1、毕业论文文献综述生物工程榨菜低盐腌制体系中优势种群的分子鉴定及分析摘要本文对我国蔬菜传统腌制工艺过程中的最佳盐度、主要微生物类群进行了较为全面的论述,对提高蔬菜传统腌制品的质量有一定的指导意义。同时概述了16SRDNA技术的原理及其在食品微生物检测中的应用与研究进展，并探讨了这些技术的发展和应用前景。关键字低盐腌制；乳酸菌；16SRDNA蔬菜的腌制加工，在我国已有悠久的历史。劳动人民在长期生产实践中积累了丰富的经验。但是传统的蔬菜腌制工艺均采用高盐进行腌制。这样，成品盐度太高，而食用过多的食盐对人体某些器官会造成永久性损坏1。所以，我国人民对高盐腌制食品也越来越不欢迎，取而代之的低盐方便的软包
2、装腌制蔬菜产品正在占领市场2。随着分子生物学技术的发展，食品微生物的分子生物学研究进入了一个新阶段，人们对于微生物在分子和基因水平的认识不断深入。近年来，SSCP技术为已经广泛地应用于到环境和食品包括腌制蔬菜微生物的研究中3,4。采用的SSCP方法体现了一种快速、简易的研究微生物群落结构的方法5，但是测序列较短，个别可能只确定属、科分类地位，无法精确地鉴定到种，所以结合16SRDNA/RRNA的序列分析来进一步来进行研究。16SRDNA或16SRRNA序列既具有保守性,又具有高变性,是目前细菌分类和鉴定经常使用的一种检测方法6,7。1蔬菜低盐腌制的最佳盐度一般来讲，榨菜含盐量愈高，愈有利于榨菜
3、的保存，也有利于保持榨菜的香味和滋味。但由于高盐度条件下腌制的蔬菜含盐量太高，食用过多的食盐对人体的某些器官如肾脉和心血管系统等会造成永久性损坏。然而，榨菜含盐越低，虽然可以保持蔬菜原有的营养成分，却不利于榨菜的保质贮存。并且在低盐条件下势必引起各种微生物的生长，因此，在此条件下使腌制保藏过程正常化的过程是一个十分复杂的微生物学发酵过程，同时伴随着复杂的生物化学变化和物理变化，搞清正常腌制过程的微生物的作用以及相应的物质变化关系8,9，对制订合理的生产工艺实现蔬菜腌制的清洁生产提供技术保证。李学贵1等通过研究总结出当含盐量为5时为榨菜腌制的最佳盐度。2蔬菜的低盐腌制中的主要微生物目前,我国各种
4、蔬菜腌制品的发酵,都是借助于天然附着在蔬菜表面上的微生物的作用来进行的。据测定,蔬菜收获后表面所含的微生物不仅种类多,而且数量大,大白菜外叶含微生物约13108/G,根菜类表面所含的数量更大,但有益菌一般数量都较低【10】。21乳酸菌乳酸菌是一类革兰氏阳性菌,以产生乳酸作为发酵代谢中主要或唯一代谢产物特征的细菌。它属于兼性厌氧菌。在自然界分布广,种类多11。在蔬菜腌制发酵中的乳酸菌分别属于粪链菌属、明串球菌属、片球菌属和乳杆菌属。其中，在蔬菜初始发酵阶段和主发酵阶段起主要作用的乳酸菌主要为粪链球菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌。肠膜明串珠菌的快速生长降低了PH值,从而抑制了有害微生物的生长和软化蔬菜
5、酶的活性；产生的CO2替代了空气,造成厌氧环境,不仅有利于稳定蔬菜中的色泽,而且也有利于其它乳酸菌按一定的顺序生长；产生的酸、醇等与其它产物结合起来,使产品具有特有的风味；肠膜明串珠菌能把多余的糖转化成甘露醇和葡聚糖,甘露醇和葡聚糖一般只能被乳酸菌利用,而不能被其它微生物利用,也不能与氨基酸结合成醛基或酮基,因此不会引起食品的褐变。短乳酸菌能够发酵戊糖,使产品具有独特的风味。22酵母菌蔬菜腌制中酵母菌可以从蔬菜采摘后本身表面带来,也有从腌制工具和空气中自然落入而来。蔬菜腌制中常见的酵母主要是啤酒酵母、产醭酵母和鲁氏酵母等。酵母发酵所生成的乙醇对腌制品在后熟阶段发生酯化反应和生成芳香物质是很重要
6、的。其它醇类的产生对风味也有一定的影响。酵母菌产生的乙醇也作为醋酸菌进行醋酸发酵的基质。3分子检测技术对环境中微生物种群的类型和数量进行及时和准确的分析测定在微生物生态研究中十分重要,传统的微生物分析测定方法,在环境样品研究中都存在一定的缺陷。近年来,一些分子生物学技术的联合应用12，使我们不仅可以定性，还可定量研究微生物菌落结构组成及数量变化，深入探索微生物菌落与环境因子之间的相互作用及其动态变化过程。3116SRDNA技术原理细菌含有3种不同的RNA，即MRNA、TRNA和RRNA。其中RRNA是蛋白质合成必需的，所以它们广泛存在于所有的原核生物中，并且结构和功能都是保守的；16SRDNA
