1、本科毕业论文（20_届）人工感染3种致病弧菌对大黄鱼7种酶活性的影响所在学院专业班级水产养殖学学生姓名学号指导教师职称完成日期年月1目录摘要（ABSTRACT）1引言12材料与方法221实验材料2211实验用鱼2212实验菌株2213试剂2214仪器222实验方法2221各菌株感染浓度的确定2222实验分组3223菌悬液的配置3224人工感染3225样品采集3226血清溶菌酶活性测定3227血清酚氧化酶活性的测定3228血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的测定3229数据处理43结果和分析431血清溶菌酶（LSZ活性变化432血清酚氧化酶PO活性变化433血清超氧化物歧化酶SOD活
2、性变化534血清酸性磷酸酶ACP活性变化535血清碱性磷酸酶AKP活性变化636血清髓过氧化物酶MPO活性变化737血清过氧化物酶POD活性变化74讨论75结论与展望9致谢9参考文献102摘要目前频发的大黄鱼溃疡病主要由溶藻弧菌、哈维氏弧菌以及副溶血弧菌引起。本实验将健康的大黄鱼分为3个实验组和1个对照组，分别注射02ML的哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水，并在人工感染后的0，1，2，4，7，10，13，16，20D分别采样，通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性，比较这3种致病弧菌毒性差异及对大黄鱼非特异性免疫功能的影响。结果显示在感染后的110D，每个实验组的大黄鱼血清中
3、LSZ、ACP、POD、MPO的活性变化，总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于一致的现象，且不同病原菌之间存在一定的时效差异。AKP、PO、SOD和LSZ对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感，ACP、SOD、POD和MPO对入侵体内的溶藻弧菌反应较敏感，LSZ、ACP和PO对入侵体内的副溶血弧菌反应较敏感。关键词大黄鱼；溶藻弧菌；哈维氏弧菌；副溶血弧菌；酶活性EFFECTSOFEXPERIMENTALINFECTIONWITHTHREEPATHOGENICVIBRIOONSEVENENZYMESINPSEUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）ABSTRACTTHEULCERD
4、ISEASE,WIDELYSPREADONTHELARGEYELLOWCROAKER,ISMAINLYCAUSEDBYVIBRIOALGINOLYTICUS,VIBRIOHARVEYIANDVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSACCORDINGTOTHERESEARCHESINTHISPAPER,WESET3EXPERIMENTALGROUPSWITHTHEINJECTIONOF02MLVIBRIOHARVEYI,VIBRIOALGINOLYTICUSANDVIBRIOPARAHAEMOLYTICUS,RESPECTIVELY,WHILEINJECTINGTHESAMEDOSEOFST
5、ERILESALINEFORTHECONTROLGROUPTHENSAMPLEDAT0,1,2,4,7,10,13,16AND20DAYSAFTERINFECTIONBYMEASURINGTHEACTIVITYOF7DIFFERENTIMMUNITYRELATEDENZYMESINSERUM,WECOMPAREDTHEDIFFERENTTOXICITYOFTHETHREEPATHOGENICVIBRIOANDSTUDIEDTHEINFLUENCEONTHEFUNCTIONOFPSEUDOSCIAENACROCEASNONSPECIFICIMMUNITYUNDERTHEPRESSUREOFTHR
