1、1国家标准猪牛羊体细胞克隆技术规范编 制 说 明（征求意见稿）一、任务来源本国家标准的制定任务列入国家标准化管理委员会国家标准委关于下达 2018年第二批国家标准制修订计划的通知 （国标委综合201841 号 ，项目编号“20180921-T-424”。本项任务由中国标准化研究院提出并归口，定于 2019 年完成。本标准由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所等单位共同完成。二、目的和意义体细胞克隆技术是非常重要的一项生物技术，在科研、医疗和畜牧产业中都有着重要的应用。在科研方面，体细胞克隆技术具有重要的理论研究价值。体细胞克隆的过程，实质上是细胞重编程以及胚胎发育两个生物学过程，而目前我们对这两个
2、过程都知之甚少。在细胞重编程方面，体细胞克隆技术是唯一的能够获得完整个体的细胞重编程技术。2014 年，高绍荣等的研究表明，与 iPS 技术相比，以体细胞克隆技术获得的干细胞，其端粒和线粒体更容易得到保护。表明体细胞克隆在细胞重编程上具有一定的优势。另外在哺乳动物胚胎发育研究中，体细胞克隆技术也发挥着不可替代的作用。比如目前的研究发现，相比于正常受精的胚胎，克隆胚胎的滋养层细胞明显发育不正常，并且这有可能是导致克隆胚胎流产率高的主要原因。这实际上为我们研究胚胎滋养层发育、胚盘发育以及哺乳动物尤其是猪等非侵入性胎盘动物中胎盘与子宫的相互作用等科学问题提供了最佳的研究材料。除此之外，体细胞克隆技术
3、在研究表观遗传学、核质相互作用等基础科学问题中也具有重要的作用。在医疗研究方面，体细胞克隆技术可以生产出供人类移植用的各种器官、组织；又解决了移植手术中器官或组织异体排斥的难题。更进一步地还可以建立各种基因模型，把握如癌症等疾病产生的根本原因，为根治这些疾病提供技术条件。在畜牧产业方面，体细胞核移植技术不仅能快速复制优良种畜，扩大种畜群体规模，而且与基因编辑技术结合后，能够快速获得大量具有特定表型的畜牧品种，对培育新型畜牧品种具有重大意义。2自从 2008 年我国启动转基因重大专项以来，我国的猪、牛、羊等动物的体细胞克隆技术研究不断取得新的成果，目前我国的猪、牛、羊等动物的体细胞克隆技术水平已
4、处于国际领先水平，建立了完整的体细胞克隆动物规模化技术体系。尽管如此，体细胞克隆技术仍然存在技术体系不统一、操作流程多样以及缺乏可量化的质量控制标准等问题。不同科研院所或者高校建立的体细胞克隆技术不尽相同。比如体细胞克隆技术中的去核技术，目前就有盲吸法、化学去核法、切割法等不同方法，且不同方法涉及的操作流程、操作条件、试剂种类、耗材型号均不一致。另外，目前的体细胞克隆技术缺乏有效的质量控制标准和方法。这一现状不仅没有很好的发挥我国动物体细胞克隆技术的规模化优势，同时也大大阻碍了体细胞克隆技术在医疗和畜牧产业中的推广和应用，因此急需建立标准化的动物体细胞克隆技术规范。本标准的目的是建立猪、牛、羊
5、三种重要家畜动物的体细胞核移植技术规范，对体细胞克隆技术中的一般要求、卵母细胞采集、成熟培养、胎儿成纤维细胞分离、卵母细胞去核移核、重构胚的融合与激活等技术操作进行标准化和规范化。本标准的制定和实施，将有力的促进体细胞克隆技术在猪、牛、羊三种我国重要的畜牧动物养殖业、生物反应器以及动物疾病模型产业中的应用，为提高我国猪、牛、羊新品种的竞争力奠定基础。3、标准制定原则(一) 标准编制原则依据目前最新的研究进展及应用情况，本着“实用性、普及性、可操作性、科学性、合理性” 的原则，结合调研情况，提出了适用于猪、牛、羊三种重要家畜动物的体细胞克隆技术操作规范。(二) 标准制订主要依据1、标准编写遵循
