1、1国家标准猪多能干细胞技术规范编制说明（征求意见稿）一、 任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会二 0 一七年国家标准制修订项目，项目编号“20171812-T-424”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，项目周期 24 个月。本标准由中国农业大学等单位共同完成。二、 目的及意义猪作为重要的人类发育和疾病研究的模式动物，具有重要的科研价值，猪与小鼠相比，与人类在胚胎发育、生理结构、神经系统，心血管系统，消化系统和全基因组上均具有高度相似性 1; 2，因此，用猪作为模式动物研究细胞治疗、组织修复与器官再生等方面具有极大的应用前景。而且与灵长类动物相比，猪的繁殖周期更短，产仔量更
2、高，更加经济，且没有伦理道德问题。另外，猪也是我国畜牧业最重要的家畜之一，猪的高新技术育种直接影响未来我国猪业，甚至畜牧业的发展。到目前为止，只有在小鼠、人和大鼠上获得了真正的 ESC，而且小鼠和大鼠 ESC 能形成嵌合体动物。由于 ESC 可以在体外长期稳定培养，容易进行基因修饰生产转基因动物，进行科学研究和实际生产，不同实验室在大动物 ESC分离培养上进行了大量研究，建立了牛、羊、恒河猴、猪等动物的类胚胎干细胞系，但至今仍未获得像小鼠 ESC 具有体内发育能力、形成嵌合体尤其是生殖系嵌合体的胚胎干细胞系，也没有一个完整的猪多能干细胞建系及检测标准，但随着高通量分子筛选技术及单细胞测序等技术
3、的发展成熟，使猪胚胎干细胞的分离建系成为可能。建立猪 nave 多能干细胞系，一方面可以作为人类 ESCs体内发育分化的模型，服务于再生医学；另一方面 nave 多能干细胞可以作为种子细胞，进行基因编辑、动物快速繁育等，从而服务畜牧业家畜育种。现有的小鼠及人的多能干细胞建系及检测标准并不通用于猪等大型哺乳动物，猪多能干细胞建系领域没有完善的行业标准来指导和规范科研工作者的2工作，因此，建立猪多能干细胞的建系及检测标准，对以猪为载体的人类器官再生医学的探索、人类相关重大疾病模型的构建及大动物的繁殖育种等具有重要意义。建立猪多能干细胞建系及检测产业共性标准，也可以规范行业行为，为后续研究提供借鉴和
4、指导。三、标准制定原则1. 本标准在制定中应遵循以下基本原则：a) 本标准编写格式应符合标准化工作导则第 1 部分：标准的结构和编写规则GB/T1.1-2009 的要求；b) 本标准规定的技术内容及要求应科学、合理，具有适用性和可操作性；c) 本标准的水平应达到国内领先水平。2. 本标准编写的依据：本标准主要依据目前猪胚胎干细胞和猪诱导多能干细胞建系的最新研究进展以及相关技术标准。四、标准工作过程1. 接到任务后，项目成员开始进行分工：文献图书资料的调研，相关法律法规的查阅，相关资料的归纳整理，标准说明的撰写，标准说明的修改和完善。2. 依据现有实验结果，结合相关法律法规，文献等内容，进行标准
5、的撰写，最终形成征求意见稿及编制说明。3. 对专家的意见进行汇总和整理，根据专家意见对标准进行修改和整理，形成最终编制说明。 五、标准主要内容本标准共包含以下五部分内容： 5.1 猪多能干细胞建系方法猪多能干细胞建系主要包括细胞来源和分离方法。细胞来源上主要包括早3期胚胎卵裂球，囊胚 ICM，附植前胚胎 Epiblast 及原始生殖细胞等。分离方法主要包括机械分割法，酶消化法、免疫外科法以及全胚接种法等。5.2 猪多能干细胞培养方法猪多能干细胞培养方法可以根据细胞状态的不同进行调整，目前，猪胚胎干细胞样细胞在形态上类似于人胚胎干细胞，呈 primed 状态，因此，其培养方法也多借鉴于人胚胎干细
