1、本科毕业论文系列开题报告生物工程NJ632中腺苷酰化结构域的基因重组表达与纯化一、选题的背景与意义许多微生物能利用非核糖体肽合成酶NRPSS合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。虽然科学家们认识这个酶系已有几十年了,但直到最近才了解NRPSS的工作原理,并且开始尝试改变酶的结构,利用生物工程技术合成更多种类的药物。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。本研究小组从海绵体表筛选获得一株具有较强抗菌和细胞毒活性的菌株NJ632，通过生物信息学方法成功寻找到NRPS编码基因并克隆成功。鉴于NRP类化合物具有抑菌广谱性等特点，编码该类物质的NRPS值得深入研究。我们对
2、NRPS中的多个结构域模块进行体外克隆及蛋白纯化，尤其是对其中的A3结构域做了大量研究工作，包括蛋白表达，结构测定等。该课题初步探索了NRP类化合物合成的分子机制，为后期彻底揭示NRP类化合物的合成原理奠定坚实的理论基础，为今后的药物开发与工业化生产有着积极而重要的意义。同时，从实验角度来印证NRPS的结构及功能特异性是否与利用生物信息学技术预测结果一样，弥补了后者预测存在的不稳定性及准确性，从而在一定程度上促进生物信息学的发展。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容将从海绵中筛选到的附生微生物NJ632中的可能参与活性产物合成的NRPS基因簇中的A结构域导入异源宿主中，利用异源宿主本身
3、自带的或人工修饰的表达调控元件使该结构域得到有效的表达。同时，利用改造的表达质粒所携带的HIS标签对异源表达的A结构域进行体外表达与纯化，为后续的酶活实验提供良好的蛋白样品。拟解决的主要问题1异源表达条件的优化2目的蛋白的分离和纯化三、研究的方法与技术路线方法利用分子生物学中分子克隆的常规方法制备用于表达NJ632的NRPS基因簇中A结构域的表达系统。采用已商品化的PET28A和PQE60表达系统分别构建了含有NRPS基因簇的A结构域的重组表达质粒PZPA32，PZPA33。同时利用表达载体特定的表达宿主对A结构域进行正确、高效表达并纯化蛋白。技术路线如下目的基因的获得基因载体的选择和构建目的
4、基因和载体的连接重组DNA分子导入表达宿主细胞重组体筛选克隆基因表达蛋白的检测与纯化四、研究的总体安排与进度20101112选题，进行文献查阅和资料收集，完成开题报告及任务书20101220111实验阶段，对基因的表达和纯化进行记录与分析2011420115完成外文翻译，论文撰写，提交并答辩五、主要参考文献1CROSAJH,WALSHCTGENETICSANDASSEMBLYLINEENZYMOLOGYOFSIDEROPHOREBIOSYNTHESISINBACTERIAJMICROBIOLMOLBIOLREV,2002,662232492WELKERM,DOHRENHCYANOBACTERI
5、ALPEPTIDESNATURESOWNCOMBINATORIALBIOSYNTHESISJFEMSMICROBIOLREV,2006,305305633MIAOV,COEFFETLEGALMF,BRIANP,ETALDAPTOMYCINBIOSYNTHESISINSTREPTOMYCESROSEOSPORUSCLONINGANDANALYSISOFTHEGENECLUSTERANDREVISIONOFPEPTIDESTEREOCHEMISTRYJMICROBIOLRES,2005,151150715234SCHWECKET,GOTTLINGK,DUREKP,ETALNONRIBOSOMALP
6、EPTIDESYNTHESISINSCHIZOSACCHAROMYCESPOMBEANDTHEARCHITECTURESOFFERRICHROMETYPESIDEROPHORESYNTHETASESINFUNGIJCHEMBIOCHEM,2006,76126225RICHARDTA,KEMMET,WAGNERS,ETALEBONY,ANOVELNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEFORBETAALANINECONJUGATIONWITHBIOGENICAMINESINDROSOPHILAJJBIOLCHEM,2003,27841160411666KASAHARAT,KAT