6、GB1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则的有关要求。2、标准编写内容参考我国与农产品相关的法规、标准，包括GB/T 25881-2010 牛胚胎 、 GB/T 26938-2011 牛胚胎生产技术规程 、 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法等等。4、标准主要内容本标准系统性的对猪、牛、羊三种家畜动物的体细胞克隆技术进行了规范，主3要包括以下内容：(一) 术语与定义本标准系统整理了猪、牛、羊三种家畜动物的体细胞克隆技术相关的术语，并规定了其具体含义。(二) 缩略语本标准涉及的缩略语较多，为便于理解，将本标准中出现的主要缩略语列进行了整理，列在标准正文的
7、表 1 中。(三) 基本要求体细胞克隆对工作区条件、设备等具有特殊的要求，这些条件可能会影响最终操作结果，因此在本标准规定了工作区条件和必备的设备。(四) 清洗与消毒同样，在体细胞克隆中设计胚胎和体细胞的采集、分离培养等操作，对培养皿有较高要求，因此本标准规定了清洗和消毒的要求。(五) 体细胞克隆技术流程与操作步骤猪、牛、羊三种家畜动物的体细胞克隆操作既有共性，也有各自的特殊要求，为了方便读者理解，本标准首先列出了体细胞克隆技术的整体流程，然后分别列出了猪、牛、羊三种家畜动物的体细胞克隆操作步骤及操作要求，在保留共性的基础上，突出三种动物的特性，便于使用者查阅。(六) 附录体细胞克隆技术用到的
8、各种生化试剂、培养液等较为复杂，为了便于读者理解和开展具体操作，体现“实用性、普及性、可操作性、科学性、合理性”的编写原则，本标准以资料性附录的方式详细列出了三种动物体细胞克隆操作所必须的培养液配方。5、主要工作过程(一) 组成标准起草小组标准制定任务下达后，2018 年 6 月，组成了标准起草工作组，明确了任务要求，并分配工作任务和安排工作进度，会议研究讨论并确定了标准编制的原则和指导思想；制定了编制大纲和工作计划。4(二) 开展相关材料收集情况为了更好地完成本规范的编制工作，工作组广泛查阅关于猪、牛、羊三种动物的体细胞克隆技术方法相关的文献专著，并对各参编单位体细胞克隆技术相关标准化操作流
9、程、试验数据等资料进行的收集和整理，具体如下：标准类：包括国家标准GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写、GB/T 20001.5-2017 标准编写规则 第5部分：规范标准、GB/T 25881-2010 牛胚胎、GB/T 26938-2011 牛胚胎生产技术规程，黑龙江省地方标准DB23/T 1277-2008 绵羊体外胚胎生产操作技术规程、DB23/T 1278-2008 奶牛、肉牛体外胚胎生产操作技术规程及云南省地方标准DB53/T 447.5-2012 BMY牛 第5部分：体外胚胎生产技术规范等一系列标准。技术资料类：包括专著、科研论文和测定数据，如2
10、012年中国农业大学李宁院士主编的动物克隆与基因组编辑、2017年李奎教授主编的动物基因组编辑，以及体细胞克隆实验记录等。(三) 标准起草完善过程依据 GB/T 1.12009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 等标准编制要求，对猪牛羊体细胞克隆技术规范标准开展了研制工作，通过系统整理相关调研资料，于 2018 年 7 月完成了猪牛羊体细胞克隆技术规范标准起草稿。在此基础上，2018 年 7 月编制小组将猪牛羊体细胞克隆技术规范标准起草稿发送给 20 多位专家征求修改意见，征求意见的专家和单位涉及教学、科研、育种等单位，反馈期为二十天，共收到 9 位专家的返回意见。针对专家返回
