总胆汁酸测定试剂盒酶循环法注册.DOC

1、 1 总胆汁酸测定试剂盒（酶循环法）注册 技术审查指导原则 （ 征求意见 稿） 本指导原则旨在指导注册申请人对总胆汁酸（ Total bile acids， TBA）测定试剂 （盒） 注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对总胆汁酸测定试剂 （盒） 的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中的具体内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特征对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员适用的指导文件，不涉及注册审批等行政 事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也

2、可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规、国家标准、行业标准的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准体系的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 本指导原则适用于基于酶循环法原理，利用全自动生化分析仪、半自动生化分析仪或分光光度计，体外定量测定人血清或血浆中总胆汁酸含量的测定试剂盒。本指导原则适用于进行首次注册申报和相关许可 事项变更的产品。 从方法学考虑，本指导原则适用于采用 3 -羟基类固醇脱氢酶（ 3 2 -HSD）催化的酶促循环反应，利用全自动、半自动生化分析仪或分光光

3、度计， 在 405nm 波长 附近 测定生成的 硫代 还原 型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Thio-NADH)的 吸光度变化，计算总胆汁酸含量的测定 试剂（盒） 。 反应原理如图所示。 胆汁酸 （ Bile acid） 被 3 -羟基类固醇脱氢酶（ 3 -HSD）及硫代氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ Thio-NAD+）特异性地氧化，生成 3 -酮类固醇 （ 3 -KS） 及硫代还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Thio-NADH)。 此外，生成的 3 -酮类固醇在 3 -羟基类固醇脱氢酶（ 3 -HSD）及还原型辅酶 I（ NADH） 存在下，生成胆汁酸和 氧化型辅酶 I(NAD+)。如此循环往复从而放

4、大微量的胆汁酸量，在 405nm 波长 附近 测定生成的硫代还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (Thio-NADH)的吸光度变化，计算总胆汁酸含量 。 Thio-NAD+ Thio-NADH 3-HSD 胆汁酸 3-酮类固醇 BILE ACID 3-KS NAD+ NADH 依据体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第 5 号，以下简称办法）、食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知（食药监械管 2013 242 号），总胆汁酸检测试剂盒属于用于其他生理、生化或免疫功能指标检测的检测试剂， 管理类别为二类，分类代码为 6840。 二、注册申报资料要求 （一）综述资料 综述资

5、料主要包括产品预期用途、产品描述、有关生物安全性方面的 3 说明、研究结果总结以及同类产品上市情况介绍等内容，应符合体外诊断试剂注册管理办法和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告 2014 年第 44号）的相关要求。相关描述应至少包含如下内容： 1.产品预期用途及相关的临床适应症背景情况 （ 1）总胆汁酸的生物学特征、结构与功能，在体内正常和病理状态下的代谢途径和存在形式。 （ 2）与预期用途相关的临床适应症背景情况，如临床相关疾病的发生、实验室诊断方法等。 2.产品描述：包括产品所采用的技术原理，主要原材料的来源及制备方法，主要生产工艺过

6、程，校准品（质控品）的制备方法及溯源（定值）情况。 3.有关生物安全性方面的说明：由于体外诊断试剂中的主要原材料可能是由各种动物、病原体、人源的组织和体液等生物材料经处理或添加某些物质制备而成，人源性材料须对有关传染病（ HIV、 HBV、 HCV 等）病原体检测予以说明，并提供相关的证明文件，其他动物源及微生物来源的材料，应当提供相应的说明文件。为保证产 品在运输、使用过程中对使用者和环境的安全，应提供对上述原材料所采用的灭活等试验方法的说明。 4.有关产品主要研究结果的总结和评价。 5.其他：包括同类产品在国内外批准上市的情况。相关产品所采用的技术方法及临床应用情况，申请注册产品与国内外同