6、胞培养的方法。5.3 猪多能干细胞培养体系目前研究并未获得最优的猪多能干细胞培养体系，在研究概况中我们列出了相应的已有体系及细胞状态作为参考。5.4 猪多能干细胞鉴定方法猪多能干细胞鉴定方法参考如下综述文章六、国内外研究概况6.1 胚胎干细胞定义及研究进展胚胎干细胞(Embryonic Stem Cells, ESCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的多能性干细胞 3，根据其来源的不同，将来源于附植前囊胚内细胞团(Inner cell mass, ICM)的细胞称为胚胎干细胞，将来源于附植后胚胎原始外胚层（Primitive Ectoderm,PrE）的细胞称为外胚层干细胞（Epibla
7、st Stem Cells，EpiSCs） 。虽然二者均来自于胚胎，且均表达多能性标记，具有自我更新能力及多向分化潜能，也能够分化为外、中、内三胚层中所有的细胞类型，但是 ESCs 与 EpiSCs 在克隆形态、维持多能性所依赖的信号通路、基因表达谱系、X 染色体活化状态、代谢方式等方面具有显著差异， 2009 年，Austin Sminth 率先提出干细胞的 Nave 和 Primed 两种多能性状态，即将小鼠 ESCs 所处的多能性状态称为 Nave 状态，将小鼠 EpiSCs 所处的状态称为 Primed 状态，到目4前为止，nave 和 primed 状态依然是衡量干细胞的标准，nav
8、e 状态的干细胞比 primed 状态的干细胞具有更好的多能性状态 4。41981 年，Evans 和 Kaufman 课题组以及美国的 Martin 等分离并建立了小鼠的 ES 细胞系，这类细胞具有正常核型，能够在体外分化成三胚层的各种类型细胞，能够自我更新。为了表彰他们建立了小鼠的胚胎干细胞系，三人获得了 2007 年诺贝尔生理学或医学奖。随后，科研人员在不同物种上进行尝试胚胎干细胞建系，陆续在仓鼠 5、猪 6、牛 6、羊 7、貂 8、兔 9、大鼠 10建立了胚胎干细胞系，但是大动物如猪、牛等，或多或少都无法通过标准的干细胞检测标准，如体外形成拟胚体，体内形成畸胎瘤及通过构建嵌合体胚胎获得
9、生殖系嵌合后代。 1995 年，James Thomson 首次建立灵长类恒河猴的胚胎干细胞系，这是胚胎干细胞研究第一次到灵长类动物的跨越 11，随后的 1998 年，James Thomson 从人的囊胚内细胞团分离并建立了第一株人的胚胎干细胞系 12。但是猪的胚胎干细胞却无法证实可以进行生殖系嵌合，这是制约大动物胚胎干细胞应用的最大的障碍。6.2 猪胚胎干细胞的研究进展及应用价值从 1990 年 Evans 等开始尝试分离建立猪的胚胎干细胞系到现在已经三十多5年了，大部分研究者分离的 pESCs 均来自猪早期囊胚 ICM 或者 Epiblast，对培养体系的探索一般是基于小鼠 ES 培养系
10、统或者人 ES 培养系统，所选取的用于建系的胚胎大多是体内胚胎，也有用 IVF 胚胎或孤雌胚胎等的尝试，但一直没有可以达到生殖系嵌合的胚胎干细胞出现。猪胚胎干细胞研究进展汇总，部分引自张伟博士论文 13，有增减。胚胎来源 培养体系 饲养层细胞 多能性/分化能力 参考文献体内胚胎 DMEM; FCS; 2ME; PS STO EB 6体内胚胎 DMEM; FBS; L-Glu; 2ME; PS STO EB 14体内胚胎 DMEM; FCS; Nucleosides STO EB 15体内胚胎DMEM or DMEM199; FCS;hLIFPUF Spontaneouslydifferenti
11、ation 16体内胚胎 DMEM; FCS; 2ME; hLIF; hSCF; EGF; PDGF; TGF- PEF EB; teratoma 17体内胚胎 DMEM; FBS; L-Glu; 2ME; PS STO Spontaneously differentiation 18体内胚胎 DMEM; FCS; 2ME; PS; hLIF PEF SSEA-1; CK8/18; lamine 19体内胚胎DMEM or DMEM/F10; FBS; LGlu; NEAA; 2ME; hLIFGelatin AP 20体内胚胎 ES culture medium MEF AP 21体内胚胎C
