1、粉针剂无菌工艺验证培养基模拟灌装试验【摘要】目的 为确保粉针无菌分装生产过程对产品不产生污染，保证粉针生产药品质量。方法 先注入液体培养基，再以无菌甘露醇干燥粉为替代物，模拟分装于注射剂瓶，盖胶塞，轧铝盖。分装样品先后在3035与 2025下培养 7d，并作阴性、阳性对照。结果 无菌灌装环境及操作人员表面微生物检查合格, 阴性、阳性对照成立, 试验样品微生物未检出。结论 无菌粉针灌装过程中，经培训的操作人员在规定的洁净环境中按操作规程操作所生产的产品可以确保无菌。 【关键词】粉针剂 无菌工艺 验证 培养基灌装试验 无菌药品的生产须满足其质量和预定用途的要求，应最大限度降低微生物、各种微粒和热原
2、的污染。生产人员的技能、所接受的培训及其工作态度是达到上述目标的关键因素。无菌药品的生产必须严格按照精心设计并经验证的方法和规程进行。产品的无菌或其它质量特性绝不能依赖于任何形式的最终处理或成品检验。 培养基模拟灌装试验使用培养基作为药品的替代品（Placebo）进行无菌模拟生产，对无菌工艺进行验证。培养基灌装在某种意义上是一种挑战性试验，因为几乎在所有情况下，微生物在培养基中的繁殖和生长要比在实际产品中更容易。能全面反映整个生产过程采用无菌工艺生产无菌产品的能力。而且也是各国药品法规要求的基本内容。 1 验证准备工作 1.1 所有的相关设备及其工艺均应事先通过确认或验证, 如洁净生产区环境须
3、通过静态验证 (空气的悬浮粒子、浮游菌、沉降菌及表面微生物均应符合相应的规定)，操作人员的卫生及其操作行为均须经过严格的培训, 生产主要设备 ( 如分装机等)以及与生产相关的其它辅助工艺 ( 如淋洗、湿热灭菌、干热灭菌去热原、除菌过滤等)，均须通过确认或验证。 1.2 甘露醇粉末无菌的处理1 事先需要伽马辐照灭菌（钴 60，用量约 1525kGy） ，并进行无菌性、抑菌性和溶解度的测试。在甘露醇粉末的抑菌性试验中，每天观察微生物生长情况，全部样品对照品试管中均有明显的微生物生长，说明甘露醇对枯草杆菌和白色念珠菌均无抑制作用。甘露醇粉末溶解性试验中全部溶解。灌装时，每瓶内的粉末量不宜过多，否则会
4、对培养基溶液的促菌生长造成不良影响，实践证明，每 5ml 液体培养基内甘露醇含量不宜超过 0.3g。通过上述实验证明甘露醇粉末符合无菌模拟灌装验证要求。 1.3 培养基的微生物生长性能 培养基要经过微生物性能试验和无菌性能试验，证明本次制备的培养基符合模拟灌装验证要求，以保证用于无菌模拟灌装装试验的培养基的有效性。实践证明，营养肉汤培养基或大豆胰蛋白胨液体培养基均适用于培养基模拟灌装试验。2 2 粉针剂无菌分装模拟验证 2.1 验证方法 首先，严格按照培养基生产商的要求进行配制和灭菌, 然后将无菌培养基手工灌装至一定数量的无菌注射剂瓶内。其次，按无菌分装标准操作程序分装无菌甘露醇至灌有无菌培养
5、基的注射剂瓶,对分装过程进行记录。分装后按分装顺序分别进行编号，分装后的全部样品应在 14天内每天检查培养的全部样品的微生物生长情况，若发现污染应明确记录污染日期、污染批号、污染瓶数，同时检查铝盖胶塞的密封情况，若有破损应记录并检查。其破损原因，对于微生物污染的样品应进行鉴别试验，鉴别的内容应包括菌落、细胞形态及革兰染色特性等，分装同时进行空白对照、阴性对照、阳性对照及各种工具进行无菌检查。 2.2 单位灌装体积 选择的体积要使培养基能适当地接触容器内表面，并且适当翻转或旋转，接触到密封件的内表面。每只容器的灌装体积一般不少于总容积的 1/3，但也要考虑保留 25-40%的顶空能确保存在的微生