7、OTNUTRITIONALBIOCHEMISTRYANEWREDOXCOFACTORVITAMINFORMAMMALSJNATURE,2003,4228328397GEWOLBJWORKINGOUTSIDETHEPROTEINSYNTHESISRULESJSCIENCE,2002,295220522078GRUNEWALDJ,MARAHIELMACHEMOENZYMATICANDTEMPLATEDIRECTEDSYNTHESISOFBIOACTIVEMACROCYCLICPEPTIDESJMICROBIOLMOLBIOREV,2006,701211469SHARMAA,JOHRIBNGROWT
8、HPROMOTINGINFLUENCEOFSIDEROPHOREPRODUCINGPSEUDOMONASSTRAINSGRP3AANDPRS9INMAIZEZEMAYSLUNDERIRONLIMITINGCONDITIONSJMICROBIOLRES,2003,15824324810CRAMERRAJR,GAMCSIKMP,BROOKINGRM,ETALDISRUPTIONOFNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEINASPERGILLUSFUMIGATUSELIMINATEGLIOTOXINPRODUCTIONJEC,2006,597280311PICOSIS,VALLA
9、DARESA,FLORESE,ETALNITROGENREULATEDGENESFORTHEMETABOLISMOFCYANOPHYCIN,ABACTERIALNITROGENRESERVEPOLYMERJJBIOCHEM,2004,279115821159212LIUJ,FARMERJD,LANEJWS,ETALCALCINEURINISACOMMONTARGEOFCYCLOPHILINCYCLOSPORINAANDFKBPFK506COMPLEXESJCELL,1991,6680781513SAMELSA,WAGNERB,MARAHIELMA,ETALTHETHIOESTERASEDOMA
10、INOFTHEFENGYCINBIOSYNTHESISCLUSTERASTRUCTURALBASEFORTHEMACROCYCLIZATIONOFANONRIBOSOMALLIPOPEPTIDEJJMOLBIOL,2006,35987688914SIEBERSA,MARAHIELMALEARNINGFROMNATURESDRUGFACTORIESNONRIBOSOMALSYNTHESISOFMACROCYCLICPEPTIDESJJBACTERIOL,2003,1857036704315ROONGSAWANGN,LIMSP,WASHIOK,ETALPHYLOGENETICANALYSISOFC
11、ONDENSATIONDOMAINSINTHENONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASESJFEMSMICROBIOLLETT,2005,25214315116SCHWARZERD,FINKINGRANDMARAHIELMANONRIBOSOMALPEPTIDESFROMGENESTOPRODUCTSJPRODREP,2003,2027528717BALDWINTOFIREFLYLUCIFERASETHESTRUCTUREISKNOWN,BUTTHEMYSTERYREMAINSJSTRUCTURE,1996,422323718LEESG,LIPMANNFTYROCIDINESY
12、NTHETASESYSTEMJMETHODSENZYMOL,1975,4358559019STCAHELHAUST,MOOTZHD,MARAHIELMATHESPECIFICITYCONFERRINGCODEOFADENYLATIONDOMAININNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASESJCHEMBIOL,1999,649350120CHALLISGL,RAVELJ,TOWNSENDCAPREDICTIVE,STRUCTUREBASEDMODELOFAMINOACIDRECOGNITIONBYNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEADENYLATION
