1、国 家 重 点 基 础 研 究 发 展 规 划课 题 结 题 研 究 报 告项目编号：G1998010200项目名称：农作物资源核心种质构建、重要新基因发掘与有效利用研究课题编号：G1998010204课题名称：水稻新基因发掘及利用研究课题负责人：张启发联系地址：华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，430070电话：(027)87282429 传真：(027)87287092课题依托单位：华中农业大学 主要承担单位：华中农业大学 上海农业生物基因资源中心 2003 年 9 月 11 日21.计划任务完成情况1.1 研究计划定位涉及水稻产量、抗性、米质等性状的 12 个以上的优异基因；明确所
2、定位基因的基因效应及其利用价值。 创造一批具有以上优异基因，易于育种利用的水稻新种质。1.2 完成情况从水稻资源库里筛选大量的材料，建立了旱、低氮、低磷胁迫的筛选和评价体系；通过多种筛选方法， 获得了具大穗，大粒、小粒，高蛋白，理想粒形，抗旱，养分高效利用等有利性状的水稻资源。利用 这些特色材料构建了 14 个重组自交系群体和 5 个双单倍体群体，已经定位了包括水稻穗大小，千粒重，稻米外观品质和食味品质等性状的主效 QTL 50 多个， 这些 QTL 加性效应较大，可以借助标记辅助选择技术， 应用于水稻遗传改良。利用 cDNA 芯片技术分离了一批低氮 胁迫，低磷胁迫，干旱胁迫和螟虫胁迫条件下的
3、显著差异表达基因。利用 转基因技术获得了磷高效率利用的中间材料。抗旱，磷利用效率和氮利用效率相关基因定位工作正在进行中，大穗主效 QTL 近等基因系即将建成，粒形主效 QTL 近等基因系正在构建中。选育了一大批包含以上优异基因的中间材料。具体完成情况1.2.1 新种质资源的筛选对品种资源攻关研究中获得的 2000 余份含有本研究所需基因的优异种质初步筛选，重复 鉴定， 获得包括大穗、大粒、抗旱、抗寒、高蛋白、食味品质优良，等优异稻种资源 20 多份。对品种资源攻关研究中获得的 2000 余份和本项目课题一提供的水稻核心种质库 503 份材料采用成对试验法进行苗期低氮低磷筛选。 经过分析，确定在
4、苗期进行3耐低磷品种筛选的方法：一般情况下以相对单株分蘖率和相对单株干重比较可靠。对于筛选期间正常磷处理和低磷处理都无分蘖的品种，应以相对干重的大小作为筛选指标；对于分蘖发生早，正常磷处理有分蘖，缺磷处理有或无分蘖的品种， 则应以单株相对分蘖数作为主要指标，而以相对干重作为辅助指标。从 2000 余份材料中通过筛选指标和外部生物学特征表现筛选出较为典型的耐低磷品种 49 个品种，低磷敏感品种 35 个。采用对比试验，对 1200 份水稻种 质资源进行氮高效筛选，根据相对分蘖率和相对干重表现出很大的差异初步筛选出 12 份氮高效材料。表 1列出部分典型新基因源材料。对创建的 530 份特青/Le
5、mont 双向导入系、240 份中 413 导入系，设置低氮处理组和正常氮肥对照组进行大田筛选，每小区种植 4 行，每行 6 株。分苗期、最高分蘖期、抽穗期等不同时期考察株高、分蘖数、穗数、叶绿素含量、光合速率等形态指标，成熟期考察生物学和籽粒产量。同 时，对初步 筛选 的氮高效品种资源和“特青/Lemont”单向导入跨叠系，进行水培成对试验，营养池中保持营养液循环流动，于最高分蘖期考察苗高、分蘖数、茎叶和根部干重、叶绿素含量、植株重氮量等 营养生理指标。在湖北省襄樊市布置了耐低氮的大田筛选试验，参试材料为“ 中 413”导入系共 1800 株系，分施氮和不施氮相邻田块进行对比试验，根据初筛和
6、田间目测筛选结果， 对部分株系进行叶绿素含量、有效穗数和 产量等性状分析。 筛选结果将在年底获得。表 1 筛选出的具有特异性状的水稻种质材料品种资源 特性 品种资源 特性HR5 每穗实粒数 280 左右 中旱 1 号 抗旱SLG1 千粒重 55 中旱 5 号 抗旱南洋占 千粒重 45 克 BG4087 磷高效利用Chuan 7 千粒重 12 克 中早 18 磷高效利用HR94 粒长 1.1 厘米 Lagrue 磷敏感4多年生稻 抗寒 IRGC78042 抗螟虫德陇 208 软米 IRGC6303 抗螟虫HA84494 高蛋白 沿潮 氮高效岳早籼 6 号 高蛋白 沈农 265 氮高效1.2.2
