1、寒凝血瘀证动物模型的研究述评【关键词】 寒凝血瘀；动物模型；综述寒凝血瘀证是临床常见的中医证型之一,历代中医文献对寒凝血瘀证都有较多的论述,如素问调经论说：“气血者,喜温而恶寒,寒则泣(涩)而不行,温则消而去之。 ”诸病源候论认为：“寒则血结,温则血消。 ”医林改错亦云：“血受寒则凝结成块。 ”均说明寒是导致血瘀的重要原因。寒为阴邪而主收引,其性凝滞,不论外寒或内寒,均能导致气血运行不畅,形成血瘀,阻滞心脉。各类心脏病,特别是冠心病、肺心病,冬季发病率高,多因寒而复发加重。寒凝血瘀证的实验研究是血瘀证研究中的一个相对薄弱环节。寒凝血瘀证动物模型的制作是开展该项研究的重要平台,但目前尚无理想的寒
2、凝血瘀证的动物模型。现对近 10 年来寒凝血瘀证动物模型的研究概况作一综述,为进一步的研究提供思路和方法。1 局部冻伤法吴氏等1根据血瘀证与全身或局部的血液循环障碍有关的原理,采用对家兔后肢低温冷冻,造成寒凝血瘀证动物模型。方法：剪净家兔两侧后腿足的毛,用 70%酒精消毒,上、下、左、右围置冰袋(3 份冰+1 份结晶氯化钙,粉碎混合,温度降至零下 2025 )。冷冻 1.5 h,在 45 温水中复温 5 min(室温 12 )。观察指标：分别测肛温、趾间皮温、足背周径、肢体血流量,观察眼球结膜微循环,测血浆粘度(HP)、血沉(ESR)、压积(HCT)、纤维蛋白原(Fb)、血栓素(TXB2)、6
3、-酮-前列腺素 F1(6-Keto-PGF1)、超氧化物歧化酶(SOD)、淋巴细胞内 -萘氨酸脂酶(ANAE),解剖大体观察,取心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、脑、胃、舌、两侧后足背皮肌做病理形态学观察(光镜和电镜)。结果发现,该方法所制作的寒凝血瘀证动物模型以造模后第 35 天各项病变最为明显。倪氏等2观察报道了上述模型对家兔血管的影响,发现局部冷冻可引起血管内血栓形成(如股动脉、肺小动脉血栓形成),血管内皮细胞肿胀,静脉及毛细血管扩张,瘀血、出血、白细胞聚集等改变。另外,血液流变、血凝、血栓素、血流量均有显著改变,提示寒凝血瘀是一种全身性损伤,对血管的损害尤为明显。局部受冻也引起全身反应,倪氏
4、等3还报道了上述模型造成的血液流变学异常,包括血沉加快、红细胞压积下降、纤维蛋白原和血浆粘度增高等。王氏等4将上述造模方法用于小鼠,致小鼠局部冻伤引起紫绀、水肿等,造成寒凝血瘀证动物模型,观察到血液流变学及部分免疫学指标的变化。该类造模实验使用的寒凝方法实质上是一种局部冻伤,这在高寒地区或寒冷的冬天是造成血瘀的常见原因之一。机体在寒冻致病因子的作用下,产生强烈的应激反应,使血管壁损伤,血管通透性增加,小分子蛋白质丢失,组织水肿,血容量下降,纤维蛋白原增加,血液粘度增高,血流缓慢,缺血、缺氧等,亦可激活血小板,引起其聚集性及血栓素释放增加。后者又进一步促进血液凝聚与血管收缩,从而诱发血栓形成,并
5、加重组织缺血。可以认为,重度寒冻刺激造成的寒凝血瘀病理改变是局部组织和血管损伤引起的全身性反应2。其造模方法简单,对研究冻伤血瘀证有较大的价值。但临床上因末梢肢体局部冻伤导致重要脏器发病的病例并不多见,在研究心脑血管等疾病的寒凝血瘀证时应注意到该模型与临床实际发病特点有较大差异。2 全身冷冻法郑氏5以中医理论为指导,在大鼠身上复制寒凝血瘀证量化模型。方法：将雄性 SD 大鼠置于罩有铁网罩的小瓷盘上,放入低温冰柜,在-15 的冷环境中持续受冻 4 h 左右,待大鼠出现寒战停止、畏寒喜暖、蜷缩少动、朦胧欲睡、目中无神、反应迟钝、呼吸微弱、被毛蓬松竖立无光泽、小便色清、大便湿烂、唇周发黑、耳色黯红、