13、DOMAINSJCHEMBIOL,1999,721121821ACKERLEYDF,CARADOCDAVIESTT,LAMONTILSUBSTRATESPECIFICITYOFTHENONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEPVDDFROMPSEUDOMONASAERUGINOSAJJBACTERIL,2003,1852848285422STACHELHAUST,MOOTZHD,BERGENDAHLV,ETALPEPTIDBONDFORMATIONINNONRIBOSOMALPEPTIDEBIOSYNTHESIJJBIOLCHEM,1998,2732277323HENNINGD
14、M,MOHAMEDAMBIOSYNTHETICSYSTEMSFORNONRIBOSOMALPEPTIDEJCURROPINCHEMBIOL,1997,154355124BECKERJE,MOORER,MOOREBSCLONING,SEQUENCING,ANDBIOCHEMICALCHARACTERIZATIONOFTHENOSTOCYCLOPEPTIDEBIOSYNTHETGENECLUSTERMOLECULARBASISFORIMINEMACROCYCLIZATIONJGENE,2004,3253542毕业论文文献综述生物工程关于NRPS及其主要结构域的研究现状摘要许多微生物能利用非核糖体肽
15、合成酶NRPSS合成结构复杂、种类繁多的的生物活性肽。非核糖体肽因其独特的理化特性和药理学特性已被广泛关注,极具商业开发潜力。NRPSS由多个模块组成,模块的不同空间排列顺序决定其多肽产物的氨基酸序列特异性。本文综述了NRPS主要结构域相关研究进展及应用前景展望。关键词非核糖体肽非核糖体合成酶作用机理结构域正文在自然界,细菌1、蓝细菌2、放线菌3和真菌4等微生物,甚至果蝇5、小鼠6等动物,能通过非核糖体途径合成一系列低分子量的具有药用价值的多肽类次生代谢产物。这些多肽类物质结构复杂、种类繁多,统称为非核糖体肽NONRIBOSOMALPEPTIDES,NRPS。NRPS的生物合成是由非核糖体肽合
16、成酶NONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASES,NRPSS、聚酮合成酶POLYKETIDESYNTHASES,PKSS、NRPSS/PKSS杂合酶等多功能蛋白复合体完成。其中,NRPSS是NRPS生物合成的主要酶也是研究最多最深入的酶,由多个模块MODULE组成,各模块的特定结构域具有特定的酶活性。虽然科学家们认识这个酶系已有几十年了,但直到最近才了解NRPSS的工作原理,并且开始尝试改变酶的结构,利用生物工程技术合成更多种类的药物7。1非核糖体合成酶的抗菌物质功能、研究现状11NRPS的抗菌物质及其应用除了20种蛋白质源的氨基酸外,NRPS含有大量的稀有氨基酸,目前已经鉴定
17、出300多种,包括D氨基酸、羟酸、N/O甲基氨基酸、犬尿氨酸KYNURENINE等。有些NRPS形成环化或杂合环化的分子有些还被糖基化、酰基化、脂质化等修饰,这些特点赋予了NRPS生理功能和生物活性的独特性和多样性8。NRPS具有多种对微生物生存、生长繁殖等所必需的生理功能,概括起来主要有以下几方面抗生素ANTIBIOTICS,抑制他种竞争者生长,这是微生物界普遍存在的现象铁载体SIDEROPHORES,细菌、蓝细菌、真菌等在铁元素成为限制性生长因子时,作为铁离子强敖合剂的铁载体被大量诱导产生,而从环境或特别是宿主的铁结合蛋白中获得充足的铁离子9毒素TOXINS,作为选择性侵染特异宿主的毒力因
18、子,突出的例子是烟曲霉ASPERGILLUSFUMIGATUS产生的毒素GLIOTOXIN可降低机体防御能力,能引起侵染性曲霉病INVASIVEASPERGILLOSIS,IA,烟曲霉已成为临床上仅次于白色念珠菌的一种重要的条件致病真菌10含氮物质的储存场所,如某些蓝细菌肽CYANOPHYCIN11作为调节生长、繁殖和分化的信号分子等。12NRPS的研究现状大量具有独特生物活性的非核糖体肽已经得到广泛应用或正处于研发中。应用最多的是多肽类抗生素,如杆菌肽、万古霉素、短杆菌肽等,在临床上具有高效的抗多种已产生抗生素抗性的革兰氏阳性病原菌的能力。此外,NRPS可作为免疫抑制剂药物,如环孢霉素CYC
19、LOSPORINE12抗真菌药物,如FENGYCIN13生物表面活性剂,如SURFACTINA14以及抗癌药物、细胞生长抑制剂和抗病毒药物等15。多年来,人们积极探索如何利用NRPSS来生产有药用价值的活性肽,并取得了一些重大进展,例如利用具有NRPSS的微生物通过发酵获得相应的多肽利用NRPSS的某些特定结构域进行多肽的人工合成或半合成对单个NRPSS模块或完整NRPSS的基因进行改造,或构建杂合的NRPSS,引入到受体菌,使之能合成我们需要的新的多肽等。2非核糖体肽合成酶主要结构域、表达及其研究非核糖体肽合成酶NRPS由多个模块组成,模块的特异结构域具有特定的酶活,催化相应单体结合到新生链