6、EEOFPATHOGENICVIBRIOTHERESULTSSHOWEDTHATFROM1TO10DAYSAFTERINFECTION,THEACTIVITYOFLSZ,ACP,PODANDMPOINPSEUDOSCIAENACROCEASSERUMINCREASEDATFIRSTANDTHENDECREASED,BUTTHEYWENTTOANACCORDANTTENDENCYFINALLYTHEEXPERIMENTALSOINDICATEDTHATDIFFERENTPATHOGENSHADTIMEDIFFERENCEEFFECTTHROUGHFURTHERANALYZING,WEOBSERV
7、EDTHATAKP,PO,SODANDLSZWASMORESENSITIVETOVIBRIOHARVEYIINFECTION,WHILEACP,SOD,PODANDMPOWASMORESENSITIVETOVIBRIOALGINOLYTICUSINFECTIONANDLSZ,ACPANDPOWASMORESENSITIVETOVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINFECTIONKEYWORDSPSEUDOSCIAENACROCEAVIBRIOALGINOLYTICUSVIBRIOHARVEYIVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSENZYMESACTIVITY11引言大黄鱼PS
8、EUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）隶属鲈行目，石首鱼科，黄鱼属，俗称黄鱼、黄瓜鱼、黄花鱼，是我国主要海产经济鱼类之一。随着大黄鱼人工育苗技术的完善，其养殖规模也迅速扩大，但由于养殖密度的加大及日常不科学的管理措施，疾病的流行和危害也日益严重，威胁着大黄鱼养殖业的健康发展。这包括长期近亲繁殖导致种质的退化，病害防治用药上有些养殖户或一些渔病防治员为了快速治好鱼病或为了赚钱,不顾农业部颁布的水产养殖质量安全管理规定31号令,未确定病原或病因而盲目大量使用禁用渔药或抗生素等,甚至使用人用的新药,形成滥用渔药的局面，都加大了病害发生率。目前已鉴定出的大黄鱼细菌性病原有溶藻弧菌（
9、VIBRIOALGINOLYTICUS）、副溶血弧菌（VPARAHAEMOLYTICUS）、哈维氏弧菌（VHARVEYI）、鳗弧菌（VANGUILLARUM）、创伤弧菌（VVULNIFICUS）、河流弧菌（VFLUVIALIS）、腐败假单胞菌（PSEUDOMONASPUTREFACIENS）、嗜水气单胞菌（AEROMONASHYDROPHILA）、肠型斑点气单胞菌（APUNCTATAFINTESTINALIS）、点状气单胞菌（APUNCTATA）、柱状屈挠杆菌（FLEXIBACTERCOLUMNARIS）和爱德华氏菌（EDWARDSIELLA）等（苏永全，张彩兰等，2004）。大黄鱼寄生虫病主
10、要有贝尼登虫病（杨文川等，2001）、库道虫病（简纪常等，2003）、隐核虫病等。关于大黄鱼病毒性疾病方面，已有研究表明在患病大黄鱼体内至少检测到2种可疑病毒，而且都存在于胞浆中。陈新华等也在被感染大黄鱼的脾、肾等组织观察到六边形彩虹病毒颗粒，并通过感染试验证实其为病原CHENXH等，2003。虽然引起大黄鱼疾病的病原菌种类很多，但目前仍以细菌性疾病为主，占800以上。其中溃疡病最为常见、发病范围最广、且危害最大。它可由哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌等多种致病弧菌引起，并且这些致病弧菌均是条件致病菌王国良，2008，其发病率和死亡率之高给大黄鱼养殖业带来严重的经济损失金珊，2005；郑天伦，2
11、006。近年来浙江、福建等各省网箱养殖的大黄鱼也经常发生溃疡病，其主要症状为体表褪色、呈浅黄色、有出血点，头部、尾部皮肤溃烂，病鱼的尾柄被严重腐蚀，大多数病鱼都露出尾椎骨；肌肉充血，部分病鱼的身体一侧或两侧鳞片成片脱落，下颌、鳍基部充血，病鱼离群独游。解剖发现肝脏肿大、土黄色，有腹水，肠与腹部粘连（王军，张朝霞等，2001）。鱼类作为低等脊椎动物，同哺乳动物等脊椎动物相比，其特异性免疫机制相对较低下，所以在感染各种病原细菌时，更多地是依赖于先天性的非特异免疫。胸腺、肾脏、脾脏和粘膜淋巴组织是鱼类最主要的免疫器官与组织（肖克宇等，2007）。在受到微生物侵扰时，鱼体炎症反应的核心细胞是吞噬细胞（