7、群体构建新基因发掘的基本方法之一是进行基因定位，基因定位往往离不开群体，因此，本课题相当长的时间和相当大的精力用于群体构建。又因为永久性群体 DHs 和RILs 方便于多年多点试验，因此，构建永久性群体是本 课题前三年研究工作的主要任务之一。构建 DH 群体受基因型影响，多数组合 获 得的独立克隆苗较少，因此，大多组合以构建 RILs 为目标。经过武汉，杭州正季加代和海南冬季南繁相结合，已经获得 18 个各具特征的群体用于本课题的研究（表 2），分子标记工作已经证实这些群体质量较高，非常适于 QTL 定位工作。1.2.3 基因定位1.2.3.1 连锁图谱构建以下列 10 个群体（表 3）为基础
8、，开始构建 SSR 标记连锁图 ，大多群体的连锁图在完善之中。1.2.3.2 水稻外观品质基因的定位以珍汕 97/明恢 63 的 F2:3 群体及其衍生的重组自交系群体 为材料，鉴定并定位了控制稻米外观品质的 4 个性状(粒长、粒宽、 长宽 比、垩白 )的主效基因(或主效QTLs)，其中控制粒长的基因位于第 3 染色体，粒宽基因位于第 5 染色体，长宽比主要受控于这两个基因，垩白基因定位于第 5 染色体，与粒宽基因的定位相同(表 4)。表 2 已经构建成的 18 个群体群体组合 群体类型（世代） 群体大小 群体目的 建成年份珍汕 97/武育粳 2 号 DH 190 持绿性 2001、4珍汕 9
9、7B/德陇 208 F7 239 软米 2002、4II-32B/岳早籼 6 号 F7 178 高蛋白 2002、4珍汕 97B/ HR5 F7/F6 302/39 大穗 2001、45珍汕 97B/南洋占 F8/F7 175/67 长粒 2002、4珍汕 97B/南洋占 DH 115 长粒 2002、4珍汕 97B/多年生稻 F7/F6 151/35 抗寒 2001、4珍汕 97B/多年生稻 DH 389 抗寒 2001、4珍汕 97B/SLG-1 F8/F7 180/57 大粒 2002、4珍汕 97B/中旱 5 号 F8/F7 145/58 抗旱 2002、4南洋占/Chuan 7 F7
10、/F6 269/83 大小粒 2001、4珍汕 97B/H94 DH 120 长粒 2002、4II-32B/H94 DH 155 长粒 2002、4珍汕 97/特青 F7 236 产量 2002、10明恢 63/特青 F7 218 产量 2002、10协青早/9308 F7/F6 80/210 产量 2003、10珍汕 97/中早 18 F7/F6 143/27 磷高效 2003、9BG4087/Lagrue F4 （构建中） 240 磷高效 200310表 3 遗传连锁图谱构建情况组合名称 作图群体大小 群体类型 连锁图全长 cM 标记数目ZS97/武育粳 190 DH 1849.4 17
11、9ZS97B / H94 92 DH 1458.9 191II-32B / H94 103 DH 1079.9 160ZS97/HR5 190 RIL 1563.6 185ZS97B/德陇 208 186 RIL 160IRAT109/ZS97 178 RIL 正在构建中 120ZS97B/南洋占 190 RIL 正在构建中 71珍汕 97B/多年生稻 190 DH 正在构建中 100ZS97/SLG-1 190 RIL 正在构建中 95南洋占/Chuan 7 190 RIL 正在构建中 65表 4 珍汕 97/明恢 63 组合衍生的群体稻米外观品质 QTL 定位 Trait Chrom-os
12、ome Interval LOD %Vara Addb DomF2-3populationGrain length 3 RG393-C1087 32.7 59.0 -0.42 -0.247 C1023-R1440 2.7 5.1 -0.08 0.14Total 33.8 59.9Grain width 1 C161-R753 4.1 15.2 0.04 0.1165 RG360-C734a 19.9 52.3 0.16 -0.04Total 21.8 55.9Length-width ratio 3 C1087-RZ403 12.8 29.4 -0.18 -0.105 RG360-C734a