20、肽中。MODULE按特定的空间顺序排列而成,一个典型的模块由腺苷酰化ADENYLATION,A结构域、肽酰载体蛋白PEPTIDYLCARRPROTEIN,PCP结构域和缩合CONDENSATION,C结构域3个核心结构域组成。大多数NRPSS的模块数为315个,最高可达50个,模块的数量、种类和排列顺序决定了其最终的产物16。21模块的主要结构域211腺苷酰化结构域ADENYLATION结构域,简称A结构域在模块中,A结构域约550氨基酸残基是特异性的“守门者”。它们和4香豆酸COA连接酶,酰基COA连接酶,及氧化还原酶组成了酰苷酸形成酶超家族,这些酶的界定依据是保守的腺苷酸结合基序。结构域和
21、氨基酰TRNA合成酶功能相似,催化多肽合成的第一步反应,但是在初级结构和高级结构上,二者没有相似之处。虽然A结构域间的序列相似性只有3060,但它们都有核心基序A1,A2,A10。在三级结构上,A结构域由一个大结构域和一个小结构域组成,活性位点位于二者中间,折叠形式被形象地称为锤子铁砧模型17。研究未知酰苷酸酶底物特异性的传统方法是ATPPPI交换试验18,该方法以直观准确一直倍受青睐。近来,以核心基序A3和A6间的200个氨基酸为基础,通过比较它们与PHEA序列差别,得到了一种破解特异性授予编码的方法19,鉴定出形成氨基酸结合口袋的10个主要氨基酸。CHALLIS等20利用CLUSTALX分
22、析软件和目前可知的154个A结构域的数据,建立了重要残基和底物之间的特异性关系。另外,利用PVDD和GRSA序列相似性,以GRSA结构域的晶体结构为基础,开发构建三维结构模型的方法,被用来研究PVDD的特异性21。212巯基化结构域THIOLATION结构域,简称T结构域T结构域约80个氨基酸残基也被称为肽酰转移蛋白PEPTIDYLCARRIERPROTEIN,PCP,4磷酸泛酰巯基乙胺转移酶PPTASE超家族把PPANT辅基从乙酰COA转移到PCP或酰基载体蛋白ACYLCARRIEPROTEIN的丝氨酸残基上,非核糖体肽合成酶由前酶转化为全酶。人们尝试把这些天然的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶和非核
23、糖体肽合成酶组合,人工合成新的代谢物,并获得成功。213缩合结构域CONDENSATION结构域,简称C结构域C结构域约450氨基酸残基位于模块的N端,负责肽键的形成,含有7个高度保守的核心基序C1,C2,C7。研究C结构域对亲核氨基酸受体和亲电子受体的选择是A结构域研究以外的另一个难题。序列分析暗示,核心基序C3,即HIS基序HHXXXDG,与C结构域的活性有关。STACHELHAUS等利用短杆菌肽S合成酶和短杆菌酪肽合成酶构建的酶系统,对肽键形成进行了详尽的研究22。22非核糖体肽合成酶的表达非核糖体多肽合成酶,这是一类自然界中存在的分子质量最大的酶,它们能识别特定的氨基酸并将其直接相连形
24、成多肽链。NRPSS由多个模块MODULE按特定的空间顺序排列而成,每一个模块负责将一个氨基酸整合到产物的骨架中,肽链延伸的一个反应循环过程23A结构域从底物池中选择结合特定的氨基酸,在ATP的作用下合成相应的氨酰AMP而使氨基酸底物得到活化氨酰AMP与PCP结构域上的辅因子磷酸泛酰巯基乙胺的巯基结合,形成氨酰S载体复合物分别携带有氨酰基和肽酰基的载体第一个肽键是两个带有氨酰基的载体与C结构域上的特定区域结合,氨酰S载体复合物上的氨基向肽酰S载体复合物上肽酰基的酰基进行亲核攻击,而形成新肽键,产生延长了一个氨基酸的新的肽酰S载体复合物和游离的载体。在最后一个模块的C2末端通常有起终止延伸和释放
25、产物功能的硫酯THIOESTERASE,TE结构域。PCP上的线性肽转移到TE结构域的活性位点,形成肽OTE中间产物,中间产物随后被水解释放出线性肽,或者多数情况下经过分子内亲核攻击而合成环化产物。但有些NRPSS的TE结构域缺失或者被依赖于NADP的末端还原酶所替代,越来越多的末端还原酶被发现,暗示着通过还原释放机制来完成链终止反应可能是另一种普遍存在的终止机制24。此外,差向异构EPIMERIZATION,E结构域、N甲基化NMETHYLATION,M结构域等对底物氨基酸进行修饰乙酰化、糖基化、脂质化结构域等对多肽骨架进行修饰。如果NRPSS不具有这些结构域,修饰作用则由独立于NRPSS的
