1、抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用郑怡麟 何莹 陈安 易维京 胡川闽第三军医大学临床生物化学教研室 重庆 400038摘要 目的 获得抗人降钙素原（procalcitonin，PCT)单克隆抗体，并鉴定其基本特性。方法：从 NCBI数据库中获得 PCT 编码序列，以原核表达系统表达 PCT 重组蛋白，经镍亲和层析柱纯化，获得筛选单克隆抗体的筛选原；综合应用多种生物信息学分析软件预测 PCT 中潜在的 B 细胞表位肽，用合成肽对Balb/c 小鼠进行免疫，纯化单克隆抗体，通过间接 ELISA、western blot 和免疫组化鉴定获得的单克隆抗体。将获得的单克隆抗体作为捕获抗体，
2、经过配对建立检测重组 PCT 的 ELISA 体系，并初步对临床血清进行了检测。结果：成功获得 3 株 PCT 特异性单克隆抗体，分别为 2-D7、2-H12 和 4-H12，亚类分别为 IgG1和 IgG2a，最高效价为 1:1024000，亲和力最高可达到 1.3109M-1；选取 2-D7 经 western blot 鉴定能够检测重组 PCT 蛋白，经免疫组化证实能特异性识别甲状腺组织中 PCT 蛋白，经过配对成功建立了检测重组PCT 的 ELISA 体系，运用建立体系检测临床血清 PCT 含量时发现正常组与细菌培养阳性组之间具有显著差异。结论：成功表达了人 PCT 重组蛋白，获得了
3、3 株高特异性和高亲和力的 PCT 单克隆抗体，成功建立了检测重组 PCT 的 ELISA 体系，并初步用于临床样本检测，为 PCT 定量免疫检测体系的建立以及进行PCT 相关的基础和临床应用研究奠定了基础。关键词：降钙素原；原核表达；单克隆抗体；特性鉴定；ELSIA 检测Preparation and identification of monoclonal antibodies against human procalcitonin （PCT ）Abstract Objective：To prepare and characterize the monoclonal antibodies
4、(mAbs) against human procalcitonin （PCT ）. Methods: Human PCT protein was expressed with prokaryotic expression system, and the purified recombinant PCT was applied as the antigen for screening the mAbs. Based on bioinformatics analysis, the potential B cell epitopes within human PCT were predicted
5、and synthesized. BALB/c mice were immunized using the synthesized peptide ,which conjugated with bovine serum albumin. To characterize the mAbs, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), western blot and immunohistochemistry were employed.And the ELISA system which can detect PCT in the serum was e
6、stablished. Results: the PCT recombinant protein was successfully highly expressed and the purity of the recombinant PCT after purification reached about 95%. Three hybridoma cell lines secreting antibodies against PCT, 2-D7, 2-H12 and 4-H12 were obtained. The subtypes of the mAbs belong to IgG1 and
7、 IgG2a. The monoclonal antibody 2-D7 has the highest titer of 1:1024000 and affinity constant of 1.3109M-1. Western blot showed that 2-D7 only reacted with recombinant PCT and the native PCT in human thyroid gland tissues, but not with unrelated protein H-FABP. Using 2-D7 and the purchased antibody
8、as capturing and detecting antibody respectively, an ELISA system measuring recombinant PCT was developed.The ELISA system was applied to detect the PCT of the clinicial samples,and significant difference was found between the two groups. Conclusions: Three monoclonal antibodies against human PCT wi
