1、p53基因联合放射治疗肝癌的基础与临床研究,研究单位：第三军医大学第三附属医院研究人员：王东、金丰、杨志祥、张沁宏 张新立 、李增鹏、王阁、谢家印,2002年全球新发病例 626,162中国病例占55，约344,000,HCC是全球第六位最常见恶性肿瘤第三位最常见肿瘤相关性死亡原因,研究背景,化疗药物具有普遍耐药性，随机对照试验尚未显示化疗的生存获益放疗成为有效的治疗手段，但由于正常肝组织耐受量低，疗效有限迫切需要新的技术和药物提高肝癌放疗的有效性,更高的有效率;更低的毒副作用;更多的选择方案,放射治疗,肿瘤抑制基因P53,1979:discovery,2004:cancer therapyG
2、endicine 中国 Sibiono,25 年,局部瘤内注射对多种实体瘤有效单独p53基因治疗效果有限,细胞凋亡抑制细胞周期阻滞肿瘤内低氧肿瘤血管生成,P53,放疗敏感性,WTP53联合放疗,目的和意义,本项目从临床病理、分子流行病学、体外体内实验，以及临床研究，系统地研究了以p53为靶点的基因治疗联合放疗治疗肝癌的可行性和有效性，为临床治疗肝癌提供了一个全新的技术和方法。,一.重庆地区人原发性肝癌p53基因突变,p53基因是否为肝癌的潜在治疗靶基因p53基因突变是肝癌发生发展的早期事件/晚期事件p53基因突变与AF污染和HBV感染之间的关系,PCR检测249突变,PCR-SSCP检测7外显
3、子突变,地高辛标记探针Southern blot,ARF免疫组化,p53蛋白阳性43.8%； 249位密码子点突变18.4%；第7外显子点突变2/31； p53基因位点PYNZZZ杂合性缺失(16.7%）,P53突变与HCC临床病理的关系,与肝癌的转移显著相关, 是HCC低分化、高侵袭的重要因素P53突变仅见于肝癌组织，提示p53基因改变发生在肝癌启动阶段之后。P53突变与HCC大小无关，提示p53突变在肝癌发生早期业已存在。p53 249位突变主要见于体积大的HCC。提出散发型p53基因突变可能发生于HCC的早期，而249密码子特异性突变则主要是HCC的晚期事件。,p53基因突变与肝癌病因学
4、的关系,我们将p53基因突变可分为249位特异型突变和散发特异性突变两种类型。进一步提出HBV和AF在p53基因突变和HCC发生中具有协同作用，其中AF主要与249位特异性突变有关，而HBV则可能在散发型突变中发挥主要作用。,重庆地区,p53基因突变在DEN诱导大鼠肝癌中的研究,在EDN诱发的肝癌模型中仅见癌前个别肝细胞增生结节P53阳性,8/18例(44.44%)肝细胞癌呈P53阳性,表明P53基因突变可发生于大鼠肝癌变之癌前及肝癌形成阶段,二.重组人p53腺病毒（Ad-p53）增强肝癌放疗敏感性的实验研究,50MOI的Ad-EGFP感染肝癌细胞48h后EGFP表达情况(200),rAd-p
5、53感染肝癌细胞后P53蛋白的表达情况,249 Mtp53肝癌细胞PLC/PRF/5WTp53肝癌细胞SMMC-7721,SMMC-7721细胞 PLC/PRF/5细胞 rAd-p53感染肝癌细胞48h后联合放疗细胞存活曲线,rAd-p53转染后加照射PLC/PRF/5和SMMC-7721 细胞的放射增敏比SERDq值分别为1.43和1.06。,细胞存活率分别为3.41%和35.44%，细胞生长抑制率分别为41.91%和17.03%.,SMMC-7721近交系BALB/c nu/nu无胸腺裸小鼠18只,瘤内多点注射0.1ml（2108pfu） rAd-p53,放疗照射5Gy/次,分组：对照组
6、单独放疗组 rAd-p53治疗组 rAd-p53放疗,实验治疗方案,Ad-p53增强肝癌放疗敏感性的动物实验,三.rAd-p53增强肝癌放疗敏感性的临床研究,rAd5-p53联合SRT治疗早期肝癌,20042007年病理诊断的早期HCC40例随机分为SRT组和rAd-p53联合SRT组患者拒绝手术并签署知情同意书肿瘤直径为2cm5.2cm，中位3.2cmSRT总吸收剂量50Gy/10f/2w。Ad-p53 经B超引导下经皮瘤内注射。参照WHO实体瘤疗效标准评估。随访期为11月44月（中位35月）,联合组和放疗组1年总生存率和无病生存率分别为90.0% 、 70.0%和85.0%、65.0%MT
