1、1 基因工程的概念基因工程的概念 利用 DNA 体外重组或 PCR 扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组 DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程 . 2 蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念 在基因工程技术对编码蛋白质的基因的了解基础上，对蛋白质的氨基酸序列、结构和功能进行分析，进而通过对蛋白质的结构、氨基酸序列和翻译后的修饰等手段改变甚至创造出新的和更有效的蛋白质。 2.1 蛋白质工程主要内容主要目标 蛋白质氨基酸序列的分 析，蛋白质晶体结构分析，蛋白质功能预测和分析，蛋白质组分析 3.基因
2、工程的诞生 基因工程诞生于 1973 年，它是数十年来无数科学家辛勤劳动的成果、智慧的结晶。从 40年代开始，科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。概括起来，从 40 年代到 70 年代初的基因工程诞生，在现代分子生物学领域理论上的三大发明及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用 3.1 理论上的三大发现 （ 1） 40 年代发现了生物的遗传物质是 DNA.(2） 50 年代搞清楚了 DNA 的双螺旋结构和半保留复制机理。（ 3） 60 年代确 定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的，每三个核苷酸组成一个密码子，代表一个氨基酸。 3.2 技术上
3、的三大发明 （ 1）限制性核酸内切酶的发现（ 2）对基因工程技术的突破的另一发现是 DNA连接酶的发现（ 3）基因工程载体的发现 3.3 基因工程的里程碑 1973 年，斯坦福大学的 S Cohen 等人，也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌 (E Coli)的抗四环素 (TCr)质粒 PSCl01 和抗新霉索 (Ner)及抗磺胺 (Sr)的质粒 R6 一 3，在体外用限制性内切酶 EcoRI 切 割，连接成新的重组质粒，然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中，选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子
4、。基因工程从此诞生，这一年被定为基因工程诞生的元年。 4。限制性内切酶的分类 I 型 ：识别特定序列，切割位点在距识别位点至少 1000 bp 处随机切割 II 型：识别特定序列并在识别位点处或附近切割 III 型：识别特定序列，切割位点在距识别位点 3端 2527bp 处随机切割 限制性内切酶的识别特点 1. 绝大多数酶的识别序列是特异的， 仅有少数有变动 2. 识别序列一般为 46 个碱基对，一般都富含 GC 3. 大多数识别序列具有 180旋转对称的回文结构（ Palindrome） 限制性内切酶的切割方式 DNA经限制酶切后，产生 2 种类型的末端 粘性末端 (sticky end)和
5、平整末端 (blunt end) -端突起 sticky 3end -端突起 sticky 5end 平整末端 blunt end The 5-end is phosphate（ 5-P ） and the 3-end is hydroxyl（ 3-OH） 2 种末端种类 ） - 端 突 起 ， 个 数 为 或 个 核 苷 酸 PstI 5-CTGCAG-35-CTGCA G-33-GACGTC-53-G ACGTC-5 ） - 端突起，个数为或个核苷酸EcoRI5-GAATTC-35-GOHPAATTC-33-CTTAAG-53-CTTAAPHOG-5 同裂酶（ isoschizomer）来
6、源于不同的生物，能识别相同顺序的限制酶 同尾酶 (isocaudamer)有些限制酶识别序列不同，但切割产生的末端是相同的 限制酶的星反应 (star activity)在变化的条件下，限制酶识别序列特异性降低 限制酶反应条件： DNA（ DNA的纯度与甲基化程度）、限制酶、反应缓冲液（ Tris-Cl、 NaCl、Mg2+）、反应时间与温度 Omega 核酸酶（ I-SceI）由酿酒酵母线粒体 rRNA基因中的内含子编码，用于 rRNA的剪切5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3TATT I-PpoI：来自于多头绒胞菌 Physarumpolycephalum 基因内含子 5-CTCT