7、的序列中包括可变区和高变区，因此既可以利用保守区域来设计引物，又可以利用高变区来进行序列间的比对它们的序列变化比较缓慢而且在原核生物中不发生水平转移，因此16SRDNA之间序列的差异可以反映不同生物之间的进化关系。从上世纪70年代以来,科学家们因16SRRNA的保守性,对其进行了大量研究工作,现在已对16SRDNA序列有了清晰的认识。在细菌的16SRDNA中有多个区段高度保守13,根据这些保守区人们可以设计出细菌的通用引物,可以用来扩增出所有细菌的16SRDNA片段,并且这些引物仅对细菌是特异的,也就是说这些引物不会与非细菌的DNA互补,而细菌的16SRDNA可变区的差异则可以用来区分不同的菌
8、。因此,16SRDNA可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子14。3216SRDNA技术基本研究方法根据以上原理，我们从环境微生物样品中提取出RRNA或总DNA后，就可以利用PCR扩增、核酸杂交、梯度电泳和DNA测序等技术分析微生物样品的16SRDNA，从而对环境微生物进行检测，或对其进行分类、定位15。无论是全长还是部分16SRDNA/RRNA序列,都可以提交到国际互联网GENEBANK,采用BLAST和RDPRIBOSOMALDATABASEPROJECTPROGRAMS与已知序列进行相似性分析,然后进行系统发育分析。3316SRDNA在微生物学研究中的应用白洁16等人采集黄海西
9、北部海域春秋2个季节的沉积物样本,采用微生物分子生物学技术,构建细菌16SRDNA文库,并进行序列测定和多样性指数分析,探讨细菌群落结构和分布特征,研究邻界水域、人类活动以及黄海冷水团等自然和人为因素对黄海西北部微生物种类组成、数量、优势菌群等的影响,以及功能微生物对环境因子的响应,有助于深层次理解该海域沉积物的生态系统结构和功能,为我国近海微生物资源及生态环境的研究提供理论依据。在水产养殖中应用L6SRDNA分析方法能使研究者更深入地洞察养殖水生环境的细菌多样性17，为水产养殖生态系统群落结构调查奠定基础。16SRDNA技术也开始应用于水环境细菌群落和鱼类消化道细菌群落的调查，如李志岗18等
10、利用L6SRDNA限制性片断长度多态性分析了水环境细菌群落结构。目前,16SRDNA序列分析方法在乳酸菌分类鉴定运用比较多,用PCR产物建立16SRRNA基因克隆库通过16SRDNA序列分析确定身份。并与有关的16SRRNA数据库比较建立分类学上的关系19。CHOI20利用16SRDNA序列分析和DNA杂交技术研究了泡菜中乳酸菌的菌群变化,在泡菜5D的发酵过程中随机分离出120株乳酸菌,结果发现在发酵的前中期,柠檬明串珠菌LCITREUM是优势种,然而在发酵后期主要为清酒乳杆菌LSAKE或弯曲乳杆菌LCURVATUS以及短乳杆菌。乌日娜7等采用16SRDNA测序和同源性分析的方法,以大于98的
11、同源性将LCASEIZHANG和ZL121分别鉴定为LCASEISUBSPCASEI和LGALLINARUM。燕平梅21等利用16SRDNA基因序列方法分析传统发酵菜中乳酸菌的多样性，得出4种独特的菌落，并且利用这种分子方法发现了常规分离培养技术未鉴定的乳酸菌。构建克隆文库是微生物分子生态学中用来研究微生物组成的常用方法之一,目前细菌菌群分析中应用最多的是16SRDNA克隆文库方法22。它是通过对16SRDNA全长序列进行扩增和分析,达到研究和监测样品与环境中细菌多样性、种群结构和区系变化的目的,并应用于水体、土壤、海洋沉积物、生物水处理系统中的微生物分析23。通过建立16SRDNA克隆文库的
12、方法,通过测序并与已知序列比较确定细菌种类,以揭示有机物料腐熟菌剂样品中的细菌组成,同时也可以根据克隆文库中克隆子出现的频率了解样品的细菌组成比例24。近年来TYAMAMOTO等设计和合成出人肠道区系中常见的双歧杆菌属5个种两歧双歧杆菌、青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌的特异性的寡核苷酸探针,它们具有1619个碱基长度,并与这5个种的16SRRNA序列互补25。用天然高分子量的RNA制备物作为靶子,这些寡核苷酸探针对于人肠道中这些种的菌株具有高度的种特异性,结果表明用此法检测这5个种的16SRRNA序列能取得所期望的结果,并且整个试验过程从获得纯细胞物后只需6H可完成。4存在
13、的问题和展望传统的表型、生物化学方法鉴定微生物耗时耗力,而且培养条件的改变可能会导致结果发生变化,鉴定结果很不稳定,其结果也仍是表观的,很难反映生物的遗传本质。随着分子生物学和相关技术的发展,分子标记技术以其快速、准确、灵敏的优点逐渐成为微生物分类鉴定的主要手段。尽管如此,目前还没有一种分子标记技术能单独胜任对微生物的鉴定,只有同其他方法结合起来进行比较研究,尤其是传统方法和分子生物学方法结合起来对微生物的分类鉴定才会得到比较满意的结果。由于16SRRNA序列的保守性和存在的普遍性,以及核酸序列本身的稳定性、序列分析的重现性极高,基于当今分析技术的改进,应用16SRRNA作为分子指标,可以实现