26、相应酶催化完成。3前景展望微生物产生的非核糖体肽,因其结构复杂、种类繁多而具有激素、抗生素、离子载体系统、抗真菌素、抗癌制剂等丰富多样的生物活性,而且在生物体内具有较好的抗酶解和抗化学降解特性。非核糖体肽合成酶编码基因的操作潜力很大,可以利用微生物合成药品的类似物,甚至全新的药品。参考文献1CROSAJH,WALSHCTGENETICSANDASSEMBLYLINEENZYMOLOGYOFSIDEROPHOREBIOSYNTHESISINBACTERIAJMICROBIOLMOLBIOLREV,2002,662232492WELKERM,DOHRENHCYANOBACTERIALPEPTIDE
27、SNATURESOWNCOMBINATORIALBIOSYNTHESISJFEMSMICROBIOLREV,2006,305305633MIAOV,COEFFETLEGALMF,BRIANP,ETALDAPTOMYCINBIOSYNTHESISINSTREPTOMYCESROSEOSPORUSCLONINGANDANALYSISOFTHEGENECLUSTERANDREVISIONOFPEPTIDESTEREOCHEMISTRYJMICROBIOLRES,2005,151150715234SCHWECKET,GOTTLINGK,DUREKP,ETALNONRIBOSOMALPEPTIDESYN
28、THESISINSCHIZOSACCHAROMYCESPOMBEANDTHEARCHITECTURESOFFERRICHROMETYPESIDEROPHORESYNTHETASESINFUNGIJCHEMBIOCHEM,2006,76126225RICHARDTA,KEMMET,WAGNERS,ETALEBONY,ANOVELNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEFORBETAALANINECONJUGATIONWITHBIOGENICAMINESINDROSOPHILAJJBIOLCHEM,2003,27841160411666KASAHARAT,KATOTNUTRITI
29、ONALBIOCHEMISTRYANEWREDOXCOFACTORVITAMINFORMAMMALSJNATURE,2003,4228328397GEWOLBJWORKINGOUTSIDETHEPROTEINSYNTHESISRULESJSCIENCE,2002,295220522078GRUNEWALDJ,MARAHIELMACHEMOENZYMATICANDTEMPLATEDIRECTEDSYNTHESISOFBIOACTIVEMACROCYCLICPEPTIDESJMICROBIOLMOLBIOREV,2006,701211469SHARMAA,JOHRIBNGROWTHPROMOTIN
30、GINFLUENCEOFSIDEROPHOREPRODUCINGPSEUDOMONASSTRAINSGRP3AANDPRS9INMAIZEZEMAYSLUNDERIRONLIMITINGCONDITIONSJMICROBIOLRES,2003,15824324810CRAMERRAJR,GAMCSIKMP,BROOKINGRM,ETALDISRUPTIONOFNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEINASPERGILLUSFUMIGATUSELIMINATEGLIOTOXINPRODUCTIONJEC,2006,597280311PICOSIS,VALLADARESA,FL
31、ORESE,ETALNITROGENREULATEDGENESFORTHEMETABOLISMOFCYANOPHYCIN,ABACTERIALNITROGENRESERVEPOLYMERJJBIOCHEM,2004,279115821159212LIUJ,FARMERJD,LANEJWS,ETALCALCINEURINISACOMMONTARGEOFCYCLOPHILINCYCLOSPORINAANDFKBPFK506COMPLEXESJCELL,1991,6680781513SAMELSA,WAGNERB,MARAHIELMA,ETALTHETHIOESTERASEDOMAINOFTHEFE
