1、第一章 1、 酶 Enzyme：生物体自身产生的具有催化作用的蛋白质。 全酶：酶蛋白与辅助因子结合所形成的具有催化活性的复合物。 辅助因子：属于结合蛋白质的酶其中非蛋白质的部分即为酶的辅助因子，包括金属离子及有机化合物。本身不具有催化性，却是全酶活性所必须的。 试比较酶与一般化学催化剂的异同点。 共同点： （ 1）通过降低化学反应的活化能而加速反应进行 （ 2）不能改变化学反应的平衡点 （ 3）反应前后，自身不变 不同点： （ 1）酶催化的高效性 （ 2）酶作用高度的专一性 （ 3）酶作用条件的温和性 （ 4）酶活性的可调控 性 2、 辅基 ：以共价键和酶蛋白较牢固地结合在一起，不易透析除去的
2、辅助因子。 辅酶 ：与酶蛋白结合的很松弛的辅助因子。可以通过透析或其他方法将它从全酶中除去。 底物载体 ： 某些非蛋白质化合物，如脱氢酶中的尼克酰胺 -腺嘌呤二核苷酸（ NAD+ ）本身不是酶的一个组成部分，但它又是酶催化作用所必需的，在酶催化反应中起了携带电子、质子和功能基团的作用 。 3、酶的专一性：一种酶通常只作用于某一类或某一种特定的物质，进行特定的反应。 反应专一性：指酶催化某一类反应，不催化其他键的水解。 底物专一性：指对某一种特定底物或 某一类底物的催化反应。可分为绝对专一性与相对专一性。 专一性： S p e ci f ici t y专一性类型 催化性质 例子反应专一性 : (
3、 键专一性 ) 催化某一反应 酯酶绝对专一性 催化某一特定底物反应过氧化氢酶底物专一性相对专一性族或基团专一性催化某一类底物反应葡萄糖苷酶旋光异构专一性 催化 d- 型成 L- 型 L- 氨基酸氧化酶专一性 :立体专一性 顺反异构专一性 催化顺式或反式 延胡索酸酶思考题 Papain 能否水解下列人工合成小底物，程度如何？并解释之 1.Bz-Arg-NH2 2.CBO-(NO2)Arg-OMe 3. (CBO)Lys-NH2 4. Leu-NH2 5. Bz-Leu-NH2 6. Bz-D-Leu-NH2 7. Bz-Leu-Ala 8. Bz-Arg-Leu 9. CBO-Arg-OMe P
4、apain 可水解许多氨基酸羧基提供的酯键 酰氨键 肽键 ， 碱性氨基酸为主 ， 也可是中性氨基酸 ， 但不作用酸性氨基酸。且 -氨基都必须保护。碱性氨基酸的侧链不能被取代，否则活力大大下降。作用键附近不能有游离的 -COOH。必须是 L-型的。 Bz-Arg-NH2 4+ Arg 呈碱性，酰胺键易被水解，但是作用效果小于酯键 CBO-(NO2)Arg-OMe + 侧链被取代但 -氨基有保护 （ CBO） Lys-NH2 0 氨基游离未保护 Leu-NH2 -氨基无保护， Leu 为中性氨基酸 Bz-Leu-NH2 2+ Leu 附近的酰胺键会水解，但是效果较弱 Bz-D-Leu-NH2 0
5、酶的旋光专一性使得仅对 L 型具有作用效果 Bz-Leu-Ala -氨基有保护， Leu 为中性氨基酸。为肽键。有游离的-COOH Bz-Arg-Leu Arg 是碱性的氨基酸， -氨基有保护，但有游离的 -COOH CBO-Arg-OMe 5+ Arg 呈 碱性，酯键易被水解 第二章 1、 酶的命名原则 -国际系统命名法 * 2、 酶编号方法： 试说明下面酶的国际编号的意义及酶的反应性质： （ 1） EC 3.1.3.1 EC 表示国际酶学委员会； 第一个数字 3 表示第三大类酶 水解酶类。 第二个数字 1 表示第三大类中的第一亚类 作用于酯键的酶。 第三个数字 3 表示该亚类中的第三次亚类
6、 磷酸单酯。 第四个数字 1 表示该次亚类中的第一号酶 碱性磷酸酶。 反应性质：在碱性条件下，催化磷酸形成的酯键的水解反应。 （ 2） EC 1.2.3.1 EC 表示国际酶学委员会； 第一个数字 1 表示第一 大类酶 氧化还原酶类； 第二个数字 2 表示第一大类中的第二亚类 以醛基或酮基作为供体； 第三个数字 3 表示该亚类中的第三次亚类以 O2 为受体； 第四个数字 1 表示该次亚类中的第一号酶 乙醛氧化酶。 反应性质：催化乙醛与氧化剂（氧气）的反应生成乙酸。 3、 六大类酶及其催化特点 氧化还原酶类 :Oxido-reductases 催化氧化还原反应 A H 2 + B A + B H