9、th high titer and specificity have been successfully prepared, and an ELSIA system for detecting human PCT has been developed, which could be used for further PCT investigation and developing quantitative measurement of PCT immulogical detection.Key words PCT; recombinant PCT; monoclonal antibody; c
10、haracterization; ELSIA system降钙素原（PCT）是一种无激素活性的降钙素前肽物质 (1)，来自于定位第 11 号染色体上的单拷贝基因，该基因由 2800 个碱基对组成，含 6 个外显子和 5 个内含子，分子量约为 13KD。在正常代谢下，甲状腺 C 细胞产生 PCT 并分泌激素活性的降钙素。正常人血中 PCT 浓度极低，但在细菌感染和脓毒血症时PCT 浓度升高。自 1993 年 Assicot 等 (2)首次报道 PCT 可作为细菌感染的早期标志物以来，已作为一个新的炎症指标广泛应用于细菌感染的诊断与鉴别诊断，2001 年国际脓毒症会议的脓毒症诊断标准已把 PCT作
11、为诊断指标之一 (3)。目前临床和科研实验室中均用免疫学方法检测 PCT 浓度，包括胶体金法、 ELISA 法和免疫化学发光法等。所有这些方法的前提都是制备 PCT 特异性抗体，且健康人血浆中含量极低，在 200pg/ml 以下，对抗体的亲和力等参数要求很高。迄今为止这些检测体系所用的抗体均来自国外大公司，价格昂贵。因此，制备 PCT 特异性单克隆抗体，为 PCT 的免疫检测提供具有自主知识产权的关键原料，对于扩大其临床应用，降低医疗成本，具有重要意义。本文以原核表达系统表达了 PCT 蛋白，获得用于检测单克隆抗体的筛选原。同时，综合考虑蛋白质二级结构、抗原性、亲疏水性、可及性及柔韧性，人工合
12、成 B 细胞表位多肽并与 BSA 交联后，制备了高特异性和高亲和力的单克隆抗体，为下步试剂盒研发奠定了基础。1 材料与方法1.1 材料和试剂所用菌株 E.coli BL21 (DE3)和 DH5 为本室保存；pET28a 质粒购自 Novagen 公司；Xho 及 Nde核酸内切酶购自 Fermentas 公司； pfuDNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶购自 Takara 公司；DNA 标准 (DL 2000)、DNA 胶回收试剂盒及质粒抽提试剂盒购自 Tiangen 生物科技有限公司；蛋白质标准品为中科院生物制品研究所产品；纯化所用层析柱及填料购自 Amersham 公司；PCT 全长基因
13、序列以及表位肽段由上海旭冠生物科技发展有限公司合成；单克隆抗体亚类检测试剂盒购自 Sigma 公司；HRP- 羊抗小鼠和兔抗羊IgG 来自北京中杉金桥公司；PCT 酶标抗体购于安图公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。1.2 方法1.2. 1 重组 PCT 表达、纯化及鉴定 对 PCT 基因编码序列进行密码子偏性分析，优化后的序列加上酶切位点 (Nde(2)对败血症、休克、MODS、器官移植及术后感染并发症等的连续监测 (8);(3) 对新生儿和婴儿感染、细菌感染和病毒感染等疾病的鉴别诊断 (9);(4)对其他疾病例如疟疾、烧伤等的诊断 (10) ;(5)对以上疾病进行感染程度的判断和治疗效果的评
14、定 (11)。再者， 抗生素的使用必须针对细菌病原体的感染 (12)，而 PCT 的检测在防止抗生素滥用方面具有重要应用价值：当 0.25ng/mlPCT0.5ng/ml 时显示可能有细菌感染考虑抗生素治疗；当 PCT0.5ng/ml 时代表已有细菌感染存在，强烈建议使用抗生素治疗；用上述 PCT 的指标值预测指导抗生素的使用，不仅可以降低不必要的抗生素治疗而且可以降低其用药时间 (13)。所以， PCT 可以作为一项快捷、有效的常规实验指标以辅助指导临床诊断和治疗。目前临床中对 PCT 的检测方法主要有胶体金法、电化学发光法和发光分析免疫法等，这些检测方法建立的基础是获得抗 PCT 单克隆抗
15、体，但 PCT 蛋白的克隆表达及其单克隆抗体的制备均具有一定的技术难度，导致检测 PCT 的试剂盒依赖进口，价格昂贵，限制了该检测项目在临床上的推广使用。因此，制备高特异性高效价的抗 PCT 单克隆抗体显得十分重要和必要。本课题中我们根据生物信息学预测，合成了针对 PCT 检测靶位（APFRSALESS ，CGNLSTCMLGT）的肽段，用这两段明确表位的肽段作为免疫原，利用杂交瘤技术成功制备了 3 株高效特异的单克隆抗体。为了获得筛选原，我们优化表达了全基因 PCT 重组蛋白。在筛选单克隆抗体过程中使用该重组蛋白作为筛选原，有效的提高了单克隆抗体的特异性和准确性。随后我们对三株单克隆抗体进行