7、CTTAAGGTAGC -3AATt 甲基化酶的种类与识别顺序 1.限制修饰系统 I、 II、 III 型中的甲基化酶三个系统中的甲基化酶可使细菌 DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成 5-甲基胞嘧啶和 6-甲基腺嘌呤：在 DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于 II 型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位点可同，可不同。 dcm 和 dam 甲基化酶对限制酶的影响 1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠 DNA连接酶广泛存在于各种生物体内，其催化的基本反应是： 将 DNA
8、双链上的相邻碱基的 5-PO4 和 3-OH共价结合形成 3-5磷酸二酯键 DNA连接酶不能够连接两条单链 DNA分子或环化单链 DNA。实际上， DNA连接酶是封闭双螺旋 DNA骨架上的切口（ nick） 连接反应是一个吸能的反应， E.coli及其它细菌以 NAD 为能源，动物及噬菌体以 ATP 为能源 连接酶的最佳反应温度是 37 ，但在这个温度下，粘性末端之间的氢键结合是不稳定的，因此连接反应的温度一般在 415 基因工程中常用的 DNA连接酶是 T4噬菌体 DNA连接酶 核酸水解酶 水解核酸链中磷酸二酯键 内切酶：在核酸 的内部切割，生成寡核苷酸 外切酶：从核酸链的末端开始，逐步水解
9、核酸链，释放单核苷酸 5353核酸外切酶 5335核酸外切酶 ds-DNA结构 : 切口 , 缺口 , 断口 Bal 31 核酸酶 分离自 AlteromonasespejianaBAL31 菌株 主要表现为 3端的核酸外切酶活性，同时伴有 5端外切及内切酶活性 上述活性严格依赖于 Ca2+的存在，可在反应的不同阶段通过加入螯合剂 EGTA以终止反应 主要用途是可控制性地截短 DNA分子 2. 外切核酸酶 III (ExoIII) 。从双链 DNA的 3-OH端逐一去除单核苷酸 。对无 Py、 Pu 位点的核酸内切酶活性 。 3磷酸酶活性：去除 3端磷酸基 (3-P) 。 RNaseH活性 。
10、主要用途是通过其 35的外切酶活性使双链 DNA分子产生出单链区， ExoIII 用于 DNA标记， ExoIII 用于顺序缺失 3. 外切核酸酶（ exo） .从单、双链 DNA的 5-PO4 基末端逐步切下 5-PO4单核苷酸，不能降解 5-OH端 .主要用途是将双链 DNA变为单链，供测序使用；除去 5-端突起，产生 3-端突起，便于加尾 4. S1 核酸酶 .特异性降解单链 DNA和 RNA，在最适条件下 , 降解单链的速度比双链快 75000 倍 .最佳 pH 4.5 5. 核糖核酸酶 .RNaseA 分离自牛胰脏，特异性降解 RNA .对热稳定（ 100 加热 15min 仍具活性
11、），抗去污剂 .用于除去 DNA样品中的 RNA分子 6. RNaseH .降解 DNA-RNA杂交分子中的 RNA链 .用于 cDNA文库建立时除去 RNA链以便第二条链 cDNA链的合成 7. 脱氧核糖核酸酶 I (DNaseI) .内切核酸酶，降解 ss-和 ds-DNA.当酶浓度很低时， ds-DNA分子上将形成切口 用途： .制备 RNA样品时除去 DNA分子 .切口移位，制备 DNA探针 1. 大肠杆菌 DNA聚合酶 I (E.coliDNA PolI) E.coliDNA PolI 的 3 种酶活性 .53DNA聚合酶活性，要求 3-OH的引物和模板 DNA .53核酸外切酶活性
12、，具有双链特异性 .35核酸外切酶活性，具有单链特异性，对 ds-DNA的降解活性很低，是 ss-DNA的过剩反应 用途： .除去 3-端突起的单链 DNA（在无 dNTP 时） .补齐 5-突起端 .合成第二条 cDNA.切口移位制备探针 2. 大肠杆菌 DNA聚合酶 I 大片段 .用枯草杆菌蛋白酶或胰蛋白酶降解大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 而得到的该酶的大片段，称为Klenow 片段 。没有 53外切酶活性，而保留了 53DNA聚合酶活性和 35外切酶活性 用途： .用同位素标记具 5端突起的 DNA片段末端 .补平 5粘性末端 .第二条 cDNA链的合成 .DNA序列测定 3. T4 D