7、 2 O H 其中： AH 2 为还原剂，起氧化反应，被 B 氧化， B 为氧化剂，起还原反应，被 AH2 还原 :Transferases 催化功能基团的转移反应 A X + B A + B X 其中： X 为被转移基团， B 为受体， AX 为供体， X 从 AX 上被转移到 B 上。 水解酶类 :Hydrolases： 催化水解反应 A O H + B HA B H O H 裂合酶类 :Lyases： 催化裂解或缩合反应 A + BA B 异构酶类 :Isomerases：催化同分异构体的异构化作用 A B 合成酶类 :Ligases 催化与分解相偶联 ,由两种物质合成一种物质的反应 X
8、 + Y + A T P X Y + A D P + P i第三章 1、 辅酶、辅基在酶催化中的作用？ 2、 几种重要的辅酶：分别是什么酶的辅助因子 黄素核苷酸 (FMN、 FAD) (含 Vit B2) ： 黄素酶（氧化还原酶） FAD 为辅基的酶： D-氨基酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、醛氧化酶、 NADH 脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、 FMN 为辅基的酶： L-氨基酸氧化酶 二硫辛酸 ： 是丙酮酸脱氢酶复合体中二硫辛酰转乙酰基酶的辅基 谷胱甘肽 GSH ： 乙二醛酶 三磷酸腺苷： ATP ppt 上很多 尿嘧啶核苷酸辅酶 蔗糖： UDP 转糖基酶 胞嘧啶核苷酸辅酶 不造 四氢叶酸 在氨基酸、嘌呤代谢
9、酶系中，传递： -CH2OH、 -CH3、 -CHO、 -CH2NH2 生物素 在羧化反应中，作为羧化酶的辅基，与转移羧基有关 辅酶 A 乙酰化酶和转酰酶 焦磷酸硫胺素 丙酮酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶。 a-酮酸非氧化脱羧、 a-酮酸氧化脱羧 a-乙酮醇的生成和转移 磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺 作为转氨酶和氨基酸脱羧酶的辅酶，在蛋白质代谢中的作用 辅酶 B12 甲基丙二 酰 SCoA 变位酶、谷氨酸变位酶 第四章 1、 凝胶过滤柱层析原理与方法？ 分子筛柱层析、排阻层析、凝胶渗透层析 利用网状结构凝胶的分子筛作用，根据蛋白质分子的大小不同分离。 2、 离子交换柱层析原理与方法？ 3、 盐析法分离蛋白
10、质的原理和方法 思考题 16、 假设混合液中有五种酶， E1， E2， E3， E4， E5，其分子量及值分别如下情况： 试说明： （ 1）它们经过 Sephadex G-150 柱的分离顺序。 E5, E1, E2, E3, E4. 根据分子大小，从大到小顺序 （ 2）它们经过 DEAE-Cellulose (pH 7.0)柱的分离顺序。在 pH 7.0 环境中， DEAE 带正电荷，能与带负电荷的蛋白质结合，要求蛋白质要带负电（ pI E1 E2 E4. （ 3）通过 CM-Sephadex （ pH 7.0）柱的顺序。 E4 E2 E1 E5 E3. 说明： E4、 E2、E1 在 pH
11、7 下带负电荷，不 能与胶结合，先被洗下，其顺序依分子大小。 E5、 E3 带正电荷，可以与胶结合，根据结合强弱和分子量大小依次被洗下。 15、 根据你所学的知识，设计一个对某酶的分离提纯方法（原则），又根据什么原则得知该酶确实已经提纯了？ 答：具体纲要如下： 分子量 PI E1 150K 6.0 E2 80K 5.0 E3 30K 9.0 E4 20K 4.0 E5 210K 8.0 （ 1）前处理：选择含该酶较丰富的生物材料，经组织细胞破碎，用缓冲液对酶抽取 （ 2）粗分离：硫酸氨分级分离，找出盐析浓度范围，获得粗酶制品。 （ 3）细分离：凝胶过滤柱层析： Sephadex G 100，根