11、意见中的共性问题，我们又组织了中国农业大学、农业农村部科技发展中心、中国农业出版社、河北省畜牧局等单位的 6 位专家讨论了修改意见中的共性问题，并制定了相应的修改方案。2019 年 2 月 25 日，编制小组再次邀请华中农业大学、中国农业大学、农业农村部科技发展中心、中国农业出版社、北京畜牧兽医研究所等单位的 10 位专家进行讨论，对修改完成的标准起草稿进行了补充、修订，形成了本次的征求意见稿。6、国内外研究进展体细胞克隆技术诞生于 1996 年，当年世界上第一头体细胞克隆动物“多莉” 羊在英国罗斯林研究所诞生。经过二十多年的不断发展，科学家们已经先后成功获得体5细胞克隆绵羊、小鼠、牛、猪、山
12、羊、猫、兔、马、骡子、狗、雪貂、骆驼、水牛和狼等动物。体细胞克隆技术不仅为哺乳动物的胚胎发育、细胞去分化、再分化以及细胞全能性等领域提供了全新的理论，也为人类提供了一种能将高遗传价值的细胞转化为个体的新方法，广泛地运用于生命科学相关的多个行业。比如，对于没有干细胞系的家畜而言，体细胞克隆技术将基因打靶技术和基因编辑技术从模式动物上推广到了大型家畜上，使得在大型家畜上制备精准复杂的基因修饰动物成为了可能。随着简单、高效的基因编辑工具 CRISPR/Cas9 的出现，国内外已经通过体细胞核移植技术制备了大量具有极大育种价值的基因编辑动物1。而将体细胞克隆技术与全基因组筛选技术相结合，可以规模化获得
13、大批高遗传价值的群体2，极大的加快育种进程（图 1） 。与此同时，体细胞克隆过程中细胞重编程机制的相关研究也进展迅速，不断发现提高体细胞克隆效率的方法。图 1.利用全基因组测序筛选和体细胞核移植快速制备一定规模的高遗传价值的牛群体2。(一) 体细胞克隆技术介导的基因编辑动物研究进展作为一项生物高新技术成果，体细胞克隆技术体系涉及到农牧业、生物医学和药物产业等诸多方面，是一项复杂的系统工程，在生命科学、临床医学、食品业、畜牧业生产和环境保护等重要领域都显示出广阔的应用前景与重大的应用价值。尤其是体细胞克隆技术与基因编辑技术的结合将为最终解决世界人口、粮食、环境、6健康等影响 21 世纪人类生存的
14、重大问题发挥不可估量的作用，为人类带来不可估量的利益。中国农业科学院北京畜牧兽医研究所鉴定出猪的一个新型友好基因座 H11 位点，并利用基因编辑技术和体细胞克隆技术高效、准确的在该位点定点插入长达 9.4 kb的外源基因片段 3。同时，该团队还进一步制在该友好位点分别插入三个 II 型糖尿相关基因，建立了多基因 II 型糖尿病模型。西北农林科技大学利用 CRISPR/Cas9n 切口酶系统将结核抗性基因 NRAMP1 定点整合到奶牛基因组的友好基因座 F-A 位点中，不仅建立了一套高效、低脱靶率的将外物种基因精确插入奶牛基因组的技术体系 4，而且有望利用此成果培育出抗牛结核病的新型奶牛品种，市
15、场潜力巨大。猪 CD163 蛋白是巨噬细胞表面的一种蛋白，在猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染过程中能介导 PRRSV 病毒进入巨噬细胞。美国密苏里大学研究团队利用基因组编辑技术获得了 CD163 基因敲除猪。攻毒实验发现 CD163 双等位基因敲除猪对 PRRSV 具有完全抗性5。国际著名猪育种公司 Genus plc（）已经与密苏里大学合作，开展抗蓝耳病新品种猪的培育工作。非洲疣猪通常会携带非洲猪瘟病毒，却不发病，而家猪在感染非洲猪瘟病毒后，在很短的时间内就会发病倒下。基因组测序分