13、NA聚合酶 .53DNA聚合酶活性 .35核酸外切酶活性，可作用于 ds-DNA和 ss-DNA, 其切除速度分别为 40 和 4000nt/min 4. T 7 DNA聚 合酶 .53DNA聚合酶活性和 35核酸外切酶活性 .T7 DNA聚合酶是所有已知的 DNA聚合酶中最富延伸性，一般不受 DNA二级结构的影响 .用基因工程方法去除 35外切酶活性的 T7 DNA聚合酶，其聚合酶能力增加 3 倍 测序酶 5. TaqDNA聚合酶 .分离自水生栖热菌，分子量为 94,000，最适反应温度 75 ，对 95 高温具良好稳定性，该酶不存在 35外切酶活性 .主要用于 PCR 扩增 6. 反转录酶
14、（依赖于 RNA的 DNA聚合酶） .AMV反转录酶：来源于鸟类骨髓母细胞瘤病毒 .M-MLV反转录酶：鼠白血病毒 酶活性： .以 RNA或 DNA为模板的 DNA聚合酶活性 .RNaseH 活性 .主要用于以 mRNA为模板合成 cDNA 核酸末端修饰酶 1. 碱性磷酸酶 除去 ss-DNA， ds-DNA 和 RNA分子两端的 3-和 5-磷酸基 .细菌碱性磷酸酶（ BAP） .牛小肠碱性磷酸酶（ CIP） CIP 对热敏感 2. T4 多聚核苷酸磷酸激酶 催化 ATP 中的 位的磷酸基转移到 ss-DNA、 ds-DNA和 RNA分子的 5-OH上 .转移反应（ I） .交换反应（ II
15、） 用途： .5-端末端标记 .分子克隆过程中获得 5-磷酸基末端，便于连接酶反应 3.末端脱氧核苷酸转移酶（ TdT） 5P OH 3TdT+dATP5P AAAAAAAAOH3以 3-突起端的 ds-DNA 作用效率为最高 变性法提取质粒 DNA的原理 在变性条件（碱性或高温 )下，线状染色体 DNA变性成为单链而完全分开，而 cccDNA虽然互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍彼此缠绕在一起。 当变性条件恢复时，质粒 DNA迅速复性恢复天然构型，染色体 DNA难以复性，交联形成不溶性网状结构，与变性的蛋白质和 RNA 缠绕在一 起，通过离心沉淀下来，而质粒 DNA存在于上清液中。 C
16、sCl密度梯度离心 原理： CsCl介质密度为 1.7g/cm3，超速离心后形成 1 1.9052 g/cm3 的密度梯度 EB（溴化乙锭）可嵌入 DNA两条链的碱基对之间，并因此导致双螺旋结构发生解旋反应 线性或开环 DNA分子，因其具有游离的末端而易于解旋，故可结合相当大量的 EB直到达到饱和 具有 ccc 结构的质粒 DNA由于负超螺旋的存在阻止 DNA解链，因而只能结合很少的 EB DNA分子中结合 EB越多，其浮力密度越小，因而形成不同的浮力密度得 以区分 RNase 的特点： 抗酸抗碱 ,具很广 pH作用范围 抗高温严寒 (065 均具活性， 100 也不能使之完全失活） 抗变性剂
17、（变性剂只能使之暂时失活，去除变性剂后又可恢复活性） 酶活性不需要辅助因子 存在范围广 解决办法： 外源 RNase：高温（干热 180 ， 4hrs），焦碳酸二乙酯 (DEPC)处理所有溶液（ TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套 内源 RNase：高温抽提，强蛋白质变性剂， RNase 抑制剂，蛋白酶 K等 核酸的浓缩与贮存 沉淀是核酸浓缩最常用的方法，其最大的优 点是通过核酸沉淀来改变核酸的溶解缓冲液及重新调节核酸在溶液中的浓度，可去除溶液中某些可溶性的盐离子与杂质，在一定程度上纯化核酸 沉淀 DNA的最常用方法是在 DNA溶液中加入 1/10 体积的 3M NaAc（或 KAc）和
18、 2 倍体积的乙醇，放置 15 30min，离心收集 DNA沉淀，倒去上清液，加入 70%的乙醇洗涤沉淀，去除残余的盐，再离心收集沉淀。 贮存 DNA：溶于 TE中，放置于 4 、 -20 、 -70 RNA： 溶于 0.3M NaAc(pH5.2)或 ddH2O 中， -70 长期保存可以沉淀形式贮存于乙醇 中， -20 核酸的质量评估方法 核酸浓度的测定 ds-DNA： 1 OD26050g/ml ss-DNA&RNA： 1 OD26040g/ml 单链寡核苷酸： 1 OD26020g/ml 核酸纯度的测定 DNA： A260/A280=1.8 若 1.8，说明 RNA未除尽 1.6，蛋白