12、据分子量大小来分离。 离子交换柱层析： DEAE-纤维素、或 CM-纤维素；根据 带电性来分。 （ 4）纯度鉴定： PAGE， SDS-PAGE，等电点 -PAGE， 9、假设提取液中含有三种酶，其性质如下，请设计实验方案来分离纯化这三种酶。 （其他答案）实验方案： 法一： 1.分子筛，分离与； 2.离子交换层析，分离与 法二：离子交换层析，分离与 分子筛，分离与 法三： Sephadex 法直接一步将三者分离 第五章 1、何谓酶的活力和比活力？其大小说明什么问题？ 酶的活力 ：酶催化一定化学反应的能力。 值大小，表示在一定条件下所催化的某一化学反应速度。活力越大，反应速度越快。 比活力 ：每
13、毫克蛋白所含的酶活力单位。 值大小，可用来比较每单位重量酶蛋白的催化能力，比活力越高，说明酶的纯度越高。 2、称取 50mg 某商品蛋白酶粉，配制成 25mL 酶溶液。取出 0.1mL 酶液，在以酪蛋白为底物的测活体现中检测蛋白酶活力，得知， 30min 后，可以产生 900 微克的酪氨酸（ Tyr）；另取 5mL 酶液，用凯氏定氮法测得蛋白氮为 0.40mg。以每 分钟产生 1 微克的酪蛋白（ Tyr）的酶量为一个活力单位，请计算： 1)每毫升酶溶液的酶活力； 蛋白质 分子量 等电点 PI A 20kD 8.5 B 21 kD 5.6 C 5 kD 5.5 2)酶的比活力； 3)1g 样品所
14、具有的总活力单位。 答：按蛋白质中氮的质量分数为 16%计算， 5mL 酶液中，蛋白质量为 0.4mg*6.25=2.5mg。 1)900ug/30min/0.1mL=300U/mL; 2)300U/mL*5mL/2.5mg=600U/mg; 3)300U/mL*25mL/0.05g=1.5*105U/g. 3、 请计算表中每的分离提纯步骤： ？ 第六章 1、 米氏方程建立、米氏方程的应用。 步骤 总体积（ ml） 蛋白浓度 总蛋白mg 活力U/ml 总活力U 比活力U/mg 纯化 得率 匀浆过滤液 4000 7.24 28960 20.3 81200 2.8039 1 亚丁醇处理上清液 47
15、00 2.23 10481 33.8 158860 15.157 5.4057 100 0.35Sat 硫铵上清液 4400 1.45 6380 35.3 155320 24.345 8.6825 97.8 0.70Sat 沉淀溶解透析离心上清液 403 6.33 2550.99 314.7 126824.1 49.716 17.731 79.8 DEAE-32 酶液 48 7.65 367.2 2034.5 97656 265.95 94.850 61.5 Sephadex G75 酶液 66 0.94 62.04 915.5 60423 973.94 347.35 38.0 Sephade
16、x G200 酶液 34 0.39 13.26 1090.3 37070.2 2795.6 997.04 23.3 DEAE-52 酶液 30 0.19 5.7 943.3 28299 4964.7 1770.6 17.8 2、 Km、 Vm 的测定，双倒数作图方法及应用 Lineweaver-Burk 作图法 (双倒数作图法 :1/ v 1/ s) 3、米氏方程的积分形式。课本 P81 4、如何判断最适底物。 5、酶催化反应的动力学模型及动力学方程： a. 也称为动力学机理，是描述酶怎样与其底物和产物结合而形成中间物的方程式。 b.依据动力学模型，推导出的能够表 示反应速度与底物浓度的方程式
17、。 6、 比速度 ：每单位酶浓度所对应的反应速度。 思考题 9. 某酶作用于底物 A 的 Km 是 2 10-3 M，假定初始底物为 10-5 M， 1 分钟终了时，有 2%底物转变成产物，（ 1）在 3 分钟终了时，底物转变成产物的百分数是多少？（ 2） 3 分钟后，底物和产物浓度各为多少？（ 3）底物转变 8%为产物所需要的时间为多少？（ 4）随着酶浓度的不断利用，可达到的最大反应速度 Vm 为多少？（ 5） S0 为多少是可以测到 Vm？（ 6）在 S 为这浓度下， 3 分钟底物会有百分之几转变成产物，这时产物 浓度为多少？ SK SVv smvV sK svKV s Vmmmm m ,
