1、结核分枝杆菌培养、药敏实验及质量控制,2007-10-11,2,结核菌培养,酸性罗氏培养管上结核分枝杆菌菌落,结核分枝杆菌显微镜下形态,2007-10-11,5,培养目的：,一：增加分枝杆菌生产率，早期生长、早期诊断；二：提高阳性率，使少数细菌亦能生长出来；三：进一步进行药敏试验和菌型鉴定。,2007-10-11,6,培养敏感性、特异性更强,理论上10-100条菌/毫升可检出阳性；获得分枝杆菌培养物，是进一步检测的基础需时长,根据接种量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可见菌落。需要培养箱、涡旋振荡器、培养基凝固器等设备相对涂片技术要求较高成本是直接涂片法的7-8倍。,据2001版伯杰金氏手册，
2、结核杆菌现属于新成立的放线菌门、放线菌纲、放线菌亚纲、放线菌目、棒杆菌亚目、分支杆菌科,结核分枝杆菌（MTb）结核病的病原体1882年郭霍（Robert Koch）发现繁殖时有分支生长的趋势，故称分支杆菌具有抗酸性,又称抗酸杆菌,用抗酸染色的方法检查分枝杆菌分枝杆菌有致病性和非致病性两大类主要引起肺結核的致病性分枝杆菌有人型、牛型、非洲、田鼠分枝杆菌,二、痰涂片镜检标准化操作 结核杆菌（MTb）形态(杆菌型)结核分支杆菌是专性需氧菌，无鞭毛、荚膜，无运动能力；结核杆菌在痰液中多为单个存在或形成分枝，有时呈V、Y、人字形排列，痰菌量多时可排列为束状或集聚成团。结核分枝杆菌由细胞壁、细胞膜、细胞质
3、、核物质组成。菌体内可有2-5个或更多的小圆形易染颗粒，异染颗粒可超过菌体横径。,显微镜下结核分支杆菌形态,结核分枝杆菌显微镜下形态,2007-10-11,12,结核分枝杆菌生长特性： 缓慢：在一般培养基上分裂一代需要10多小时，一般10-30天肉眼可见菌落生长。 菌落形态（罗氏培养基）：粗糙、凸起、致密，有表面皱折，呈颗粒、结节或菜花样，浅黄色或米色，不透明。,2007-10-11,13,2007-10-11,14,基本步骤： 制备培养基 标本前处理（去污染） 接种 孵育 报告结果,2007-10-11,15,酸性罗氏（Lowenstein-Jensen）培养基 天门冬素 3.6g 或谷氨酸
4、钠（纯度99%以上）7.2gKH2PO4 14.0gMgSO4.7H2O 0.24g枸橼酸镁 0.6g丙三醇 12ml蒸馏水 600ml新鲜鸡卵液 1000ml2%孔雀绿 20ml,一、培 养 基,2007-10-11,17,原理：分枝杆菌对酸碱有相对强的耐受力。目的：液化标本、去除杂菌、分离出分枝杆菌原则： - 尽可能杀灭标本中的杂菌 - 尽可能保存标本中的分枝杆菌,二、标本前处理,2007-10-11,18,操作,痰标本,12倍4% NaOH,振荡匀化,静置,15分钟,2007-10-11,19,37竖直培养8周,均匀接种0.1ml,2支/标本,斜面向上，37水平放置24小时,三、接种和孵
5、育,2007-10-11,20,接种后第3、7天各观察一次菌落生长情况此后每周观察一次，直至满8周记录菌落生长及污染情况。,四、结果的观察与报告,2007-10-11,21,报 告 方 式分枝杆菌培养阴性： 斜面无菌落生长菌落生长不足斜面面积1/4者，报实际菌落数。分枝杆菌培养阳性（1+）： 菌落生长占斜面面积的1/4分枝杆菌培养阳性（2+）： 菌落生长占斜面面积的1/2分枝杆菌培养阳性（3+）： 菌落生长占斜面面积的3/4分枝杆菌培养阳性（4+）： 菌落生长布满整个斜面,2007-10-11,22,分离培养流程:,涡旋振荡2-3次,痰标本中加入1-2倍体积4%NaOH,分别接种0.1ml前处
6、理液至2只培养基斜面,接种后3天、7天观察，此后每周观察一次,置37oC温箱培养,有菌落生长需经抗酸染色确认，至第8周无菌落生长报告阴性,室温静置15分钟,4,3,2,5,6,7,1,2007-10-11,23,涂阳培阴率过高？,2007-10-11,24,污染率过高？,2007-10-11,25,菌种保存,原则：一个有利的休眠环境，干燥、低温、缺氧、缺乏营养和添加保护剂等。一：长期保存 1ml 分枝杆菌菌液经离心沉淀后，去上清，将沉淀悬浮于1ml 7H-9OADC-0.5%TWEEN80-50%丙三醇中，-70oC保存。 OADC:0.5%BSA、0.2%葡萄糖、0.06%油酸、 140mm
7、ol/LNaCl和0.05%Tween80,2007-10-11,26,二：短期保存 1.1ml分枝杆菌菌液-70oC保存； 2.罗氏培养基上菌落加无菌液体石蜡后，4oC保存。,结核分枝杆菌培养质量控制,目前缺少标准的分离培养质量评价方法！,结核分枝杆菌培养的实验室系统,1. 建立标准化的培养实验室2.快速/ 安全的标本运输工作系统3. 便于患者标本集中培养4.安全可靠的实验室配套设备和材料5. 工作人员培训,分离培养实验室的基本要求,房间及设施：一个独立房间、有上下水及电的供应、通风和照明良好仪器：培养箱、冰箱（4）、蒸汽凝固灭菌器（若自制培养基）、涡旋振荡器、定时器、酒精灯耗材：痰盒、培养