16、析发现，与感染非洲猪瘟病毒相关的一个关键基因 RELA 在家猪和非洲疣猪中存在 3 个不同的SNP 位点，这可能是家猪易感猪瘟病毒的一个重要遗传差异。该团队利用 ZFN 技术，成功地将家猪 RELA 基因的 3 个 SNP 更改为非洲疣猪的 SNP，有希望获得天然抵抗非洲猪瘟病毒的基因编辑猪6。牛奶和羊奶中的 -乳球蛋白是人乳中不含有的蛋白，是奶制品中的过敏原之一。2011 年中国农业大学利用 ZFN 技术成功敲除牛基因组中的 -乳球蛋白基因，获得-乳球蛋白敲除的奶牛，为培育低过敏原奶牛打下了良好的基础7。2015 年，西北农林科技大学陈玉林团队通过 CRISPR/Cas9 系统创制了基因编辑
17、羊群体，对其中 10只 MSTN 阳性羊和 10 只野生型羊从出生至 240 d 的体重检测结果表明，MSTN 阳性山羊、绵羊的体重均显著高于野生型羊，且阳性羊的肌纤维直径更宽、肌纤维横截面积更大，表明 MSTN 基因突变造成基因编辑羊肌肉发育能力的提高。对 FGF5 阳性绒山羊 0d 120 d 的羊绒长度的检测表明，其绒毛长度和密度指标均显著高于野生型绒山羊 8。(二) 体细胞克隆胚胎重编程机制的研究进展在体细胞克隆技术诞生之初，整体克隆效率十分低下，尤其是猪、牛、羊等大7型哺乳动物。主要体现在克隆胚胎囊胚质量差，滋养层细胞数少或者没有内细胞团，植入后妊娠率低，妊娠中流产率高，出生率低，围
18、产期死亡率高。这大大的制约了该技术在生产实践中的运用9。不过，近年来随着人们对体细胞核移植过程中细胞重编程机制的理解，人们不断发现提高体细胞核移植胚胎发育效率的方法(图 2)。如 2006 年 T. Wakayama 提出体细胞核过于致密化的结构是导致克隆效率低下的因素，并利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂 TSA 来提高小鼠体细胞核移植重编程效率10。然而， TSA 在大型家畜上并没有取得像小鼠一样显著的结果11。不过，Randall S. Prather 等发现如果将 TSA 替换成新版的组蛋白去乙酰化酶抑制剂Scriptaid（更低毒性，针对 HDAC 的特异性更好） ，就能够高效的提高猪的克隆
19、效率12。图 2. 近年来发现并解决的体细胞克隆过程中的重编程障碍13。而在 2010 年日本科学家 Atsuo Ogura 发现体细胞中异常的 X 染色体失活状态是体细胞核移植重编程的一个重大障碍，通过敲除或者扰低 Xist 来激活改变 X 染色体状态能大幅提高克隆动物的出生效率14。在 2018 年，我国科学家赖良学发现敲除猪的 Xist 也能大幅提高克隆猪的出生效率（图 3） ，这表明通过敲除 Xist 来提高克隆效率的策略在大动物上可行的15。8图 3. 敲除 Xist 能够提高克隆猪的出生率 15。2015 年美国华人科学家张毅发现，体细胞中的 H3K9me3 是阻止小鼠体细胞克隆胚
20、胎重编程的一个主要障碍，利用组蛋白去甲基化酶 KDM4D 去除体细胞中的组蛋白 H3K9me3 修饰能显著提高体细胞核移植胚胎的发育能力12。2016 年我国科学家高绍荣发现使用 KDM5B 能够矫正体细胞中残留表观记忆并改善了克隆小鼠的胎盘发育 16。而在 2018 年，我国科学家张涌利用 KDM4E，一个在正常胚胎中激活的组蛋白去甲基化酶，提高了牛克隆胚胎的发育能力17（图 4） 。这些核移植重编程理论上的突破使得近几年体细胞核移植效率不断地提升，也不断地推进着体细胞核移植技术的运用18 。9图 4. 使用 KDM4E 能够提高克隆牛的出生率 17。7、关键试验内容和技术指标说明 (一)