7、类产品的异同等。 （二）主要原材料的研究资料 （如需提供） 包括主要反应成分、质控品、校准品等的选择、制备、质量标准确定的方法及研究资料；校准品应提供详细的量值溯源资料，包括定值试验资料和溯源性文件等；质控品应提供详细的定值资料。 4 （三）主要生产工艺和反应体系的研究资料（如 需提供） 主要工艺包括：配制、分装 、冻干 等描述及确定依据，应包含产品的工艺流程图和关键控制点；反应体系包括样本采集及处理、样本要求、试剂用量、反应条件（温度、时间等）等研究资料。不同适用机型的反应条件如果有差异应分别详述。 （四）分析性能评估资料 申请人应当提交 3 批产品的 全部 分析性能 评估 资料 ，对于每项

8、分析性能的 评估 都应包括具体的研究项目、实验设计、研究方法、可接受标准、试验数据、统计方法、研究结论等详细资料。性能评估时应将试剂和所选用的校准品、质控品作为一个整体进行评价，评估整个系统的性能是否符合要求。有关 分析性能验证的背景信息也应在申报资料中有所体现，包括实验时间、地点、检验人员、适用仪器、试剂规格和批号、所选用的校准品和质控品（品牌、规格、批号等）、临床样本来源等。 对于 TBA 定量测定试剂，分析 性能评估应至少包括 试剂空白吸光度、试剂空白吸光度变化率、 准确度、精密度、线性区间、分析灵敏度、分析特异性等 性能指标 。 对冻干品，应进行分光光度稳定性考察。 1.准确度 1.1

9、 与国家（国际）参考物质的比对研究 用 参考物质或 有证 参考物质 （ CRM）和相应的参考测量程序对试剂（盒）进行测试， 重复测定 3 次， 取测试结果均值， 计算 相对偏差。 或用由参考方法定值的高、低 2 个浓度的人血清 （分为正常范围和病理范围） 对 试剂（盒） 进行测试，每个浓度样本重复测定 3 次，分别取测试结果均值，计算相对偏差。 1.2 回收试验 在人血清样品中加入一定体积标准或校准品 或纯品 溶液，每个浓度重 5 复测定 3 次，计算回收率。 回收试验注意事项： 1.2.1 加入的标准溶液体积与血清体积比应不大于 1:20 或其体积比不会产生基质的变化。 1.2.2 加入标准

10、溶液或校准品溶液后 ， 样品总浓度应在 试剂（盒） 测定线性范围内。 1.2.3标准溶液或校准品应有溯源性。 1.3 比对试验 采 用参考方法或国内 /国际普遍认为质量较好的已上市同类试剂作为参比方 法，与拟申报试剂同时检测一批病人样品（ 用不少于 40 个在测定浓度区间内不同浓度的人血清样品 ），从测定结果间的差异了解拟申报试剂与参比方法间的偏倚。如偏倚很小或在允许的误差范围内，说明 两检测系统对病人标本测定结果基本相符，对同一份临床样本的医学解释，拟申报试剂与参比方法相比不会产生差异结果。 在实施方法学比对前，应分别对拟申报试剂和参比试剂进行初步评估，只有在确认两者都分别符合各自相关的质量

11、标准后方可进行比对试验。方法学比对时应注意质量控制、样本类 型、浓度分布范围并对结果进行合理的统计学分析。 2.精密度 2.1 批内精密度 批内 精密度评估应至少 选择 高、低两个浓度水平的 样本（或质控品）进行， 两个浓度都应在试剂盒的测量范围内且有一定的临床意义 ， 通常选用该检测指标的正常参考值附近和异常高值样本。批内精密度 (变异系数CV)应不大于 5.0%， 瓶间差（冻干粉）应不大于 5.0%。 2.2 批间精密度 6 用同一质控品 分别测试 3 个不同批号的试剂，每个批号测定 3 次， 分别计算每批 3 次测定的均值 。相对极差应不大于 10.0%。 3.线性区间 建立试剂线性区间

