陈睿,苏军发表于福建农业学报 ，2006 年第 21卷第 4期“转基因水稻环境安全研究进展” ；李伟丰,杨朗发表于生物技术通报 ，2006 年第 5期“转基因水稻检测方法的研究进展” 。从上述文献中可知：测定水稻样品中转基因成分的方
12、法，目前多数采用荧光定量 PCR和 PCR电泳法，基因芯片法正在探索之中。与传统方法相比，膜芯片方法通过样本处理、核酸抽提、多重 PCR扩增、膜芯片反向斑点杂交等实验过程，当天可获得检测结果，大大缩短了检验周期。在检测项目方面，一张膜基因芯片可以同时对多种外源基因并行检测，提高了检测通量。在检测结果判别方面，即可以进行肉眼可视化的结果判读，也可以配置芯片识读仪，自动扫描记录检测结果。在检测效率方面，通过配置全自动膜芯片杂交检测仪，可以实现同时对多个样本的全自动高通量检测，一次实验即可得出全部结果，比传统方法简便、快捷、更节省人力。膜芯片在转基因水稻成分测定中的应用尚处于起步当中。因膜芯片法具有
13、快速、简便、廉价、灵敏度高、假阳性率低、高通量、自动化等特点，因此，6本标准方法的制定，对于膜芯片方法的推广，提高检验检疫工作效率，推动我国对外经济贸易的发展具有重要意义。转基因水稻检测膜芯片的研制和检测标准化将为转基因水稻产品的有效监管提供可靠依据。4.工作过程4.1：成立草案组并完成标准框架2014年 10月初成立起草组，确定起草组负责人。充分调研当前转基因成分筛检技术，结合我国现阶段转基因检测状况和在实际应用中遇到的问题，并综合现有标准和项目的研究成果，经与起草组成员研讨，形成标准框架，并制定计划实施方案。4.2：关键技术验证和标准草案形成起草组在充分调研当前主要转基因成分的基础上，确定
14、目标待检转基因序列，重点选取主要抗虫和抗除草剂基因及其常见启动子、终止子序列。之后依次完成标准样本选取、关键技术验证、技术改进和优化、抽样检验、方案修正等方面工作，对标准草案的技术内容进行验证，并根据实验验证结果，进一步完善了标准技术内容。经过起草组成员反复研讨和修改，于 2014年 11月初形成标准草案。4.3：形成标准征求意见稿起草组先后组织召开了 2次研讨会，对标准草案内容进行反复讨论，特别针对膜芯片法筛检的核心技术内容，讨论形成统一意见，并邀请相关领域专家审阅标准草案，在反复优化的基础上，于 2014年 12月底形成了征求意见稿。4.4：论证意见并形成送审稿起草组将于广泛征求意见后再次
15、召开会议，反复论证公开征求的各类意见，研讨采纳与否以及理由，并进一步对标准文本进行了完善和修改，最终形成了送审稿。5.标准制定依据：7水稻转基因方面，目前研究和推广最多的是耐除草剂转基因品系（LLRICE06 和 LLRICE62等）和抗虫转基因品系（如华恢 1号(TT51)，Bt 汕优63（Bt63）等） 。美国于 1999年批准了 Bayer CropScience公司研发的耐除草剂水稻 LLRICE06和 LLRICE62的商业化种植,加拿大和墨西哥批准进口,可以食用，LLRICE06 和 LLRICE62转基因品系中含有一个或多个草丁膦乙酰转移酶基因（BAR）基因拷贝，该基因的启动子和
16、终止子分别是花椰菜花叶病毒 35S启动子（CaMV35S-P）和花椰菜花叶病毒 35S终止子（CaMV35S-T） 。2009 年 8月 17日，我国农业部发放了华中农业大学培育的两种转基因水稻“华恢 1号”和“Bt汕优 63”的生物安全证书，这两个品系都中含有 Bt融合型杀虫蛋白基因Cry1Ac/Cry1Ab和人工合成的农杆菌胭脂碱合成酶基因(nos)终止子。根据目前水稻转基因情况，以及可获得转基因水稻标准品的实际情况，确定了 6种外源转基因序列和 1种水稻內源基因序列（水稻 GOS9基因）作为膜芯片检测指标。7 个指标分别如下：GOS9：（水稻 GOS9基因） ， BAR：（草丁膦乙酰转移
17、酶基因） ， Cry1Ab：（苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cryIA(b)基因） ， Cry1Ac：（苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cryIA(c)基因） ， CaMV35S-P：（花椰菜花叶病毒 35S启动子） ， CaMV35S-T：（花椰菜花叶病毒 35S终止子） ， NOS-3：（胭脂碱合成酶基因终止子） 。5.1转基因标准品：为了验证转基因检测膜芯片的实际检测效果，购买了 2种转基因标准品和1种非转基因标准品，相关信息见表 1和表 2。表 1.转基因标准品订购信息项目 订货号 生产厂家 型号及规格描述 标准品名称1 0306-I5 Bayer CropScience Leaf Tissue
18、 DNA 10 g LLRice622 GBW10073 中国计量科学研究院 5.03% 质量分数种子粉 1 g BT633 0306-D3 Bayer CropScience Leaf Tissue DNA 10 g Non-Modified表 2.转基因标准品转基因成分信息标准品名称 转基因成分LLRice62 BAR, CaMV35S-P, CaMV35S-TBT63 Cry1Ab, Cry1Ac, NOS-38Non-Modified -5.2转基因水稻标准品基因组 DNA含量：采用商品化植物基因 DNA提取试剂盒,提取水稻标准品 BT63的基因组 DNA,使用紫外分光光度计对提取后的
19、 DNA进行定量,相关实验数据列于表 3。表 3.转基因水稻标准品基因组 DNA含量Sample ID ng/L A260 A280 260/280 260/230BT63 72.50 1.450 0.736 1.97 0.806.实验方法介绍：提取转基因样品核酸后，对核酸进行定量。针对 6种外源基因片段和 1种水稻內源基因片段设计引物，以基因组 DNA为模板进行多重 PCR扩增。扩增产物与固定有 7种目标基因特异性探针的膜芯片进行反向斑点杂交，检测结果可以用肉眼直接判断，或是用芯片识读仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。6.1试剂组分：水稻转基因膜芯片法试剂组分和存放条件如表 4所示。表 4.膜
20、芯片法试剂组分名称 主要成分 存放条件多重 PCR即用型预混液 Multiplex PCR Master Mix -20多重 PCR引物预混液 引物组合，每条引物 2M -20无核酸酶灭菌水 超纯水 -20转基因标准品基因组 DNA 基因组 DNA，50 ng/L -20阳性寡核苷酸单链 DNA Positive-Oligo,10M -20去活化液 100 mmol NaOH 室温去活化清洗液 2xSSPE, 0.1% SDS 室温杂交液 2xSSPE, 0.1% SDS 室温杂交清洗液 2xSSPE, 0.5% SDS 室温酶孵育液 2xSSPE, 0.5% SDS 室温碱性磷酸酶标记链霉亲