19、质或酚未除尽 RNA： A260/A280=2.0 2.0，蛋白质或酚未除尽 凝胶电泳 一、核酸电泳的基本原理 核酸分子中的磷酸基团带负电荷，在电场中将向正极移动，通过凝胶的分子筛作用可以将不同大小和构型的核酸分 子分离，分子量小的 DNA，具有较紧密的构型，在凝胶中移动快；反之，分子量大的 DNA移动慢 染色剂 溴化乙锭（ EB）：嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外光下呈现橙色荧光 由于单链 DNA、 RNA中常存在自身配对的双链区，也可嵌入 EB分子 EB是一种诱变剂，见光易分解 脉冲场凝胶电泳 在常规电泳中， DNA移动距离与分子量有关：分子量小的移动快，反之则慢 大于 20kb的 DN
20、A大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些 DNA分子要通过胶孔时必须发生变形，并沿分子长轴运动经过胶孔，它们都以相同速度前进，分辨率也就消 失了。 在脉冲场凝胶电泳中，加在凝胶上至少有两个电场方向，使得 DNA 分子要不断地调整泳动方向，不同分子量大小的 DNA分子用于改变泳动方向的时间不同，则可以得到分离 PFGE工作原理 DNA松弛时间：大分子 DNA改变形状和重新定向所需的时间。这个时间与 DNA分子量呈正相关（ Tr） DNA移动时间： DNA分子向前移动的时间（ Tm） 电场脉冲时间：其电场方向所持续的时间（ Tp） 分子量大的 DNA分子所需的松弛时间长，分子量小的则短。 由于脉
21、冲时间是一个人为的固定值，那么用于向前移动的时间 则随分子量大小而变化。 分子量大的用于向前运动的时间少，移动距离就短，分子量小的用于向前运动的时间多，移动距离就长。 DNA序列分析 基本原理： 双脱氧（ 2， 3） -核苷酸可以象 2-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的 DNA链中，但因 3端不具 OH基， DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个 DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的 DNA片段测定出核苷酸序列 过程：制备 ss-DNA与引物退火 分为 4 个反应系统 每个系统中加入 dNTP（其中 dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸 DNA聚合酶 定序反应 反应产物变性
22、后电泳 凝胶干燥 放射自显影 Maxam-Gilbert 化学法 原理： DNA链上的不同碱基可以和碱基修饰剂发生反应，然后发生 12 个碱基的脱落或取代，最后发生链断裂，不同位置断裂的 DNA分子经凝胶电泳就可确定其核苷酸序列 4 种反应体系中，化学试剂特异断裂 DNA机制 G 反应：硫酸二甲脂使鸟嘌呤 N7 甲基化 A G 反应：甲酸使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，使嘌呤环被吡啶取代 C+T 反应：肼能裂解嘧啶环，进而导致其脱落 C 反应：在一定浓度的 NaCl条件下，肼只对胞嘧啶起 作用 化学法测序的一大优点是不需要模板，引物和 DNA聚合酶。待测 DNA链的检测用 32P 末端标
23、记 Southern 杂交 Southern 杂交是指以 Southern 名字命名的 DNA转移杂交技术，用于特定 DNA序列的检测，包括基因组特定 DNA序列的定位，相关片段的同源性测定、从 cDNA库、基因组文库中筛选目的基因等。用一种或多种限制性内切酶对基因组 DNA加以切割，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段，随后，使 DNA在原位变性，并从凝胶转移至固相膜，用已知核苷酸片段加以标记作为探针，通过分子杂交来检测待测样品中是否存在 互补的核酸序列。该技术已成为分子生物学中一类重要的检测手段。 Southern 印迹杂交的用途 确定在克隆片段中基因编码区的大小和位置 确定克隆片段在基因组中的