8、管及架移液、管废液（物）缸试剂:氢氧化钠、蒸馏水、磷酸二氢钾、硫酸镁7H2O、柠檬酸镁、谷氨酸钠、孔雀绿、鲜鸡蛋（若自制培养基）生物安全：型生物安全柜、高压灭菌锅、紫外灯、消毒剂、工作服、口罩、帽、手套,按照高致病性病原微生物的要求进行检测；实验室应为P2或P2以上级别的实验室，应有二级生物安全柜；标准化的操作流程；良好的个人防护措施以及定期对操作人员进行体检并进行生物安全培训；实验室应有完善的规章制度和应急预案等。,分离培养实验室生物安全基本要求,如何获得合格标本,标本采集：痰液应来自患者肺部。痰标本应以脓痰、血痰、干酪痰或粘液痰为合格痰标本，唾液和口水为不合格标本。按照标本采集时间分为即时
9、痰、夜间痰、晨痰。肺结核病人结核杆菌检出率与痰标本采集的好坏有直接关系。医生或检验人员应告诉初诊病人留取合格痰标本的方法。,如何获得合格标本,标本保藏和运送：在运送可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本时，须按照可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定的要求进行审批、包装、运输、操作、保藏和管理。采集后立即送检，当天不能检查的痰标本置4C冰箱保存。 外送标本要认真核对痰盒和化验单上姓名、序号等项目，7天内必须进行培养。,结核菌培养及药敏标本采集送检须知,培养一些指标,污染率: 3-5% (固体培养); 5-10% (液体培养)阳性结果需要的平均时间 : 4-5 周涂阴
10、培阳率: 10%,影响因素：培养基质量NaOH的量消化时间离心力离心时间接种量培养箱的温度,分枝杆菌药敏试验,我国是高耐药国家,2010年第五次流行病调查总耐药：37.79%初治：35.16%复治：55.17%MDR:8.36%XDR:0.6%,耐药性检测目的,指导用药 化疗前药敏选择用药疗效不佳时药敏观察有无耐药性、调整用药监测社会中耐药结核菌株的流行情况评价和改进国家结核病控制措施的重要参考因素之一。,耐药性检测指针,初治结核病人观察起始耐药菌感染复发结核病人痰菌阴转后复阳的病人化疗36个月痰菌持续阳性者痰菌减少后又持续增加者非结核分枝杆菌感染者结核病流行病学调查,耐药性测定常用方法,绝对
11、浓度法:是我国30 多年来一直沿用的药敏试验方法，为目前我国大多数结核病专科医院常规使用的用于临床检测的方法。比例法:是WHO 全球耐药监测项目中推荐的标准药敏试验方法，目前为我国流行病学监测和耐多药结核病规划管理项目所采用的方法。二者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差别。,比例法,该法是WHO 全球耐药监测项目中推荐的标准药敏试验方法。它是二种浓度的细菌接种在一种浓度的含药培养基上，以计算耐药百分比: 含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上菌落数*100%，若耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。,比例法,比例法药敏试验药物终浓度 药物 L-J培养基中最终药物（
12、ug/ml） INH （异烟肼） 0.2 SM （链霉素） 4.0 EMB （乙胺丁醇） 2.0 RFP （利福平） 40.0 OFX（氧氟沙星） 2.0 K（卡那霉素） 30.0 AK（阿米卡星） 30.0 CPM（卷曲霉素） 40.0,药敏试验准备,比例法,菌液制备和稀释 用接种环刮取生长旺盛的菌落（注意不要取个别菌落，要广泛取样）置于加有少许PB缓冲液的磨菌管底部，充分研磨，使呈乳酪样均匀菌液，用比浊管比浊配成1mg/ml菌液。 用刻度吸管或22号标准接种环沾取2满环mg/ml的菌液，移至2 ml灭菌生理盐水中，即稀释成10-2mg/ml菌液；用同样方法再进行100倍稀释，即成10-4m
13、g/ml菌液。（注：22号标准接种环：金属丝直径0.7mm,接种环内径3mm，满环移液0.01ml）。,比例法,接种和培养用22 号标准接种环分别沾取1环 （即0.01ml ）10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，用划线法均匀接种至对照及含药培养基表面，应注意使菌液尽可能均匀分散于培养基斜面。最终接种菌量为10-4mg和10-6mg。接种后的培养基置于37培养，至4周后报告结果。,比例法,结果报告 记录并报告菌落生长情况 融合成片（500个菌落） 4+ 大部分融合（200500个菌落） 3+ 100200个菌落 2+ 50100个菌落 1+ 50个菌落 报告菌落实数,比例法,结果报告及解释计算耐药百分比:耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上菌落数*100%若耐药百分比大于1%，则认为受试菌对该抗结核药耐药。,国家参比实验室负责对各省参比实验室的熟练度测试，每年一次。每套熟练度测试的菌株的不少于30管培养物。测试菌中应包括不同耐药谱的菌株和一定数量的敏感菌株。,