13、9.9 31.3 -0.17 -0.02Total 30.1 62.4Chalkiness 1 C161-R753 2.6 8.9 1.97 16.335 RG360-C734a 29.3 70.3 30.91 -20.735 RG528-C1447 5.8 11.3 13.74 -5.196 R1952-C226 2.5 5.0 8.24 3.1110 R2625-C223 2.5 4.9 8.57 0.94Total 36.8 73.2RIL populationGrain length 3 RG393-C1087 19.8 40.7 -0.556 Wx-R1952 4.0 8.0 0.2
14、4Total 25.5 48.6Grain width 5 RG360-C734a 15.3 41.6 0.228 C347-R727 2.5 4.9 0.08Total 17.2 44.7Length-width ratio 3 RG393-C1087 9.6 21.8 -0.255 RG360-C734a 10.2 30.0 -0.306 R1952-C226 2.4 5.1 0.12Total 26.1 61.1White belly 5 RG360-C734a 35.2 87.2 72.97 R1245-R1789 2.7 9.5 24.5Total 36.6 87.9White co
15、re 5 RG360-C734a 4.5 11.6 -12.26 Wx-R1952 4.0 7.5 9.8Total 8.8 17.5利用 ZS97B/H94，II-32B/H94 两个组合的 DH 群体（简写为群体 A 和 B）和珍汕 97/德陇 208 组合的 RIL 群体（简称群体 C）对稻米部分品 质性状进行 QTL 定位。II-32 与珍汕 97 基因组水平差异小， 600 个 SSR 标记 中表 现 3多态性，两品种 间除糊化温度存在一定的差异外，其他品质性状基本一致。在 AB 两个群体间除了糊化温度和垩白率两个性状存在较大差异外，其他性状表 现相似的分离规律。主效QTL 定位结果
16、在两个群体 间基本一致（表 5），微效 QTL 结果存在差异。粒长主要由第 3 染色体基因控制，粒宽由第 5 染色体基因控制。 群体 A 在第 5 染色体检测到垩白率和垩白度主效 QTL，群体 B 则在第 5 和第 6 染色体上分别检测到影响垩白率和垩白度的主效 QTL。对于群体 C，稻米和谷粒粒长和粒宽在第 3 和 5 染色体上均没有检测到 QTL，只是在第 1 和 9 染色体上 检测 到两个 QTL，LOD 值均7较小。同时 2003 年在武汉，通过分期播种和遮光处理， 调整生育期，使群体 A 的所有株系分别在 8 月上旬和 9 月上旬抽穗，使得两批材料的各个生长季节处于完全不同的光温环境
17、，分析环境对稻米品质的影响，这部分 结果将在年底获得初步结果。表 5 三群体稻米外观性状共同主效 QTL群体 性状 LOD 染色体 标记区间 加性效应 贡献率 A 精米长 14.4 3 RM16-MRG2538 -0.36 35.7B 精米长 13.8 3 RM16-MRG2538 -0.60 54.9C 精米长 3.1 1 RM312- RM81 0.25 15.3A 精米宽 3.7 3 RM16-MRG2538 0.09 19.7A 精米宽 2.8 5 MRG2381-RM473B 0.06 8.3B 精米宽 9.3 5 RM574-RM289 0.11 33.2C 精米宽 2.6 9 R
18、M105- RM257 -0.05 27.7A 精米厚 4.6 10 RM311-RM200 -0.04 15B 精米厚 12.1 5 RM593-RM574 0.11 38.4A 精米形 22.9 3 RM16-MRG2538 -0.24 58.2B 精米形 11 3 MX6-RM16 -0.23 39.3B 精米形 7.2 5 RM593-RM574 -0.19 24.7A 垩白率 3.8 6 RM508-RM170 10.21 13.9B 垩白率 12.6 5 RM593-RM574 23.55 45.2B 垩白率 10.9 6 RM170-RM589 17.56 27.5A 垩白度 3