6、爪尾部紫黯、舌黯红、体温下降和心跳减慢等症状,说明此时动物已处于兴奋减弱期,随机将鼠脱离冷环境。其造模依据：模拟病因寒邪伤阳(大鼠在-15 的冷环境中,持续受冻 4 h 左右)；模拟症状寒战停止,畏寒喜暖,蜷缩少动,朦胧欲睡,目中无神,反应迟钝,呼吸微弱,被毛蓬松竖立无光泽,小便色清,大便湿烂,唇周发黑,耳色黯红,爪尾部紫黯,舌黯红,体温下降和心跳减慢等；实验室检查血液流变性异常、凝血机制变异、微循环障碍；药物反证大鼠受到寒冷刺激后,用药(温通活血药)组的微循环血流速度较对照组恢复快。此种将造模依据(模拟病因、模拟症状、实验室检查和药物反证)融为一体所建立的动物模型,为定量研究寒凝血瘀证的本质
7、和温通活血化瘀作用的原理及其药物的筛选,提供了又一新的动物模型。该模型实际是寒邪伤阳造成的阳虚寒凝血瘀证,造模的最佳阶段应在兴奋减弱期。但除高寒环境外,并不符合多数患者冬季发病的特点。3 风寒环境法杨氏等6根据中医“风为百病之长”的理论,将 SD 大鼠置于恒温(202)、相对湿度为 40%5%的环境中,饲养观察 1 周。剔除不健大鼠,然后将大鼠移置于全不锈钢丝笼中(透风),每 5 只一笼。调节电风扇的距离和转速,使大鼠感受到的风力为 56 级,在自然室温为(52)、湿度不变的环境中饲养,动物可自由活动摄食。观察动物的一般状况、体温、血压、微循环、血流变指标的变化。发现大鼠自由饲养于模拟风(56
8、 级)寒(37 )环境中,前期(6 d)表现符合中医的风寒表证,见发热、恶风寒、打喷嚏等症状；后期(14 d)表现符合中医的寒凝血瘀证,见血液增粘、增浓、增聚,微循环流态恶化,微血管管径、流速、流量降低。活血药和祛风药对此血瘀动物的血液流变性、微循环以及发热和一般状况有改善作用,配伍后作用增强。本造模方法是由风寒所致,为持续造模的方法,与人类冬季发病的特点仍有一定差距。唐氏等7为观察艾灸疗法的活血化瘀作用,采用类似上述的造模方法,在冬季造模,将大鼠装在透风的大铁丝笼内,置于朝北房间的水泥地面饲养,电扇每日 4 h 低速吹风,使大鼠处于 34 级风力、36 室温的风寒环境中,持续低温受冻 2 周
9、,造成符合中医病因病机的寒凝血瘀证大鼠模型。进一步在控制室温 16 、相对湿度 90%100%的实验室风寒湿环境中,持续低温受冻 3 周,也可造成寒凝血瘀证大鼠模型8。风寒环境造模法模拟机体反复、间断性受到寒冷刺激,更接近人类冬季的活动规律和发病环境。但长期反复的风寒刺激是否会导致动物适应,还有待探讨。4 冰水浸泡法成氏等9为模拟妇科寒凝血瘀证形成的病因特点,将 SD 雌性大鼠置于 01 冰水中 20 min,每日 1 次,连续 2 周。对照组在造模的同时给温经汤治疗反证。结果模型组大鼠出现寒战、蜷缩少动、爪尾部紫黯等症状,耳部微循环、血液流变学异常,血浆内皮素(ET)升高、一氧化氮(NO)降
10、低,与正常组及温经汤治疗组比较有显著性差异,经温经汤治疗上述情况明显改善。同时还对郑氏5的寒凝血瘀证造模方法进行了连续造模对照,即将 SD 雌性大鼠置于低温冰柜,在零下 15 的冷环境中,持续受冻 4 h,每日 1 次,连续 2 周。认为两种造模方法具有相似的效果。该研究采用雌性大鼠,模拟女性接触低温和冷水后月经病高发的特点,为妇科寒凝血瘀证的研究提供了一个动物模型。冰水对大鼠的刺激与冰箱的寒冷环境不同,不仅是寒冷刺激,还要考虑到水的因素,因为大鼠在水环境中不但受到惊恐刺激,还要消耗更多的能量。另外,长期的反复冰水浸泡,可能会导致动物产生适应性,机体的耐受性提高。5 冰水浸泡加药物法滕氏等10
11、采用皮下注射 0.1%盐酸肾上腺素 0.08 mL/100 g,共 2 次注射,给药之间冰水浸泡 5 min 的方法造成大鼠寒凝血瘀模型。蔡氏等11运用静脉注射大量肾上腺素加冰水浴造成寒凝血瘀证家兔模型,方法是由耳缘静脉给家兔注射肾上腺素(1/1 000)0.1 mL/kg(用 NS 稀释后缓慢推注)2 次,间隔 6 h,第 1 次注射后 3 h 将家兔浸入冰水中 5 min,造成寒凝血瘀家兔模型。实验证实,无论皮下还是静脉给肾上腺素,复合冰水浸泡均可造成大鼠血液流变学的异常。王氏等12采用大鼠皮下注射 0.1%肾上腺素 0.9 mg/kg,1 h 后放入4 左右冰水中浸泡 5 min,2 h