12、ondition medium; FCS; 2ME;NEAA; Nucleoside; LIF; bFGFSTONuclear transfer, developed to blastocysts22体内胚胎DMEM; FBS; 2ME; NEAA; bFGF; hLIF; PS; nucleosidesMEF;PEF;STOInduced to differentiated into neuron-like cells23体外胚胎DMEM; 2ME; PS; NEAA; bFGF; hLIF; nucleosides; FBSMEF EB 24体外胚胎 DMEM; DMEM/F10; DME
13、M/NCSU-23; L-Glu; MEF;STO AP 2562ME; PS; hLIF; NEAA; FBS孤雌胚胎、IVF 胚胎DMEM/F10; FBS; KOSR; bFGF; hLIF MEFOCT4, NANOG, REX1, SOX2, SSEA-4; AP; EB26体内胚胎 DMEM/F12;NEAA;GLUTAMINE;P/S;2ME;bFGF MEFSSEA1;SSEA4;OCT4;NANOG;SOX2;EB;AP27体内胚胎体外胚胎-MEM ;KOSR;FGF2;EGF; InsulinTransferrinSelenium solution;2ME;NEAA;Glu
14、tamax;hLIF;ActivinAMEFOct4, Nanog, and SSEA1;EB;chimera28SCNT 胚胎DMEM/F10; FBS; KOSR; bFGF; hLIF; TSA MEF AP; EB28IVF 胚胎 DMEM; FBS; LIF;L-Glu; 2ME; CHIR; PD MEF OCT4, NANOG; AP 29体内胚、IVF 胚、孤雌胚DMEM/F10, L-Glu; 2ME; bFGF; SCF; NEAA; FBS MEFOCT4, NANOG,SOX2, REX1; AP30孤雌胚胎 MEM; FBS; bFGF; SC MEFOCT4, NA
15、NOG,SSEA-4; AP; EB; teratoma31体内胚胎 DMEM/F12;FBS;B27;FGF2;EGF;Gentamicin MEFPOU5F1, KLF4, CMYC; CDX2, TEAD432体细胞克隆胚聚合而来的重构胚ROCK inhibitor (Y-27632);bFGF; hLIF; FBS/KOSR; 2ME;L-Glu; NEAA; adenosine;guanosine; cytidine; uridineSTO;MEF OCT4, NANOG, SOX2, REX1; AP; EB 33体外聚合囊胚DMEM/F10;FBS;Glutamax;2ME;NE
16、AA;p/s;human SCF;Human FGF2MEF AP;Oct4, Sox2, and Nanog;EB 34piPSCs 为 DMEM/F10 NEAA; 2ME; MEF OCT4, NANOG, 357核供体的体细胞克隆胚bFGF; FBS; L-Glu SOX2;AP; EB5.5day IVF 胚胎KO-DMEM;DMEM/F12;Neurobasal;KOSR;L-Glutamine;p/s;2ME;NEAA;N2;B27;BSA;Vitamin C;hLIF;bFGFMEFOCT4, NANOG, SOX2AP; normal karyotypes;EB; terat