24、拷贝数 Northern Blotting 相对 Southern blotting 命名的，与 Southern blotting 不同的是，它检测的对象是 RNA分子。 Western Blotting 杂交的对象是蛋白质，先将蛋白质从 SDS-PAGE中转移到一固相支持物上，通过与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异反应进行检 测 主要用于基因的表达产物蛋白质的检测 PCR 技术的基本原理 ( PCR 聚合酶链式反应 ) 一个 DNA经 n次扩增后 , 一个 DNA分子可变为 2n,理论上经过 30次循环，靶 DNA得到 109倍的扩增，实际是 1067 倍的扩增 DNA 扩增
25、需要对待扩增的 DNA 序列有所了解，至少要对其两侧的核苷酸序列为已知，以便合成寡核苷酸引物 一个标准的 PCR 反应体系（ 50100 l） 50 mmol/L KCl 10 mmol/L Tris-HCl（ pH=8.4） 1.5 mmol/L MgCl2 100 g/ml 明胶或牛血清白蛋白（ BSA） 2 个引物，各 0.25 mol/L dNTP=dATP+dCTP+dGTP+dTTP）各 200mol/L 模板 DNA（人基因组 DNA） 0.11g TaqDNA聚合酶 2 U Denaturation94 , 0.5min Primer annealing 55 , 1.5mio
26、n Extension 72 , 1min 30 cycles 变性（模板）退火（引物与模板）延伸（新合成 DNA链） 1. 模板 DNA 用于 PCR 扩增的 模板 DNA通常是从细胞中提取的染色体 DNA，它们并不需要高度纯化。 待扩增的靶 DNA的长度在 3kb 以下是 PCR 的有效扩增范围，采用经改造的 TaqDNA聚合酶可扩增出 40 kb 的 DNA 片段。 2. 引物 PCR 引物是与待扩增的目的 DNA两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段 引物的长度通常为 1730 个核苷酸 引物太短，可能同非靶 DNA杂交，得出非预期的扩增产物； 引物太长，引物与模板的结合效率降低，影响扩
27、增效率。 简并引物 :是一类由多种寡核苷酸组成的混合物，彼此之间只有一个或数个核苷酸的差异。如根据氨基酸序列推测出的核苷酸序列。 引物与复性温度 引物与模板结合的特异性与复性温度有密切关系 当复性温度偏低时，引物与模板配对出现错配碱基，导致一些不需要的 DNA片段被扩增 复性温度过高，引物与模板不能配对 复性温度常与引物的长度和碱基组成有直接关系，引物越长或 GC 含量较高，退火的温度可以高些，反之则低些 ,Tm=4(G C) 2(A T) 12 below 引物设计的一般原则 :引物的长度常为 1730 GC 含量为 40%60% Tm 值高于 55 两条引物间配对碱基数小于 5 个 引物自
28、身配对 (特别是在引物的 3端 )形成的茎环结构 , 茎的碱基配对数不大于 3 3. dNTP 浓度为 20200mol/L， 4 种 dNTP 以等摩尔浓度配制 浓度过高，加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入率和成本 浓度过低，反应速度下降，提高实验的精确性 4. TaqDNA聚合酶 基本特点 : TaqDNA聚合酶是从一种极度嗜热水生栖热菌 YT-1 中分离纯化而得 具有 DNA聚合酶活性、 53外切酶活性、逆转录酶活性 最适反应温度为 80 最适 pH8.0 和最佳反缓冲液 TrisHCl 最佳二价阳离子 Mg2+（ 10 mM） 具良好的热稳定性：在 90 下连续反应 30 分钟仍有
29、70%的酶活 扩增产物的可靠性 : 评估 DNA聚合酶的一个重要指标是它复制 DNA的可靠性，即掺入错误碱基的频率 天然复制的 DNA分子中错误掺入率为 10-9 在体外实验中， Klenow 片段的错误掺入率为 10-4， TaqDNA聚合酶的错误掺入率为 510-3，而 T4聚合酶的错误掺入率为 10-7 在克隆基因时，应采用高保真的 TaqDNA聚合酶（ Pfu）（ 3-5exonuclease) 5. PCR 反应的平台期 反应底物和产物在 DNA扩增中不断发生变化，最终将会导致聚合反应进入平台期，出现平台期的原因可能有： 后期循环酶浓度或聚合时间不足； 引物耗尽； dNTP 耗尽；
30、产物浓度过高，以致 ds-DNA解链后又迅速退火，不能与引物结合。 DNA芯片（或基因芯片）是将许多特定的 DNA寡核苷酸或 DNA片段（称为探针）固定在芯片的每个预先设置的区域内，将待测样本标记后同芯片进行杂交分析，利用碱基互补配对原理进行杂交，通过检测杂交信号并进行计算机分析，从而检测对应片段是否存在、存在量的多少，以及用于 基因的功能研究和基因组研究、疾病的临床诊断和检测等众多方面 基因芯片的历史 80 年代末期科学家提出杂交法测序的思想，也就是寡核苷酸芯片的基本原理 1991 年世界第一块原位合成寡核苷酸芯片在美国 Affymetrix 诞生 1995 年世界第一块 cDNA芯片在斯坦