21、和素 AP-streptavidin 4孵育清洗液 1 2xSSPE, 0.5% SDS 室温孵育清洗液 2 2xSSPE 室温BCIP/NBT显色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑兰（NBT/BCIP） 4膜芯片 固定有核酸探针的膜芯片 室温6.2膜芯片制备：采用微定量喷点式膜芯片点样仪，将各个核苷酸探针(探针浓度 25M)分9布在带负电荷尼龙膜芯片上的特定位置区域。芯片表面包被的探针布局如表B1。杂交阳性对照：PC，监测芯片杂交过程是否正常。内对照：GOS9，指膜芯片上用来质控 PCR扩增过程是否正常的对照，使用水稻特异性内源基因 GOS9扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针
22、。阴性对照：NC，指膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照。一般使用一段与靶标分子序列相近或无关的寡核苷酸作为探针。表 5.水稻转基因检测膜芯片点阵示意图GOS9：（水稻 GOS9基因） ， BAR：（草丁膦乙酰转移酶基因） ， Cry1Ab：（苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白cryIA(b)基因） ， Cry1Ac：（苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 cryIA(c)基因） ， CaMV35S-P：（花椰菜花叶病毒 35S启动子） ， CaMV35S-T：（花椰菜花叶病毒 35S终止子） ， NOS-3：（胭脂碱合成酶基因终止子） ，PC：（阳性对照核酸探针） ，NC：（阴性对照核酸探针） 。6.3 引物序列
23、：表 6.PCR 反应使用的引物序列目标基因 引物名称 序 列扩增片段大小（bp）Forward 5-CGTCTGCGGGAGCGCTATCC-3BARReverse 5-biotin-GTAGAGCGTGGAGCCCAGTC-3168bpForward 5-GACATGAACAGCGCCTTGAC-3Cry1AbReverse 5-biotin-TTGATGGTTGCAGCATCGAA-3164bpForward 5-GTTAGACTCAACAGCAGTGGA-3Cry1AcReverse 5-biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA-3161bp10Forward 5-
24、GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3CaMV35S-PReverse 5-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3144bpForward 5-TGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTT-3NOS-3Reverse 5-biotin-GCGCGCGATAATTTATCCTAGTTT-3113bpForward 5-CCAGATAAGGGAATTAGGGTTC-3CaMV35S-TReverse 5-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3132bpForward 5-GACGATCCGTAGTGGAGC-3GOS9Reve
25、rse 5-biotin-GTAATCGTAGTTGGATTTCCACC-3117bp6.4探针序列:表 7.目标基因探针序列名称 序列 修饰基团BAR 5-CGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCG-3 5-AminolinkerC6Cry1Ab 5-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGGCAAAGGTGGGG-3 5-AminolinkerC6Cry1Ac 5-TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCTTCTGTGACCCCTATTC
26、ACCTCAACGT-3 5-AminolinkerC6CaMV35S-P 5-AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATG-3 5-AminolinkerC6NOS-3 5-TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGC-3 5-AminolinkerC6CaMV35S-T 5-AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAT-3 5-AminolinkerC6GOS9 5-GC
27、CTTTACATACGTTGGCACGGACGGGAATGAACATCTTGCAGGTCCTTGGGGTGGTGG-3 5-AminolinkerC6PC 5-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG-3 5-AminolinkerC6NC 5-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC-3 5-AminolinkerC66.5多重 PCR反应体系：采用商业化多重 PCR试剂盒进行多重 PCR扩增，体系中每条引物终浓度为0.2M。实际应用检测时，利用转基因水稻标准品的基因组 DNA作为阳性质控，非转基因水稻标准品的基因组 DNA作为阴性质控，核酸提取空白作为空白质控，以对后续的 PCR扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控。多重 PCR反应体系如表8所示：表 8.PCR 反应体系反应液组成 检测反应 阳性质控 阴性质控 空白质控Multiplex PCR Master Mix 25 L 25L 25 L 25 LMultiplex PCR primer Mix 5 L 5L 5 L 5 L