17、oma36体内胚胎 DMEM/F10;FBS;2ME;NEAA;bFGFagarose-based 3D hydrogelsOCT4, NANOG,SOX2;AP37猪胚胎干细胞因其可无限传代和多向分化能力，其应用价值主要体现在以下几个方面：1）细胞分化及胚胎发育研究2017 年来自英国剑桥的研究团队分析了猪胚胎在不同发育阶段的完整胚盘结构，发现与人类模型相匹配，与非人灵长类动物胚胎干细胞也相近。并且对比了人胚胎干细胞和猪体内胚胎发现 SOX17-BLIMP1 在原始生殖细胞 PGCs 命运决定中扮演重要作用 2， 此研究进一步阐明了猪和人在早期胚胎发育类似的发育模式，预示着猪是一种研究人类早
18、期胚胎发育，深入理解遗传病起源的理想模型。2）基因功能及信号通路研究胚胎干细胞是从胚胎中分离出来的在体外具有多向分化潜能和自我更新能力的一类细胞，因其可以稳定传代，便于进行基因编辑，所以是研究基因功能及信号通路功能的很好地模型。但是因为没有真正的猪 ESCs，已获得的 pESCs或很难稳定传代，或很难进行基因编辑，所以应用性不大。目前对于猪多能性基因功能及维持干性所依赖信号通路研究大多基于 piPSCs，但 piPSCs 因其外源基因不能完全沉默，内源多能性基因不能完全激活，所以并不能完全反映胚胎干细胞的特性。西北农林科技大学王华岩教授课题组研究发现，piPSCs 的自我更新能力的维持是通过
19、Activin-SMAD 信号通路上调 Nanog 和 OCT4 的表达来实现的 38。猪 NANOG 是由 1 号染色体上单一外显子基因（ single exon gene，SEG）编码的，其有两个子基因；一个假基因 NANOGP1 在 5 号染色体8上，启动子区高度甲基化，另一个假基因副本 NanogP2 在 1 号染色体上和Nanog 序列高度相似，但是因为缺失终止密码子故不编码有功能的蛋白 39。Esrrb 对于提高猪体细胞重编程的效率也十分重要 40。赖良学等通过CRISPR/Cas9 技术，建立了一个猪的 Oct4 报告系统，即使猪内源 OCT4 的启动子直接控制 RFP 来指示
20、OCT4 的表达，这对于产生真正的猪 ES 细胞来说是一个很重要的工具 41。3）人类疾病模型的制作与转基因猪的生产转基因动物模型对于了解人类疾病和药物筛选具有重要的现实意义，小鼠虽然在基因组上与人相似，但其生理特性，发育周期，基因表达等与人类相比有较大差距，因此并不能很好地模拟人类疾病，猪与小鼠相比，与人类在胚胎发育、生理结构、神经系统，心血管系统，消化系统和全基因组上均具有高度相似性 42。而且与灵长类动物相比，猪的繁殖周期更短，产仔量更高，更加经济，且没有伦理道德问题。传统转基因猪的生产方法十分困难且低效。如原核注射法只有 1%的注射后的受精卵能够发育为转基因猪 43。现在最常用的生产转
21、基因猪的方法是对体细胞进行基因编辑，然后通过体细胞核移植方法生产转基因猪 44。随着 CRISPR-Cas9 技术的出现及不断优化，基因编辑技术得到极大提升，许多新的人类疾病模型转基因猪应运而生，如脱发模型 45等。pES 因其可以稳定传代和便于基因修饰的特点将对转基因猪的生产有极大的推动。下表对已经报道的人类疾病模型转基因猪进行汇总 46。94）异种器官移植及器官再生研究异种器官移植对于缓解人类器官移植的供求关系失衡来说前景巨大。猪的器官大小及发育周期同人类十分相似，是良好的器官提供供体，但是除了异种的免疫排异反应需要解决外，猪本身所带的内源性逆转录病毒（PERVs）也是临床转化的一大障碍。