32、NGYCINBIOSYNTHESISCLUSTERASTRUCTURALBASEFORTHEMACROCYCLIZATIONOFANONRIBOSOMALLIPOPEPTIDEJJMOLBIOL,2006,35987688914SIEBERSA,MARAHIELMALEARNINGFROMNATURESDRUGFACTORIESNONRIBOSOMALSYNTHESISOFMACROCYCLICPEPTIDESJJBACTERIOL,2003,1857036704315ROONGSAWANGN,LIMSP,WASHIOK,ETALPHYLOGENETICANALYSISOFCONDENSATI
33、ONDOMAINSINTHENONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASESJFEMSMICROBIOLLETT,2005,25214315116SCHWARZERD,FINKINGRANDMARAHIELMANONRIBOSOMALPEPTIDESFROMGENESTOPRODUCTSJPRODREP,2003,2027528717BALDWINTOFIREFLYLUCIFERASETHESTRUCTUREISKNOWN,BUTTHEMYSTERYREMAINSJSTRUCTURE,1996,422323718LEESG,LIPMANNFTYROCIDINESYNTHETASES
34、YSTEMJMETHODSENZYMOL,1975,4358559019STCAHELHAUST,MOOTZHD,MARAHIELMATHESPECIFICITYCONFERRINGCODEOFADENYLATIONDOMAININNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASESJCHEMBIOL,1999,649350120CHALLISGL,RAVELJ,TOWNSENDCAPREDICTIVE,STRUCTUREBASEDMODELOFAMINOACIDRECOGNITIONBYNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEADENYLATIONDOMAINSJC
35、HEMBIOL,1999,721121821ACKERLEYDF,CARADOCDAVIESTT,LAMONTILSUBSTRATESPECIFICITYOFTHENONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEPVDDFROMPSEUDOMONASAERUGINOSAJJBACTERIL,2003,1852848285422STACHELHAUST,MOOTZHD,BERGENDAHLV,ETALPEPTIDBONDFORMATIONINNONRIBOSOMALPEPTIDEBIOSYNTHESIJJBIOLCHEM,1998,2732277323HENNINGDM,MOHAMED
36、AMBIOSYNTHETICSYSTEMSFORNONRIBOSOMALPEPTIDEJCURROPINCHEMBIOL,1997,154355124BECKERJE,MOORER,MOOREBSCLONING,SEQUENCING,ANDBIOCHEMICALCHARACTERIZATIONOFTHENOSTOCYCLOPEPTIDEBIOSYNTHETGENECLUSTERMOLECULARBASISFORIMINEMACROCYCLIZATIONJGENE,2004,3253542本科毕业设计（20_届）NJ632中腺苷酰化结构域的基因重组表达与纯化目录中英文摘要1引言111非核糖体肽研
37、究现状112非核糖体肽合成酶研究现状113腺苷酰化结构域214研究内容，目的与意义22实验材料与方法221实验材料2211主要材料2212主要仪器3213主要溶液配制322实验方法4221A3结构域扩增4222PCR产物电泳4223割胶回收目的片段4224大肠杆菌DH5感受态的制备5225连接与转化5226克隆质粒筛选5227表达质粒构建6228诱导表达73结果931目的片段PCR扩增932克隆质粒构建933表达质粒构建1134含重组表达质粒的M15诱导表达114讨论12致谢13参考文献14摘要非核糖体肽NONRIBOSOMALPEPTIDES,NRPS是一类具有巨大药用价值的多肽。它的合成主