16、了鉴定，其中一株单克隆抗体 2-D7 在甲状腺组织切片免疫组化染色中呈阳性，说明其能够与甲状腺组织中天然 PCT 蛋白结合。以此株单克隆抗体为包被抗体，购买的酶标抗体为检测抗体，成功建立了重组蛋白 PCT 检测的 ELISA 体系，并检测 100 份临床血清样本，发现正常组与感染组之间具有显著差异，通过与市售的 PCT 抗体比较，发现建立的 ELISA 体系诊断阳性率可达到市售抗体检测水平。但是本实验所选标本量较少，仍需要大量样本验证。高效特异的 PCT 单克隆抗体 2-D7 的成功制备为 PCT下一步的免疫检测试剂盒研发及其他检测方法体系的建立奠定了良好的基础。参考文献1. Snider R
17、H Jr, Nylen E S, Becker K L. Procalcitonin and its component peptides in systemic inflammation: immunochemica1 characterizationJ. J lnvestig Med, 1997, 45(9): 552- 560.2. Assicot M , Gendrel D, Carsin H, et al. High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection J .Lancet,1
18、993, 341(8844) : 515-518.3. Levy MM, Fink MP,Marshall JC, et al. 2001 Sccm/Eskm/Accp/Ats/Sis international sepsis definitions conferenceJ. Critcare Med, 2003, 31 (4): 1250-1256.4. 易维京,李鹏,李淑慧,等. 人 NT-proBNP 的高效原核表达及免疫学检测标准品的研究 J. 第三军医大学学报, 2008,30(6): 525 -529.5. 郭建秀 ,李鹏,伍艳芳,等. 抗人 MIF 单克隆抗体的制备及其活性的初步
19、鉴定 J. 第三军医大学学报 , 2006,28 (6): 546-549.6. 郭杰标 ,郭锐 ,刘艳华. 以抗体竞争结合抗原测定单抗亲和力常数的研究 J. 南方医科大学学报 ,2006,26(7):1057 - 1059.7. Schbtte K, Malfertheiner P. Markers for predicting severity and p rogression of acute pancreatitis J . Best Pract ResClin Gastroenterol, 2008,22(1):75-90.8.Klaus Tschaikowsky MD,Monika
20、 Gedwig-Geissing Phd,Giovanni G Braun MD,Martin Radespiel-Troeger Phd. Prective value of procalcitonin interleukin-6 and c-reactive protein for survival in postoperative patients with severe sepsis.J.Journal of Critical Care ,2011,26:54-649.Claudio Chiesa,Fabio Natale,Roberto Pascone,John F osbore,L
21、ucia Pacifico,Enea Bonci,Mario De Curtis.C-reactive protein and procalcitonin reference intervals for pretern and term newborns during the early neonatal period.J.Clinica chimica Acta,2011,412:1053-105910.Elizabeth A,Mann,Geri L,Wood,Charles E,Wade. Use of procalcitonin for the detection of sepsis i
22、n the critically ill burn patient:A systematic review of the literature. J . Burns,2011,37:549 - 558.11 Boucher, Bradley A. Pharm D, et al. Procalcitonin:clinical tool or laboratory curiosity? J . Critical CareMedicine,2000,28(4):1 224 - 1 22512. P.Ball,F. Baquero,O. Cars, et al.,“Antibiotic therapy
23、 of community respiratory tract infections:strategies for optimal outcomes and minimized resistance emergence,” Journal of Antimicrobial Chemotherapy, vol.49, no.1, pp.3140,2002.13. Y. Shehabi and I. Seppelt, “Pro/Con debate: is procalcitonin useful for guiding antibiotic decision making in critically ill patients?” Critical Care,vol.12, no.3,p.211, 2008.