12、 后重复注射 1 次肾上腺素的方法,造成大鼠寒凝血瘀证急性心肌缺血模型。李氏等13也采用类似方法,大鼠皮下注射肾上腺素 0.08 mL/100 g,共 2 次,间隔 4 h,于第 1 次注射后 2 h 将大鼠浸入 58 水中 5 min 的方法制作寒凝血瘀证模型,观察腰痛舒胶囊的疗效,结果模型组全血及血浆粘度显著升高,病理显示腰肌纤维变性,血管内红细胞聚集。此类模型是在肾上腺素造成机体缺血的同时给予寒冷刺激,属于采用复合因素的寒凝血瘀急性造模的方法。由上述报道可以发现,该方法造成的寒凝血瘀证动物模型可以有血液流变学、心肌、肌肉等不同组织器官的损伤改变,表明冰水浸泡与肾上腺素的作用都是全身性的。
13、6 冷应激国外文献虽没有寒凝血瘀证的动物模型研究,但也采用冰水浸泡法、冰水浸泡加药物法和冷环境法进行冷应激动物模型及其病理生理的研究,冷应激的温度为-1512 、时间为 3 周(1.5 h/d)24 h 不等,可给我们提供有益的借鉴。秦氏等14将大鼠装入有机玻璃笼内固定,放入 4 冰箱中,2 h 后取出,造成冷应激动物模型。观察到预防性针刺足三里穴对冷应激大鼠胃黏膜损伤具有保护作用,且具有时间-剂量效应,其机制可能与调节机体内血浆 ET、NO、PGE2 的水平有关。流行病学研究表明,冬季老年人群中会出现过高的死亡率,一部分由于脑血管疾病和局部心肌缺血,另一半则是呼吸道感染疾病所致15。冷应激会
14、使老年人的血压过度升高,Keatinge 等16认为,冷应激时血压升高反应的增强以及其他循环反射反应(如血浓缩反应)是引起动脉血栓的主要危险因素。可见,冷应激模型实际上也是一种模拟人类发病特点的寒凝血瘀模型。7 讨论综观上述近 10 年来关于寒凝血瘀动物模型的报道,可以分为局部冻伤法、全身冷冻法、风寒环境法、冰水浸泡法和冰水浸泡加药物法 5 大类。我们认为,应客观评价上述寒凝血瘀证动物模型,根据不同研究的具体要求,采取不同的造模方法,不可盲目套用。以寒凝血瘀证心肌缺血的动物模型为例,寒冷是导致心脉瘀阻的关键诱因,根据中医理论对寒性凝滞、收引的认识,要模拟人类冬季缺血性心脏病高发的发病特点。在研
15、究急性心肌缺血时,也应考虑到冰水的刺激作用与人类发病规律的不同。大鼠放入冰水中,首先会造成惊恐刺激,影响中枢神经系统 肾上腺受体,导致血流动力学异常17。另外,大鼠在冰水浸泡或游泳时,头部在水面以上,不能受到寒冷的刺激(人类是身体保暖,头部暴露,最易于受到寒冷的刺激,诱发心脑血管疾病)。这些均与人类的发病情况不同,因此,冰水游泳法不能较理想地模拟人类的发病规律。我们建议采用间断冷环境加致血管痉挛药物的方法复制寒凝血瘀动物模型,可更好地模拟人类急性心肌缺血的发病特点。中医动物模型是根据中医理论,对人类疾病原型的某些特征进行模拟复制,创造出的具有人工疾病和证的实验动物。动物模型的研究对探讨证的实质
16、、揭示辨证论治的基本规律、规范中药的使用以及促进中医理论的发展有重要意义。如何建立同时符合疾病发病规律和中医理论特点的寒凝血瘀证动物模型,仍有待进一步深入探讨。【参考文献】1 吴垦莉,张珊珊.寒凝血瘀证动物模型的研制J.中国中医基础医学杂志,1996,2(2)：4951.2 倪 瑾,夏友详,张珊珊.寒凝血瘀与家兔血管关系的实验观察J.微循环技术杂志,1996,(2)：9698.3 倪 瑾,张珊珊,夏友群.寒凝血瘀证与血液流变学观察意义J.辽宁中医杂志,1996,23(12)：568569.4 王学江,丰 平.寒凝血瘀证动物模型的实验观察J.北京中医,2000, (5)：4445.5 郑小伟.寒
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