38、要在非核糖体肽合成酶NONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASES,NRPSS的作用下完成。本文以NRPSS核心模块A结构域为着手点，利用分子生物学技术进行外源表达。结果表明，在5接种量、30、120RPM、1MMIPTG条件下诱导4H后，A3结构域的表达量达到最大，这为后续的蛋白纯化以及蛋白功能研究提供量的支持。同时，这也为NRPS模块的功能研究以及模块的组合功能和后续具有重要价值的活性产物研究奠定良好的基础工作。关键词非核糖体肽合成酶；腺苷酰化结构域；基因克隆；诱导表达ABSTRACTNONRIBOSOMALPEPTIDESNRPSAREACLASSOFPEPTIDESWHI
39、CHHAVEGREATMEDICINALVALUEITSBIOLOGICALSYNTHESISWASMAINLYCOMPLETEDWITHTHEHELPOFNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASESNRPSSHERE,WESUCCESSFULLYACHIEVEHETEROLOGOUSEXPRESSIONOFADENYLATIONADOMAIN,ACOREMODULEOFNRPSS,USINGMOLECULARBIOLOGYTECHNIQUESTHERESULTSSHOWEDTHATONTHECONDITIONSOFTHE5INOCULUM,30,120RPM,1MMIPTG,
40、4HINDUCTION,THEEXPRESSIONOFA3DOMAINREACHEDTHEMAXIMUM,WHICHPROVIDETHEAMOUNTSUPPORTFORTHESUBSEQUENTPROTEINPURIFICATIONANDFUNCTIONALSTUDYATTHESAMETIME,THISRESEARCHISEXPECTEDTOLAYAGOODFOUNDATIONFORTHEFUNCTIONALMODULESANDTHECOMBINANTMODULESOFNRPSANDFOLLOWUPBIOLOGICALACTIVEPRODUCTSOFGREATPOTENTIALVALUEKEY
41、WORDSNONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASEADENYLYLATIONDOMAINGENECLONEEXPRESSION1引言11非核糖体肽研究现状在自然界,细菌1、蓝细菌2、放线菌3和真菌4等微生物,甚至果蝇5、小鼠6等动物,能通过非核糖体途径合成一系列低分子量的具有药用价值的多肽类次生代谢产物。这些多肽类物质结构复杂、种类繁多,统称为非核糖体肽NONRIBOSOMALPEPTIDES,NRPS。NRPS具有多种对微生物生存、生长繁殖等所必需的生理功能,概括起来主要有以下几方面抗生素ANTIBIOTICS,抑制他种竞争者生长,这是微生物界普遍存在的现象铁载体SIDER
42、OPHORES,细菌、蓝细菌、真菌等在铁元素成为限制性生长因子时,作为铁离子强敖合剂的铁载体被大量诱导产生,而从环境或特别是宿主的铁结合蛋白中获得充足的铁离子7毒素TOXINS,作为选择性侵染特异宿主的毒力因子,突出的例子是烟曲霉ASPERGILLUSFUMIGATUS产生的毒素GLIOTOXIN可降低机体防御能力,能引起侵染性曲霉病INVASIVEASPERGILLOSIS,IA,烟曲霉已成为临床上仅次于白色念珠菌8的一种重要的条件致病真菌含氮物质的储存场所,如某些蓝细菌肽CYANOPHYCIN9作为调节生长、繁殖和分化的信号分子等。除了20种蛋白质源的氨基酸外,NRPS含有大量的稀有氨基酸
43、,目前已经鉴定出300多种,包括D氨基酸、羟酸、N/O甲基氨基酸、犬尿氨酸KYNURENINE等。有些NRPS形成环化或杂合环化的分子有些还被糖基化、酰基化、脂质化等修饰,这些特点赋予了NRPS生理功能和生物活性的独特性和多样性10。大量具有独特生物活性的非核糖体肽已经得到广泛应用或正处于研发中。应用最多的是多肽类抗生素,如杆菌肽、万古霉素、短杆菌肽等,在临床上具有高效的抗多种已产生抗生素抗性的革兰氏阳性病原菌的能力。此外,NRPS可作为免疫抑制剂药物,如环孢霉素CYCLOSPORINE11抗真菌药物,如FENGYCIN12生物表面活性剂,如SURFACTINA13以及抗癌药物、细胞生长抑制剂
44、和抗病毒药物等14。12非核糖体肽合成酶研究现状NRPS的生物合成是由非核糖体肽合成酶NONRIBOSOMALPEPTIDESYNTHETASES,NRPSS、聚酮合成酶POLYKETIDESYNTHASES,PKSS、NRPSS/PKSS杂合酶等多功能蛋白复合体完成。其中,NRPSS是NRPS生物合成的主要酶也是研究最多最深入的酶,由多个模块MODULE组成,各模块的特定结构域具有特定的酶活性。模块按特定的空间顺序排列而成,一个典型的模块由腺苷酰化ADENYLATION,A结构域、肽酰载体蛋白PEPTIDYLCARRPROTEIN,PCP结构域和缩合CONDENSATION,C结构域3个核心