31、福大学实验室诞生 一、基因芯片原理及制备方法 原位合成：寡核苷酸芯片 直接点样：寡核苷酸芯片和 cDNA芯片 1. 原位合成法 在固相介质表面特定区域合成已知序列的寡核苷酸的一类技术的总称 采用光导化学合成和照相平板印刷技术合成寡核苷酸芯片 2. 直接点样芯片 已知基因序列通过在液相中化学合成，或通过 PCR 技术扩增，或克隆的基因组片段，经纯化及定量分析后，由点样机器人将靶基因序列直接点到预先经过化学修饰的基片上；然后将未结合的靶基因从基片上洗掉，就得到基因芯片 3. 原位合成法与直接点样法的比较 原位合成法 直接点样法 直接从 DNA数据库得到信息进行寡核苷酸合成 预先制备 cDNA样品并
32、进行合成 芯片个体之间差异小 差异大 密度高， 400000/1.6cm2 64 500/6.5cm2 合成寡核苷酸长度有限，特异性差 靶基因检测特异性高 成本高 成本低 实验样本的制备 常用的基因芯片实验样本是 mRNA (cDNA) 直接从组织或细胞中提取的 mRNA 利用 PCR 技术扩增出的 cDNA 2. 探针的标记 -荧光标记 用花青素 (cyanin) Cy3, Cy5 进行双色荧光标记 ,其激发和发射波长分别是 550/570, 649/670 当用 mRNA作模板时 ,常用反转录方法进行直接标记 图像与数据处理 激光共聚焦扫描 光源：特定波长的光 激发面积： 100 平方微米
33、 如： ScanArray3000 CCD (电荷耦合摄像芯片扫描仪 ) 光源：连续波长的光（如弧光灯） 同时对整张芯片表面进行扫描 芯片实验室 将纳米技术引入生物芯片，在微小的硅材料表面，制造出能够对微量样品进行变性、分离、纯化、电泳、 PCR 扩增、加样、检测等微小结构，使过去一个实验的各个步骤，微缩于一个芯片上 基因组文库的构建 定义：含有某 种生物全部遗传信息的重组 DNA分子的克隆总和。 二建立基因组文库的一般程序 1载体 DNA片段的制备 DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应 2供体 DNA片段的制备 总 DNA分离纯化 机械剪切法分离特定大小 DNA片段 . 酶法 部分酶切 完
34、全酶切 分离特定大小 DNA片段 3. 供体与载体 DNA连接 要提高重组频率，应注意连接反应体系中的总 DNA浓度和两种 DNA分子的克分子比率。 4. 重组 DNA分子的转移和基因组文库的扩增 利用转化或感染方法将连接 DNA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组 DNA分子被扩增（ 重组子比率可能发生变化） 5. 基因组文库质量的评价 1）文库规模 -随机挑取一些转化子或重组子，提取质粒 DNA，电泳测定插入片段大小，然后根据上述公式计算文库大小。 2）重组频率 -频率越高，质量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。 利用 载体构建基因组文库 1. 载体 DNA片段的制备方法 :左右臂 DN
35、A片段的获得 2. 供体DNA片段的制备 :限制酶部分酶切，机械剪切法 3. 重组 DNA分子的形成：控制克分子比率，使其形成串状 DNA分子 4. 重组 DNA分子的包装 1） DNA的包装物的制备使用的大肠杆菌菌株 ： E.coliBHB2688(N205 recAimm434 cItsb2 red EamSam/)- 包装蛋白E.coliBHB2690(N205 recAimm434 cItsb2 red Dam Sam/)-头部蛋白 i.两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合 -本底低（对 DNA分子大小有严格限制），高效。 ii.两菌株分别培养，混合收集和制备 -操作简单，本底高，可包装不同大小的 DNA分子。 2）重组 DNA分子的包装过程包装制备物（ -70 ）于冰上缓慢融化加入重组 DNA分子边融化边混合边包装离心除去细胞碎片 颗粒于 -70 保存待用 5. 基因组文库的扩增包装的 颗粒 感染 E.coli培养 分离 颗粒 -70 保存 利用 COS 质粒载体构建基因组文库构建过程与 载体构建过程相似 : 两臂 DNA 片段的制