12、孙建和等，1998）。而NBT阳性细胞是吞噬细胞、中性粒细胞、巨噬细胞这3种细胞的总称（王军等，2001），是鱼体吞噬能力的极好指示剂。溶菌酶作为鱼类的非特异性免疫物质之一，在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿防御机制中起着重要作用（CHRISTOPHERJBAYNE等，2001）。所以通过测定鱼类血液中白细胞的吞噬能力和吞噬率以及溶菌酶的活性，在一定程度上可以反映鱼类机体非特异性免疫状态（陈昌福等，1996）。超氧化物歧化酶是重要的抗氧化酶，在清除体内自由基，在抗菌、抗病毒及延缓机体衰老及防止生物大分子损伤等方面具有重要作用（薛飞等，2007）；碱性磷酸酶是血细胞溶酶体的特征酶，会对异物产生水解破
13、坏作用（张辉等，2003）。因此超氧化物歧化酶、碱性磷酸酶等许多酶类均可作为机体非特异性免疫指标，来评判病原菌对机体非特异性免疫力的影响。近年来国内外许多学者已经通过自然感染或人工感染不同的鱼类，对鱼类的抗感染免疫机理进行了不同角度的研究。YILDIZ等1998研究了人工感染荧光假单胞菌（PSEUDOMONASFLUORESCENS对鲤鱼血液学参2数的各种变化；孙峰等2005通过人工感染嗜水气单胞AHYDROPILA对鲫鱼白细胞数量、NBT阳性细胞数量以及血清溶菌酶活力的变化趋势，来研究感染病原菌对鱼类非特异性免疫功能的影响；鄢庆枇、张俊杰等2007研究了人工感染溶藻弧菌对大黄鱼免疫功能的影响
14、，洪婧妮等2009人研究了哈维氏弧菌和溶藻弧菌感染大黄鱼24H后，对部分组织中6种酶活性的影响。这些鱼类的许多非特异性免疫指标可作为它们健康状况和抗感染免疫能力强弱的标志。而从免疫学角度进行水产养殖病害防治研究，通过提高鱼体非特异性免疫机能从而提高其抗病能力，减少疾病的发生，已成为目前水产动物疾病预防与控制研究领域的热点。在免疫增强剂研究方面，鄢庆枇、王军等采用低聚糖益力素等免疫营养物投喂大黄鱼提高了溶菌酶活力、抗菌活力、白细胞数量和吞噬能力（鄢庆枇等，2001；王军等，2001）；在免疫预防方面，吴志鹏等人研究了采用不同方法制备的溶藻弧菌、副溶血弧菌和嗜水气单胞菌三联疫苗及不同的免疫途径对大
15、黄鱼的免疫效果，结果表明福尔马林灭活疫苗注射免疫途径效果最佳（吴志鹏等，2004）；在中草药制剂的研究方面，郑天伦等人进行的大黄鱼弧菌病的中草药防治研究表明石榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物对溶藻弧菌的抑菌作用显著（郑天伦等，2005）。尽管关于大黄鱼免疫功能的基础研究有所发展，但仍处于较薄弱阶段。而目前对大黄鱼抗感染的非特异性免疫机能研究也基本上是针对一种病原菌的感染后分析，尚未见有关引起大黄鱼溃疡病的不同病原菌之间的毒力差异及对大黄鱼免疫功能影响的差异性比较研究。本研究通过人工感染引起大黄鱼溃疡病的溶藻弧菌（VIBRIOALGINOLYTICUS）、副溶血弧菌（VPARAHAEMOLYT
16、ICUS）、哈维氏弧菌（VHARVEYI）等3种病原菌后，分析大黄鱼血清中7种免疫相关酶的变化特点，比较研究其致病机理和规律，对丰富大黄鱼免疫防御机制的理论基础、免疫增强剂的筛选及提高免疫防治技术都具有重要理论意义和应用价值。2材料与方法21实验材料211实验用鱼大黄鱼来自浙江宁波象山黄避岙养殖海区，选择体表无明显伤痕，体重250300G之间，摄食正常的健康大黄鱼。212实验菌株哈维氏弧菌VHARVEYI、溶藻弧菌VALGINOLYTICUS、副溶血弧菌VPARAHAEMOLYTICUS等菌株，均分离自患病大黄鱼，并经回归感染试验证明具有较强毒力金珊，2005，保存于本实验室。溶壁微球菌MIC
17、ROCOCCUSLYSOLEIKTICUS购置SIGMA公司。213试剂L多巴上海伯奥生物科技公司214仪器电热恒温培养箱DHP9082型；SUNRISE吸光酶标仪；恒温水浴锅；紫外分光光度计。22实验方法221各菌株感染浓度的确定将保存的哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分别接种于50海水营养琼脂斜面上，28C恒温培养24H后，用085无菌生理盐水洗下菌苔，先经比浊法计数，最终采用平板倾注法计数活菌数。将各种菌3液浓度调整至109CFUML1左右，再稀释成106，107，1083个梯度的菌悬液，备用。将健康大黄鱼随机分为4组，每组10尾，、和组分别腹腔注射上述备用的106，107，1083个浓