7、S分别为33月和20月。全组患者均可耐受治疗，未出现级以上毒副反应。,20%,影响预后指标的Cox回归模型分析358例肝癌,rAd5-p53联合SRT治疗晚期肝癌,不同治疗模式肝癌生存率比较,表明rAd-p53联合放射治疗肝癌安全有效，患者耐受性好，副作用小，,项目创新点,在国内首先建立了ARF-微波修复P53蛋白免疫组化方法。从分子流行病学揭示了p53改变是本地区HCC的重要特点，明确将P53突变分为249密码特异型突变和散发型突变，并提出AFB1主要引起P53特异型突变，而HBV在P53散发型突变中起主要作用。将基因治疗和放疗相结合，通过体外体内实验证明了rAd-p53联合放疗能显著提高肝
8、癌细胞的放疗敏感性。以基础研究的结果指导临床，应用rAd-p53联合放射治疗肝癌，进一步证明了联合治疗不论肿瘤局控率还是患者的生存时间都显著优于单独放疗。,推广应用,发表论文34篇, 大会交流12篇金丰，杨志祥，王东 等。内科综合治疗358例肝癌多因素预后分析。临床肿瘤学杂志，2009曹晓静，戴楠，杨志祥，金丰，仲召阳，王阁，王东（通讯作者）。重组人p53腺病毒治疗原发性肝癌的血清p53蛋白检测及其临床意义。肿瘤预防与治疗，2009，22（1）：5-8。王东 杨志祥 张沁宏 等。重组人p53腺病毒（今又生）联合化疗、放疗治疗晚期恶性肿瘤的临床观察。临床肿瘤学杂志，2008,13(10):896
9、-900.张沁宏，向德兵，卿毅 等。重组人p53腺病毒增强肝癌细胞放疗敏感性的实验研究。中国生物治疗杂志，2008,15(5):458-463杨志祥，王阁，王东等。立体定向放射治疗肝转移癌临床疗效观察。重庆医学，2007；36（19）：1953-1954。张沁宏, 王东, 牟江洪 等 重组腺病毒介导的p53基因对肝癌细胞生长抑制作用的研究。第三军医大学学报，2006；28（2）：121-124。张新立，史景泉，卞修武。大鼠肝癌变中p53点突变及其蛋白表达的研究。第三军医大学学报，2001，23（8）：885-887。Wang Dong 王东, Shin Jingquan 史景泉, Liu Fe
10、ngxuan 柳凤轩. Immunohistochenical study of P53 protein expression in human hepatocellular carcinoma. J Med Coll PLA, 1996;11(1):30-33.Wang Dong 王东, Shin Jingquan 史景泉. Overexpression and mutations of tumor suppressor gene P53 in hepatocellular carcinoma. China Natl J New Gastroenterol, 1996;2(3):161-16
11、4.王东, 史景泉. 石蜡切片ARF免疫组化检测P53蛋白的初步报告. 第三军医大学学报, 1994;16(1):52-54.,推广应用,在第四军医大学唐都医院肿瘤科成都军区昆明总医院肿瘤科天津北京军区二五四医院肿瘤放疗科南宁广州军区三零三医院肿瘤科重庆武警总医院肿瘤科成都军区三二四医院肿瘤科新疆库尔勒二七三医院,Thanks your attention!,358例肝癌生存分析,例1.Ad5联合SRT治疗肝癌，显示治疗3月后肝脏病变消失,例2.Ad5联合SRT治疗肝癌典型病例，显示治疗3月后病变明显缩小,复制缺陷性腺病毒rAd-p53,应用最早和最广泛的是复制缺陷性腺病毒，其早期基因E1区被剔除，在普通细胞中不能复制，感染细胞谱较广。,ADVEXIN p53 美国 Introgen Gendicine 中国 Sibiono,