14、快速、微量、准确简便的对微生物进行分类鉴定。分子分类正是在从研究的目的过渡到研究的手段。随着分子分类的理论和方法的日趋成熟,其已逐步成为微生物资源调查和整理的一种强有力工具。参考文献1陈惠音,杨汝德超低盐多菌种快速发酵腌菜技术J食品科学,1994,518222李雄辉蔬菜低盐腌制过程中的酸度变化及控制J中国调味品,1995,611133王岩,沈锡权,吴祖芳PCRSSCP技术在微生物群落多态性分析中的应用进展J生物技术,2009,19384874薛燕，常洪，常国斌PCRSSCP技术在动物育种中的研究进展J畜牧兽医杂志，2005，24321255董承良，邓昌彦基因突变检测技术进展J黄牛杂志，1998
15、，2349526孙志宏,孟和,孙天松,等分子标记技术用于乳酸菌分类鉴定研究进展J中国乳品工业,2006,34535377乌日娜，张和平，孟和毕力格酸马奶中乳杆菌的16SRDNA基因序列及聚类分析J中国乳品工业，2005,336498李学贵,严晓燕低盐化榨菜生产原理及其应用初探J中国酿造,20045469吴祖芳,刘璞,翁佩芳榨菜加工中乳酸菌技术的应用及研究进展J食品与发酵工业,2005,318737610施安辉,周波蔬菜传统腌制发酵工艺过程中微生物生态学的意义J中国调味品,2002,5111511任涛微生物对蔬菜腌制品风味及品质的影响J中国调味品,1989,71622112BOONN,TOPEM
16、，VERSTRAETEWBIOAUGMENTATIONASATOOLTOPROTECTTHESTRUCTUREANDFUNCTIONOFANACTIVATEDSLUDGEMICROBIALCOMMUNITYAGAINSTA3CHLOROANILINESHOCKLOADJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，2003,691511152013马迪根,马丁克著,杨文博译，微生物生物学M北京科学出版社,200176777314刘年峰16SRDNA技术及在水产养殖细菌分析中的应用前景J现代渔业息,2004,19126815肖勇16SRRNA/RDNA序列分析技术应用于
17、环境微生物群落的初步研究湖南大学硕士论文湖南湖南大学,200716白洁,李海艳,赵阳国黄海西北部沉积物中细菌群落16SRDNA多样性解析J微生物学报,2009,4934335017杨官品,茅云翔环境细菌宏基因组研究及海洋细菌生物活性物质BAC文库筛选J青岛海洋大学学报,2001,3L571872218李志岗、杨官品、朱艳红水环境细菌16SRDNA限制性片断长度多型性及群落结构的分析J水生生物学报,2001,25212312519MARCHESIJ,SATOR,WEIGHTMANAJETA1DESIGNANDEVALUATIONOFUSEFULBACTERIUMSPECIFICPCRPRIMER
18、STHATAMPLIFYGENESCODINGFORBACTERIAL16SRRNAJAPPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，1998，6479579920BOTSTEINDR,WHITERL,SKOLNICKM,ETALCONSTRUCTIONOFAGENETICLINKAGEMAPINMANUSINGRESTRICTIONFRAGMENTLENGTHPOLYMORPHISMSJAMJHUMGENET,1999,3231433121燕平梅,张慧,薛文通,等16SRDNA基因序列方法分析传统发酵菜中乳酸菌多样性J中国食品学报,2007,7211912322张彤，方汉平微生物分子生态技术16SRRNA/DNA方法J微生物学通报,2003,3029710123AMMANRJ,LUDWIGW,SCHLEIFERKHMICROBIOLREV,1995,59143169124李国媛,李俊,姜昕,等应用16SRDNA克隆文库法分析有机物料腐熟菌剂细菌组成J微生物学通报,2007,34593994225都立辉,刘芳16SRRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用J乳业科学与技术,2006,5207209