18、度的菌悬液，每尾注射02ML，组注射02ML灭菌的生理盐水。观察注射后12周内各感染组鱼的死亡情况，最终确定试验时哈氏弧菌感染浓度为106CFUML1，溶藻弧菌和副溶血弧菌感染浓度为107CFUML1。222实验分组购买的健康大黄鱼随机分成四组，放养于浙江省宁波市象山县黄避岙海水网箱养殖鱼排，网箱规格3M3M3M，试验期间水温281，海水盐度28，每组放养80尾，正常投喂，暂养1周后开始实验。223菌悬液的配置150海水营养琼脂培养基的制备称取普通营养琼脂商品培养基33G，溶于500ML蒸馏水中，加入500ML陈海水，加热搅拌，煮沸至完全溶解，在高压蒸气1054986KG/M2下灭菌20MIN
19、，最终PH为7301，做无菌试验后备用。2菌液配制将保存的哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌分别接种于50海水营养琼脂斜面上，28C恒温培养24H后，用085无菌生理盐水洗下菌苔，先经比浊法计数，调整哈氏弧菌菌液浓度至106CFUML1，调整溶藻弧菌和副溶血弧菌菌液浓度至107CFUML1。3菌液浓度计算采用平板倾注法，10倍稀释各组菌悬液，分别吸取稀释104、105和106的菌悬液进行平板倾注，然后在28恒温培养箱中，培养2428H后进行计数，计算感染所用各种菌悬液的活菌浓度。224人工感染大黄鱼用丁香酚麻醉后，进行腹腔注射感染，实验组，分别注射哈氏弧菌、溶藻弧菌以及副溶血弧菌，每尾注射02M
20、L上述对应菌悬液，对照组每尾注射02ML灭菌的生理盐水。试验期间各组大黄鱼均未发生死亡现象。225样品采集在感染后第0D，1D，2D，4D，7D，10D，13D，16D，20D分别从各感染组与对照组随机各取6尾大黄鱼，采用一次性注射器，尾静脉取血，各组制备三个平行血样后进行7种酶指标检测。226血清溶菌酶活性的测定采用HULTMARK等1980的方法以溶壁微球菌为底物，将该菌用01MOL/L、PH64的磷酸钾盐缓冲液配成A57003的菌悬液，取30ML该菌悬液与200L待测血清于试管中混匀，于570NM处测定其A0，然后将试管置于37水浴保温30MIN，然后取出立即置冰浴中10MIN以终止反应
21、，测定其A值，溶菌活力UL按下式计算ULA0A/A227血清酚氧化酶活性的测定以L多巴为特异性底物，采用改进的ASHIDA等1971方法在96孔酶标板中进行。在96孔酶标板中加入10L血清，然后向各孔中加入200L01MOL/LPH60磷酸钾缓冲液，最后向各样品孔中加入10L的LDOPA液001MOL/L，在酶标仪中振荡4次混匀，每隔4MIN读取490NM处的吸光值OD。在该试验条件下，将每分钟OD值增加0001作为一个酶活力单位。228血清MPO、AKP、ACP、POD、SOD活性的测定根据购自南京建成生物技术研究所的试剂盒，分别测定试验组，和对照组大黄鱼血清中，髓过氧化物酶MPO、碱性磷酸
22、酶AKP、酸性磷酸酶ACP、超过氧化物岐化酶SOD、过氧化物酶POD4的活性。229数据处理对于试验所得数据应用EXCEL2003软件进行整理和作图；试验结果用SPSS130统计软件进行生物统计学分析；各组处理平均数之间采用LSD检验方法进行差异显著性比较。3结果与分析31血清溶菌酶LSZ活性变化血清溶菌酶活性变化趋势见图1。在感染后1D时，实验组、均极显著高于对照组P005。10D时，实验组有所下降与对照组差异显著P005；不同字母表示差异显著P005。结果显示感染后血清酚氧化酶活性在14D内发生了明显的变化，不同病原菌之间存在一定的时效差异。5AAAAABAABBBC00204060811