12、所用的样本基质应尽 可能与临床实际检测的样本相似，理想的样本为分析物浓度接近预期测定上限的混合人血清，且应充分考虑多倍稀释对样本基质的影响。 以接近线性范围上限的高浓度 （活性） 样品和接近线性区间下限的低浓度 （活性） 样品 或蒸馏水 ，混合成至少 5 个稀释浓度（ xi）。 分别测试试剂（盒） ，每个稀释浓度 建议 测试 3 次，分别求出测定结果的均值（ yi）。以稀释浓度（ xi）为自变量，以测定结果均值（ yi）为因变量求出线性回归方程，并计算线性 回归的 相关系数（ r）。线性相关系数 r 应不小于0.9900。 4.分析灵敏度 试剂（盒） 测试给定浓度的被测物时 ，在 试剂（盒）

13、规定参数下所得的单位浓度吸光度变化率（ A/min）应符合申请人规定范围。 5.分析特异性 对样本中常见的干扰物质进行检测，如胆红素、甘油三酯、 总 胆固醇、维生素 C、血红蛋白等，方法为对模拟添加样本分别进行验证，说明样本的制备方法及干扰实验的评价标准，确定可接受的干扰物质极限浓度。 药物干扰的研究可根据需要由申请人选择是否进行或选择何种药物及其浓度进行。 6.校准品溯源及质控品赋值 校准品应当提交完整的溯源性文件，包括赋值试验资料和溯源 SOP文件等。应参照 GB/T 21415 2008体外诊断 医疗器械 生物样品中量的测量 校准品和控制物质赋值的计量学溯源性的要求，提供企业（工作） 7

14、 校准品及 试剂（盒） 配套校准品赋值及不确定度计算记录。质控品应提供详细的定值资料。 7.其他需注意 的 问题 应当对三批产品进行性能评估，对结果进行统计分析。不同适用机型、不同包装规格，应分别提交分析性能评估报告。如注册申请中包含不同的包装规格，需要对不同包装规格之间的差异进行分析或验证。如不同的包装规格产品间存在性能差异，需要提交采用每个包装规格产品进行的上述项目评估的试验资料及总结。如不同包装规格之间不存在性能差异，需要提交包装规格之间不存在性能差异的详细说明，具体说明不同包装规格之间的差别及可能产生的影响。 （五）参考区间确定资料 应提交建立参考区间所采用样本来源及详细的试验资料。应

15、明确参考人群的筛选标准，研究各组（如性别、年龄等）例数应符合统计学要求。 若引用针对中国人群参考值范围研究的相关文献，应明确说明出处，并进行验证。参考值研究结果应在说明书【参考区间】项中进行相应说明。 （六）稳定性研究资料 稳定性研究资料主要涉及两部分内容，申报试剂的稳定性和适用样本的稳定性研究。 试剂的稳定性包括实时稳定性、运输稳定性、开瓶 （待机）稳定性及冻融次数限制 （如适用） 等，申请人应至少提供 3 个生产批次的实时稳定性研究资料，并提供 1 个生产批次的开瓶稳定性和运输稳定性研究资料，包括研究目的、材料和方法、研究结论等，研究应涵盖产品的主要性能指标，申请人应至少能提供在实际储存条

16、件下超过声称有效期的除装量和批间差外的评价资料。试剂的稳定性研究应注意选取代表性包装规格进行研究。适用样本的稳定性主要包括室温保存、冷藏 或 冷冻条件下的有效期验 8 证，可以在合理温度范围内选择温度点（温度范围），每间隔一定的时间段即对储存样本的稳定性进行分析验证，从而确认不同 类型样本的效期稳定性。适于冷冻保存的样本还应对冻融次数进行评价。 试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。 （七）临床评价资料 按照关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告（国家食品药品监督管理总局通告 2014 年第 16 号）执行。同时研究

17、资料的形式应符合体外诊断试剂注册管理办法（国家食品药品监督管理总局令第5 号）和关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（国家食品药品监督管理总局公告 2014 年第 44 号）临 床研究资料有关的规定。 如 总胆汁酸 测定试剂可免于进行临床试验， 申请人可依照总局关于发布免于进行临床试验的体外诊断试剂临床评价资料基本要求（试行）的通告（国家食品药品监督管理总局通告 2017 年第 179 号）开展评价。申请人如无法按要求对“目录”中产品进行临床评价，应进行临床试验。下面仅对临床试验中的基本问题进行阐述： 1.研究方法 采用参考方法或国内 /国际普遍认为质量较好的已上市同类