19、.7 6 RM508-RM170 4.65 12.4B 垩白度 5.1 5 RM593-RM574 0.07 14.9B 垩白度 8.4 6 RM170-RM589 0.08 23.81.2.3.3 水稻蒸煮食味品质基因定位基因定位结果见表 6，群体 A 和 B 均在第 6 染色体的短臂 MX21-RM190 和长臂 RM402-RM276 各定位到一个影响糊化温度主效 QTL，分别解释性状变异的11.3%和 78.4%，加性效应作用方向相反。 MX21-RM190 区间同时影响直链淀粉含8量和胶稠度。群体 C 也在第 6 染色体上的相应区间 定位到控制直链淀粉含量，胶稠度和糊化温度的主效 Q
20、TL，但在 MX21-RM190 附近区间没有检测到糊化温度QTL。表 6 两群体稻米外观性状共同主效 QTL群体 性状 LOD Chr. 标记区间 Add. 贡献率A/B 直链淀粉含量（AC） 37.4 6 MX21-RM190 6.7 85.7A/B 胶稠度（GC） 16.5 6 MX21-RM190 -20.2 44.1A/B 糊化温度（GT） 6.6 6 MX21-RM190 0.6 11.3A/B 糊化温度（GT） 19.8 6 RM402-RM276 -1.6 78.4C 糊化温度（GT） 40.1 6 RM 549- RM276 1.8 90.5C 直链淀粉含量（AC） 55.6
21、 6 RM 204-dull -9.8 95.6C 胶稠度（GC） 6.7 6 Dull- RM 190 5.8 28.71.2.3.4 水稻持绿性基因定位武育粳 2 号在成熟期表现较好的持绿性，利用珍汕 97 与它配组获得的 DH 群体在抽穗期和抽穗 30 天后分别测定剑叶和倒二叶的 SPAD 值、叶绿度、叶 绿 a、叶绿素 b 和总叶绿素等持绿指标。以抽穗后 30 天各性状测定值与抽穗时相应性状的测定值的比值进行 QTL 定位。剑叶比 SPAD (rrgf)： 共检测到了 4 个 QTL (表 7)。它们分别分布在第 2 (rrgf2)、7 (rrgf7)、10 (rrgf10) 和第 1
22、2 (rrgf12) 染色体上。它 们 都表现以武育粳 2 号基因型对表型有增效作用。这些 QTL 效应值在 0.03-0.07 之间 。表型 贡献率为 1.01%-4.43%。二叶比 SPAD (rrgs): 共检测 到 5 个 QTL (表 8)。它们分别分布在第 2 (rrgs2)、3 (rrgs3)、6 (rrgs6)、7 (rrgs7) 和第 10 (rrgs10) 染色体上。其中 rrgs3 表现珍汕 97基因型有对表型增效作用，加性效应为 0.03，表型 贡 献率为 1.19%；其余 4 个 QTL表现为武育粳 2 号对表型有增效作用，效 应值为 0.04-0.05，表型贡献率为
23、 1.59%-2.45%。9剑叶持绿时间 (lfyhd)：共 检测到 5 个 QTL (表 9)。它们分别分布在第 2 (lfyhd2)、3 (lfyhd3)、4 (lfyhd4)、6 (lfyhd6) 和 10 (lfyhd10) 等染色体上，其中一个 QTL lfyhd2表现为以珍汕 97 基因型对性状表型有增效作用，而其余 4 个 QTL 表现为武育粳2 号基因型对表现型有增效作用， 这些 QTL 效应值 在 1.2-2.0 d，解释表型方差的1.7%-4.8%。二叶持绿时间 (lsyhd)：发现 在第 6 (lsyhd6) 和第 8 (lsyhd8) 两条染色体上有QTL (表 10)
24、。lsyhd6 表现为 武育粳 2 号基因型对表型有增效作用，效应值为 1.9 d，解释表型方差达 4.5%；而 lsyhd8 表现为珍汕 97 基因型 对该性状表型有增效作用，效应值为 2.5 d，解释表型方差达 7.9%。表 7 剑叶比 SPAD 的 QTLCh-Ini1) QTL Flanking Marker Ch-Inj1) QTL Flanking Marker LR ai2) h2ai5) aj2) h2aj5)2-2 RM154-RM211 4-9 RM241-RM303 28.22-16 rrgf2 RM263-RM221 5-12 RM87-RM334 39.0 -0.07