6、物获得足够的氧气生长。本次试验灌装体积为 5ml。 2.3 灌装试验数量 应综合考虑统计学要求和实际生产批量。 FDA 和中国 GMP (5000 瓶) 3：如果正常生产的批次量低于 5000 瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。 PIC (3000 瓶)：如果正常生产的批次量低于 3000 瓶，则培养基灌封至少应为实际生产线的最大批次量。 2.4 培养基阳性对照实验 随机选取已经完成 14 天培养的灌装培养基样品，按照药典要求： 常用枯草芽孢杆菌、白色念珠球菌或工厂特定菌作为阳性菌 将每个菌种准备含100cfu/0.1ml 的菌液，每个菌种接种 2支培养基样品同时并平板计数（双份
7、） 对真菌在 20-25下培养，对细菌在 30-35下培养，每天检查，5 天内需有生长迹象 2.5 培养基灌封试验的合格标准 FDA、EUGMP 和中国 GMP（2010 版）无菌附录3： I灌封量5000 瓶时，若有 1 瓶污染，需彻底调查，并重新验证(3 批)。 II灌封量为 5000-10000 瓶时，若有 1 瓶污染，视调查结果决定是否需要重新进行 1 批培养基模拟灌装试验；若有两瓶污染，必须重新验证（3 批） ，同时进行彻底调查。 III灌封量10000 瓶时，若有 1 瓶污染，需彻底调查；若有两瓶污染，必须进行彻底调查，并重新验证（3 批） 。 2.6 试验结果 此次试验,我们模拟
8、分装的瓶数为 5170 瓶，污染瓶数为 0，则污染率为 0%。可见,此次验证对甘露醇模拟分装没有造成污染，保证了粉针剂的无菌分装。 3 讨论 3.1 验证要求 在进行模拟分装试验以前应完成灭菌系统的验证(包括干热灭菌系统，湿热灭菌系统，气体熏蒸灭菌)、公用工程验证(包括空气净化系统，注射用水系统)、无菌环境的验证(包括分装区域，环境内无微生物污染)。 3.2 从事验证的人员 验证的实施,组织人员必须经过相应知识的培训，实施人员应经过无菌更衣程序的验证。尽量减少操作环境中人员的数量(但不少于日常生产的人员数量)及现场人员活动的频率、动作幅度。 3.3 验证过程中环境的监测 环境和人员监测按照相应
9、的规程和方案进行，应涵盖无菌工艺各工序，频次数与正常生产一致。包括：空气粒子数、沉降菌、浮游菌、表面微生物、人员监测。验证过程中环境的监测是提供充分证据来证明验证过程的实施是否符合要求，以利于出现不合格现象时进行原因分析。 3.4 对生产操作全过程的要求 在进入分装前，西林瓶、胶塞按工艺规定进行处理、取样检验。并应按照事先设计的最差条件包括时间、操作、干预等进行操作，对操作者的无菌服各部位进行微生物监测，一个操作者定三个取样点，包括乳胶手套，如有吹瓶，应对压缩空气进行菌检。取样的准备工作按工艺要求进行各项消毒。 3.5 建议 3.5.1 模拟灌装全过程建议应进行录像，便于事后调查分析和原因查找
10、，也有利于员工培训。如有可能，应有专人观察和记录操作人员的有意或无意的干预行为。在试验设计时，有时还要考虑人员状态，如夜班人员的注意力往往不够集中。培养基灌装试验后可以进行生产，但要等培养基灌装试验合格后产品才能放（产品有报废的风险） 。样品或按照托盘应进行编号，以便于调查和追溯。 3.5.2 在模拟灌装方案设计时，可以通过设备改进，加装液体灌装器，即先在线灌装无菌液体培养基到容器中，然后在线进行无菌粉末飞分装模拟。可以进一步简化操作，减少污染机会，更加接近实际生产的模拟程度。 参 考 文 献 1国家药典委员会编， 中华人民共和国药典S1 北京: 中国医药科技出版社， 2010， 二部. 2白慧良、李武臣主编: 药品生产验证指南(2003)M. 北京. 化学工业出版社 现代生物技术与医药科技出版中心, 2003. 3国家食品药品监督管理局认证中心编写: 药品 GMP 指南. 北京: 中国医药科技出版社, 2011.8.