22、剑桥大学 Church 等利用 CRISPR-Cas9 技术敲除了全部PERVs 并且通过体细胞核移植技术获得了无 PERVs 的克隆猪 47，这证明了PERVs 在全基因组被敲除的可能性，为异种器官移植的临床应用提供了安全保障。6.3 猪诱导多能干细胞的研究进展自 2006 年首次报道诱导多能干细胞 iPSCs 后，iPSCs 技术受到了广泛的关注。用病毒载体将四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4 和 c-Myc）的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞类型的细胞。iPS 技术是干细胞研究领域的一项重大突破，它回避了历来已久的伦理争议，解决了干细胞移植医学上的免疫
23、排斥问题，使干细胞向临床应用又迈进了一大步。iPSCs 技术的产生同时也给猪、牛和羊等大动物多能性干细胞的建立带来了新希望。人们希望 piPSCs 可以成为猪胚胎干细胞的可替代材料, 应用于生物医学和畜牧业。自 2009 年，piPSCs 成功建系以来 48; 49，究者除了采用逆转录病毒和慢病毒的诱导方法, 还采用了转座子、Episomal 质粒以及 microRNA 模拟体等多种方法诱导 piPSCs 50-52。诱导 piPSCs 的培养体系主要参照小鼠和人的 ESCs/iPSCs 的培养体系。使用不同的培养体系,piPSCs 会呈现不同的细胞形态。但是，目前只有 West 等报道的pi
24、PSCs, 注射到猪囊胚中可以获得嵌合体猪，但是仅用 PCR 方法对生殖系嵌合的猪进行鉴定, 缺乏更有利的证据 53。Fujishiro 等报道 nave-like 的 piPSCs 可以嵌合到早期猪胎体中, 却无法获得成活的后代 54。这些结果表明目前建立的 piPSCs 还没有达到真正的 nave 状态 。七、关键试验内容和技术指标说明 7.1 猪多能干细胞建系方法7.1.1 猪 ES 细胞建系的细胞来源 目前，用于猪胚胎干细胞建系的源头细胞目前主要是囊胚的内细胞团细胞10（inner cell mass，ICM ） , 目前报道的能够长期传代的猪的类胚胎干细胞细胞系均来源于内细胞团。此外
25、，4-8 细胞期胚胎 24、桑葚胚 21或附植前胚胎 15也可作为源头细胞用于分离培养猪胚胎干细胞，但由 4-8 细胞胚胎或桑葚胚用于建系时，胚胎贴壁率低，outgrowth 形成率低，均未获得能够稳定传代的猪的多能干细胞系。猪胚胎干细胞建系所用的胚胎主要来源于冲取的体内正常胚胎和核移植胚胎、孤雌胚胎、体外受精胚胎等体外培养获得的囊胚。7.1.2 胚胎接种方式胚胎干细胞建系过程中胚胎接种形式包括机械分割法，酶消化法、免疫外科法以及全胚接种法。机械分割法：用玻璃管拉成细针或用普通的 1 ml 注射器在显微镜下机械分离 ICM 细胞，将 ICM 细胞接种培养。 这是一种高效，经济，省时且无污染的理
26、想方法，需要操作者操作熟练技术稳定。酶消化法：链蛋白酶或机械法去除胚胎透明带后，将其置于 0.25%的胰蛋白酶细胞消化液中消化，在显微镜下将滋养层细胞开始脱落的囊胚移入培养液中，用口吸管和玻璃针分离 ICM, 接种培养。免疫外科法：用 0.2%的链蛋白酶处理胚胎 3-5 分钟，使囊胚脱掉透明带，将脱去透明带的囊胚置于抗体中，然后转入补体中，利用抗体和补体相互作用使囊胚的滋养层细胞发生免疫溶解，出去溶解的滋养层细胞，从而得到 ICM 细胞。然后将 ICM 细胞转移至 ES 培养基中接种培养。全胚接种法：猪囊胚的 ICM 很小且不明显，这样就给免疫外科法和机械分离法带来困难。因此，可以将经过自然孵化或酶解法脱掉透明带的胚胎直接接种于饲养层细胞上，通过反复传代去除 TE 细胞和已分化的细胞，就可以分离到猪胚胎干细胞，这种方法的操作简单，但是由于未去除 TE 细胞，需要经过多次的传代纯化才能建系，建系效率较低。7.2 猪诱导多能干细胞建系方法猪诱导多能干细胞的建系方法主要参考 Takahashi 等文献中报道的方法 55。7.2.1 逆转录病毒包装