21、卵母细胞的采集与质量控制在克隆技术的研究中，原核期受精卵、MII 期卵母细胞、TII 期卵母细胞以及 2-细胞期卵裂球细胞都已经被证明可以作为受体胞质进行体细胞克隆。同时有研究表明用体内成熟的卵母细胞进行体细胞克隆其重构胚胎的囊胚率和出生率均高于用体外成熟培养的卵母细胞，但鉴于采集体内成熟的卵母细胞操作复杂且经济成本较高，难以大规模生产，因此本标准推荐使用体外培养成熟的卵母细胞进行体细胞克隆。体外培养成熟的卵母细胞的质量是决定克隆胚胎发育的关键因素。影响体外培养成熟的卵母细胞质量的因素有多种。本标准从卵巢和卵母细胞的选择上控制卵母细胞质量，从而确保下游体细胞克隆胚胎的正常发育，具体而言，本标准
22、推荐从（1）卵泡直径， （2）卵巢的运输条件， （3）卵丘细胞包裹层数三个技术指标控制卵母细胞质量。图 5 哺乳动物中卵泡发育与卵母细胞成熟（1） 卵泡直径卵母细胞体外成熟质量与卵泡大小紧密相关。在体内，哺乳动物卵母细胞后续发育能力是在卵泡生长过程中逐渐获得的（图 5） ，卵母细胞的发育始于卵泡进入生10长阶段，持续时间在各物种间有所差别。哺乳动物体内生长的卵母细胞其蛋白翻译和 mRNA 转录活动一直持续到格生发泡破裂前。因此卵巢上分布的不同大小的卵泡中的卵母细胞所处的发育阶段不同。研究表明直径过小的卵泡发育不完全，其中的卵母细胞不具有体外成熟的能力，而直径过大的卵泡中的卵母细胞体外培养后可能
23、老化。所以通常选择直径在 3 mm 6 mm 的卵泡中的卵母细胞。孟庆刚等(2001)比较了 2 mm 以下猪卵泡获得的卵母细胞与 2 mm6 mm 卵泡获得的卵母细胞体外培养后的成熟率（表 2） ，发现 2 mm 以下卵泡母细胞的成熟率 (52.63%)显著低于 2 mm 6 mm 卵泡卵母细胞的成熟率(80.39%)。同样，山羊的大腔卵泡(2 mm 6 mm)卵母细胞的体外成熟率显著高于小腔卵泡(2 mm)卵母细胞的体外成熟率19。牛的 3 mm 6 mm 卵泡卵母细胞也比小卵泡的成熟率高，且直径大于 8 mm 的卵泡其成熟率与发育率各项指标均显著低于 2 mm 6 mm 和 4 mm 6
24、 mm 组 (P0.05) 20。除以上研究外，还有国内外其他学者在猪12、牛21、羊、骆驼等物种中的研究也得到类似结果。表 2 不同直径的猪卵泡卵母细胞成熟情况22发育阶段（%）卵母细胞类型数目 GV GVBD M I M II D2 mm 以下卵泡卵母细胞133 11（8.27） 6（4.51）10（7.52）a70（52.63） a36（27.07） a2mm5mm 卵泡卵母细胞102 1（0.98） 0（0） 4（3.92） a82（80.39） b15（14.71） b注：a,b 代表差异显著（P 0.05） 。GV、GVBD、MI、MII 为卵母细胞发育的不同阶段。D指退化或死亡的卵母细胞。本标准综合以上研究结果，推荐选用直径 3 mm 6 mm 的猪以及羊的卵泡抽取卵母细胞进行体外培养，选取直径 3 mm 8 mm 的牛的卵泡抽取卵母细胞。（2）卵巢的运输条件一般而言，从屠宰场采集的卵巢越快进行后续操作越好，但由于屠宰场一般距离实验室较远，需要一定运输时间。这时，卵巢的运输条件就需要特别注意了，有研究发现 23，母猪卵巢离体 6 h 内运回实验室都不会有显著影响，但运输时的保存温度过高或过低都会对卵母细胞质量产生很大的影响。目前报道的采集猪卵巢所