18、 1 1 1E + S E S E + Pk 1k - 1 k 2k - 2)(E3213213221313212133330PkkkAkkkkkkkkkPkAkkPkkkkEPEAEEPkEPkv2、何谓米氏方程？讨论米氏方程并说明 Km 的意义。 德国化学家 Michaelis 和 Menten 根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式 V=Vms/(Km+s)，称为米氏方程。 a) 由米氏方程可知，当反应速度等于最大反应速度一半时 ,即 V = 1/2 Vmax, Km = S。 上式表示 ,米氏常数是反应速度为最大值的一半时的底
19、物浓度。 因此 ,米氏常数的单位为 mol/L。不同的酶具有不同 Km 值，它是酶的一 个重要的特征物理常数。 b) Km 值只是在固定的底物，一定的温度和 pH 条件下，一定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的 Km 值。 c) Km 值表示酶与底物之间的亲和程度： Km 值大表示亲和程度小，酶的催化活性低 ; Km 值小表示亲和程度大 ,酶的催化活性高。 第七章 酶的抑制作用及抑制动力学 1、如何区别可逆抑制作用与不可逆抑制作用？ 可逆抑制 ：抑制剂与酶分子非共价结合引起酶活力降低或丧失作用，透析等物理法可以使酶活力恢复的抑制类型； 不可逆抑制： 抑制剂与某些必须基团共价结合，使酶失活
20、 ，酶活力不可通过透析等物理方式恢复的抑制类型。 可由动力学涉及以下实验判断是否可逆。 实验方法一：一定量的抑制剂于一定量的酶液与一起保温，一段时间后，从保温的混合物中取出不同量的酶，在等量体积的反应体系中，测定酶促反应的初速度，用反应的初速度对测活体系中的酶浓度作图，若所得的图像为斜率相等的直线，则为可逆抑制，若所得直线的斜率逐渐降低，则为不可逆抑制。 实验方法二：在测活体系中，将不同量的酶加入体积恒定且含一定量的抑制剂，并控制同样反应体系，以同样的方法测定初速度，以初速度对加入的酶浓度作图。若得到一过零点 的直线则为可逆抑制，若得到一条不过零点的直线则为不可逆抑制。 2、 Ks 型和 Kc
21、at 型抑制剂 两者均为不可逆抑制剂。 Ks 型抑制剂 ：具有专一性的化学结构并带有一个活泼的化学基团的类似物，它可与相应的酶结合，而且与酶中的必需功能基团反应，从而抑制酶的活力。这种抑制方式是通过它对酶的高亲和力来进行标记修饰的，称为亲和标记试剂。 Kcat 型抑制剂 ：是根据酶的催化过程来设计的，它们与底物类似，既能与酶结合，也能被酶催化发生反应；在其分子中具有潜伏反应基团，其会被酶催化而活化，并立即与酶活性中心某基团呈不可逆结合， 使酶遭抑制，又被称为自杀性底物。 3、 4 种可逆抑制作用的特点、动力学方程、抑制常数测定 4、抑制作用的 IC50 测定、抑制率测定 思考题 1、（ p12
22、0:5) 酶催化反应： 根据快速平衡理论，米氏常数 Km 等于 Ks,若反应中有竞争性抑制剂存在，这是表观米氏常数（ Km）增大，那么 Ks 值也增大吗？为什么？ 竞争性抑制剂存在下的表观米氏常数 Km=Km(1+I/Ki)，由于竞争性抑制剂的存 在，表观米氏 常数增大，但11kkKs ， Ks 为 ES 的解离常数因为竞争性抑制剂只与 E 结合，不与 ES 结合，所以不会对 ES 的解离常数产生影响。 8、为什么在竞争性抑制类型中，抑制剂的影响结果不改变 Vm，而只影响 Km，但在非竞争性类型中，它不影响 Km，而只改变 Vm，试说明之。 （ 1）因为竞争性抑制剂与酶的结合与底物相互竞争，抑
23、制剂与酶结合阻止底物与酶结合，底物与酶的结合也阻止抑制剂与酶的结合。当底物浓度很大（大大于 Km值），酶活性中心完全被底物所占据，抑制剂就不能与酶结合，抑制作用可以被排除。因此， Vm不变，而 Km是反应达到最大速度一半点底物浓度，在有竞争性抑制剂存在下需要更高的底物浓度方能达 到饱和，因此 Km值增大。 7、说明三种抑制剂（竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制）的 IC50 与抑制常数的关系？（ IC50为使酶活力抑制 50%所需的抑制剂浓度。） C:错误 !未找到引用源。 =错误 !未找到引用源。 ,I=错误 !未找到引用源。 NC:错误 !未找到引用源。 =错误 !未找到引用源。 ,I=错误 !未找到引用源。 UC:错误 !未找到引用源。 =错误 !未找到引用源。 ,I=错误 !未找到引用源。