18、试剂作为参比方 法， 采用拟申报产品与之进行对比试验研究，证明拟申报产品与已上市产品等效。 对比试验结果不一致（检测值差异较大）的 样本应采用公认较好的第三方试剂进行验证。 2.临床研究单位的选择 应在至少两家经国家药品监督管理局备案的临床试验机构开展临床 9 试验。临床试验机构实验操作人员应有足够的时间熟悉检测系统的各环节（试剂、质控及操作程序等），熟悉评价方案。在整个实验中，待评试剂和对照试剂都应处于有效的质量控制下，最大限度保证试验数据的准确性及可重复性。 3.伦理要求 临床试验必须符合赫尔辛基宣言的伦理学准则，必须获得临床试验机构伦理委员会的同意，如该临床试验对受试者几乎没有风险，可经

19、伦理委员会审查和批准后免于受试者的知情同意。 4.临床试验方案 临床试验实施前，研究人员应从流行病学、统计学、临床医学、检验医学等多方面考虑，设计科学合理的临床研究方案。建议临床前开展预试验工作，最大限度地控制试验误差。各临床试验机构的方案设置应保持一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室承担本实验的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。 试验方案中应确定严格的病例纳入 /排除标准，任何已经入选的病例再被排除出临床研究都 应记录在案并明确说明原因。在试验操

20、作过程中和判定试验结果时应采用盲法以保证试验结果的客观性。各临床试验机构选用的参比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。另外，待评试剂的样本类型应不超越参比试剂的样本类型。 临床试验方案必须获得临床试验机构伦理委员会的同意。 5.研究对象选择 临床试验应选择具有特定症状 /体征人群作为研究对象。注册申请人在建立病例纳入标准时，应考虑到不同人群的差异，尽量覆盖各类适用人 10 群。在进行结果统计分析时，建议对各类人群分别进行数据统计分析。总体样本数不少于 200 例，异常值样本比例应不 低于试验总量的 30%。样本中待测物浓度应覆盖待评试剂线性范围，且尽可能均匀分布。 应明确样本存贮条件、可

21、否冻融等要求及避免使用的样本，血浆应明确抗凝剂的要求。实验中，尽可能使用新鲜样本，避免贮存。如无法避免使用贮存样品时，注明贮存条件及时间，在数据分析时应考虑其影响。 如果待评试剂同时适用于血清和血浆样本类型，可完成一个样本类型不少于 200 例的临床研究，同时验证至少 100 例受试者的血浆样本测试结果间的一致性（采用待评试剂检测），其中不同浓度样本分布情况与总例数中分布情况应一致。也可以分别对同时适用的多个样本 类型按照关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告（国家食品药品监督管理总局通告 2014 年第 16 号）中试验样本量一般要求规定的 200 例进行试验，异常值参照上述规定。

22、涉及产品检测条件优化、增加与原样本类型具有可比性的其他样本类型等变更事项，临床试验采用变更后产品与变更前产品或者已上市同类产品进行比对试验，在至少 2 家（含 2 家）临床试验机构开展临床试验，总样本数不少于 100 例，异常值样本数不少于 30%。变更主要原材料的供应商（新增加）、参考区间及增加临床适应症等变更事项，应根据产品具体变更情况，酌情增加临床试验总样本数。 6.统计学分析 对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法，如相关分析、线性回归、一致性分析、绝对偏倚 /偏差及相对偏倚 /偏差分析等。若涉及离群样本应明确原因 。对于对比实验的等效性研究，最常用是对待评试剂和参比试剂两组检测结果的相关及线性回归分析，应重点观察相关系数（ r 值）或判定系数（ R2）、回归拟合方程（斜率和 y 轴截距）等指标。结合临床