45、结构域组成。大多数NRPSS的模块数为315个,最高可达50个,模块的数量、种类和排列顺序决定了其最终的产物15。多年来,人们积极探索如何利用NRPSS来生产有药用价值的活性肽,并取得了一些重大进展,例如利用具有NRPSS的微生物通过发酵获得相应的多肽利用NRPSS的某些特定结构域进行多肽的人工合成或半合成16对单个NRPSS模块或完整NRPSS的基因进行改造,或构建杂合的NRPSS,引入到受体菌,使之能合成我们需要的新的多肽等。13腺苷酰化结构域ADENYLATION结构域,简称A结构域在模块中,A结构域约550氨基酸残基是特异性的“守门者”。它们和4香豆酸COA连接酶,酰基COA连接酶,及
46、氧化还原酶组成了酰苷酸形成酶超家族,这些酶的界定依据是保守的腺苷酸结合基序。结构域和氨基酰TRNA合成酶功能相似,催化多肽合成的第一步反应,但是在初级结构和高级结构上,二者没有相似之处。虽然A结构域间的序列相似性只有3060,但它们都有核心基序A1,A2,A10。在三级结构上,A结构域由一个大结构域和一个小结构域组成,活性位点位于二者中间,折叠形式被形象地称为锤子铁砧模型17。研究未知酰苷酸酶底物特异性的传统方法是ATPPPI18交换试验,该方法以直观准确一直倍受青睐。近来,以核心基序A3和A6间的200个氨基酸为基础,通过比较它们与PHEA序列差别,得到了一种破解特异性授予编码的方法19,鉴
47、定出形成氨基酸结合口袋的10个主要氨基酸。CHALLIS20等利用CLUSTALX分析软件和目前可知的154个A结构域的数据,建立了重要残基和底物之间的特异性关系。另外,利用PVDD和GRSA序列相似性,以GRSA结构域的晶体结构为基础,开发构建三维结构模型的方法,被用来研究PVDD的特异性21。14研究内容，目的与意义将从海绵中筛选到的附生微生物NJ632中的可能参与合成活性产物的NRPS基因簇中的A结构域之一的A3结构域导入异源宿主中，利用表达宿主本身自带的或人工修饰的表达调控元件使该结构域得到高效表达。同时，利用改造的表达质粒所携带的HIS标签对异源表达的A结构域进行体外表达与纯化，为后
48、续的酶活实验提供良好的蛋白样品。研究该结构域对氨基酸底物的特异选择性。一方面可以印证ADOMAIN的实验结果是否与计算机模拟预测一致；另一方面可以为研究NRPS的合成机制以及目的肽链的改造奠定理论基础。2实验材料和方法21实验材料211主要材料1菌株大肠杆菌DH5购于TAKARA（日本）；大肠杆菌M15购于QIAGENE（德国）2主要试剂PMD18T载体，TAQDNA聚合酶，NCO和BGL，DNA片段回收纯化试剂盒，琼脂糖胶DNA回收纯化试剂盒，质粒抽提试剂盒购于TAKARA（日本）；PQE60购于QIAGEN（德国）；ITPG，氨苄霉素，XGAL，TEMED，SDS购于上海生物工程公司（中国
49、）。212主要仪器台式高速离心机（EPPENDOFF，德国）；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；智能控制小型光照冷冻摇床（上海堪鑫，中国）；纯水制备系统（PALL，美国）；琼脂糖凝胶电泳仪，聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（BAYGENE，中国）；恒温培养箱（上海博迅，中国）；PCR仪（THERMOBIOMETRA，美国）；凝胶成像系统（UVP，中国）213主要溶液配制1培养基LB液体培养基NACL1，酵母抽提物05，胰蛋白胨1，固体培养基则是在液体培养基基础上添加15琼脂，高压蒸汽灭菌20分钟。250TAETRIS242G，冰乙酸571ML，05MOL/LEDTA（PH80）100ML，加水定容至1L，使用时采用1TAE。301MOL/LCACL2溶液称取111GCACL2无水,分析纯，溶于50ML重蒸水中,定容至100ML，高压灭菌。4含15甘油的01MOL/LCACL2称取111GCACL2无水,分析纯,溶于50ML重蒸水中,加入15ML甘油,定容至100ML,高压灭菌。5IPTG保存液（1M）500MGIPTG20溶于20ML蒸馏水，用滤膜进行无菌过滤,分装保存于20。6LYSISBUFFER100MMNAH2PO4，10MMTRISCL，8MUREA。7SDSPAGE所用试剂40ACR/BIC（3751