25、 4.434-1 RM335-MRG5943 7-6 rrgf7 RM2-RM11 27.5 -0.03 1.147-5 RM125-RM2 12-4 rrgf12 RM277-RM309 18.8 -0.03 1.0110-7 rrgf10 RM304-RM147 12-2 RM117-RM155 22.4 -0.04 1.94表 8 二叶比 SPAD 的 QTLCh-Ini1) QTL Flanking Marker Ch-Inj1) QTL Flanking Marker LR ai2) h2ai5) aj2) h2aj5)2-3 RM211-RM233A 4-9 RM241-RM303
26、 38.92-16 rrgs2 RM263-RM221 8-1 RM337-RM152 33.1 -0.05 2.453-3 rrgs3 RM175-RM36 7-7 rrgs7 RM11-RM346 31.3 0.03 1.19 -0.04 2.043-8 MRG2803-RM282 7-2 RM427-RM298 21.93-17 RM293-RM143 6-3 rrgs6 RM510-RM314 31.9 -0.04 1.677-6 RM2-RM11 9-1 RM245-RM215 20.7 0.04 1.5010-1 rrgs10 RM222-RM216 12-1 RM19-RM117
27、 39.3 -0.04 1.5911-1 RM286-RM20B 12-1 RM19-RM117 20.410表 9 剑叶持绿时间的 QTL Ch-Ini1) QTL Flanking Marker Ch-Inj1) QTL Flanking Marker LR ai2) h2ai5) aj2) h2aj5)1-5 RM259-RM312 8-11 RM210-RM80 30.0 1-16 RM473B-RM302 4-2 lfyhd4 MRG5943-RM261 20.5 -2.0 4.8 2-6 lfyhd2 RM555-RM53 8-9 RM342A-RM284 32.2 2.0 4.7
28、 3-20 lfyhd3 RM570-RM85 10-2 lfyhd10 RM216-RM311 25.7 -1.8 3.6 -1.2 1.7 4-2 MRG5943-RM261 5-10 RM108A-RM274 31.8 -1.9 4.3 4-13 RM348-RM131 7-1 RM295-RM427 22.2 6-3 RM510-RM314 6-7 lfyhd6 RM121-RM136 29.4 -1.9 4.2 表 10 二叶持绿时间的 QTLTrait Ch-Ini1) QTL Flanking Marker Ch-Inj1) QTL Flanking Marker LR ai2)
29、 h2ai5) aj2) h2aj5)lsyhd 2-2 RM154-RM211 11-1 RM286-RM20B 18.7 6-2 RM190-RM510 6-7 lsyhd6 RM121-RM136 25.1 -1.9 4.5 7-1 RM295-RM427 8-4 lsyhd8 RM25-RM126 23.3 2.5 7.9 1.2.3.5 产量性状定位利用珍汕 97 与大穗亲本 HR5 组合衍生的 RIL 群体进行两年田间试验并构建遗传连锁图谱， 对产量性状进行了 QTL 分析（表 11）。第 7 染色体两年均检测到产量 QTL，在 2003 年贡献率达到 22.8。两年均在第 3 和
30、第 7 染色体上检测到影响每穗颖花数主效 QTL，尤其以第 7 染色体上的 QTL 加性效 应最大（19.6 和 23.7），同时第 7 染色体上的 QTL 影响每穗实粒数。对灌浆 期主要功能叶 剑叶长和宽也进行了定位，第 7 染色体上的 QTL 影响剑叶长，第 4 染色体上的 QTL 控制剑叶宽。同时第 7 染色体上的 QTL 也是控制抽穗期的主效 QTL。表 11 大穗群体产量性状和剑叶性状 QTL 定位初步结果Trait Chr. Interval LOD Add. Var %产量 01 （克） 1 RM128-RM102 3.2 3.5 8.37 RM180-CH746 4.5 4.2 10.9