23、214160124710131620感染天数（D）DAYSPOSTINFECTIONPO活性/UPODACTIVITY哈氏弧菌感染组溶藻弧菌感染组副溶血弧菌感染组正常对照组图23种致病弧菌对大黄鱼血清酚氧化酶酶活性的影响FIG2EFFECTSOFTHREEPATHOGENICVIBRIOONPHENOLOXIDASEACTIVITYINPCROCEA33血清超氧化物岐化酶SOD活性变化血清超氧化物歧化酶活性变化趋势见图3。1D时，实验组、超氧化物歧化酶活性降低，与实验组，对照组差异极显著P005，而实验组与之间存在显著差异P005。2D时，实验组显著上升，与对照组和实验组、都存在极显著差异P0
24、05。4D时，实验组明显上升与对照组差异极显著P005，4D时显著低于对照组P005，7D后与对照组基本保持一致。实验组在感染后110D内，髓过氧化物酶活性变化较为明显，主要呈现先上升后下降的趋势，在第1D、4D显著高于对照组P005，在第2D、7D极显著高于对照组P001，第10D时显著低于对照组P005，10D以后与对照组差异不显著。实验组髓过氧化物酶活性变化不明显，与对照组差异不显著。AAAAABBBBBABACAABAABCAA0501001502002503003500124710131620感染天数（D）DAYSPOSTINFECTIONMPO活性（U/L）MPOACTIVITY哈
25、氏弧菌感染组溶藻弧菌感染组副溶血弧菌感染组正常对照组图63种致病弧菌对大黄鱼血清髓过氧化物酶活性的影响FIG6EFFECTSOFTHREEPATHOGENICVIBRIOONMYELOPEROXIDASEACTIVITYINPCROCEA37血清过氧化物酶POD活性变化血清过氧化物酶活性变化趋势见图7。1D时，实验组过氧化物酶活性降低，与对照组差异显著P005，与实验组、存在极显著差异P001。2D时，实验组活性明显降低，显著低于对照组P005，实验组、与对照组无显著差异P005。4D时，实验组显著高于实验组、P005。7D时，实验组显著低于实验组、P005。10D时，实验组显著高于对照组和实
26、验组、P005。13D后各组水平基本趋于一致。4讨论鱼体内的酶主要分布于组织细胞中。在正常情况下，血清中酶活性较低且相对恒定。当组织发生损伤时，细胞中的一些酶会大量逸出进入血淋巴导致血清中酶活性发生改变。因此通过测定血清中酶的活性变化可以反映鱼体的生理状态。酚氧化酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶等都是免疫酶，是评价鱼类非特异性免疫能力的指标。当病原菌进入鱼体后，首先引起机体非特异性免疫反应。随着吞噬细胞的吞噬作用，溶酶体分泌溶酶体酶，以防御病原菌对鱼体的损伤。溶酶体酶主要包括溶菌酶LSZ、酸性磷酸酶ACP和碱性磷酸酶AKP，这些酶在非特异性免疫应答中起着重要作用。8AAAAABBBA
27、BABBBBAABABAB0204060801001201401601800124710131620感染天数（D）DAYSPOSTINFECTIONPOD活性（U/ML）PODACTIVITY哈氏弧菌感染组溶藻弧菌感染组副溶血弧菌感染组正常对照组图73种致病弧菌对大黄鱼血清过氧化物酶活性的影响FIG7EFFECTSOFTHREEPATHOGENICVIBRIOONPEROXIDASEACTIVITYINPCROCEA溶菌酶作为鱼类重要的非特异性免疫因子，在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿起着重要作用CHRISTOPHER，2001。溶菌酶是一种能水解黏多糖的碱性酶，能水解细菌细胞壁中的黏多糖，使细
28、胞壁不溶性多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂、细菌内容物逸出而使细菌死亡，起到防御的功能。因此对于抵抗各种病原体的侵袭、增强疾病的抵抗力方面具有重要意义王宏田，2000。孙峰等2005曾研究了人工感染嗜水气单胞菌后鲫鱼体内溶菌酶活性的变化。该研究表明，机体在受到外来病原菌感染时，吞噬细胞能够合成和释放出更多的溶菌酶，提高了溶解病菌的能力。本实验中，大黄鱼在感染3种致病弧菌后的第17D内溶菌酶活性变化较为明显，各实验组溶菌酶活性变化总体表现出先升高、后略有降低接着又逐渐升高最后趋于一致的趋势。其主要原因可能是感染初期鱼体受到病原菌的刺激导致一些免疫细胞的活性增加，以致分泌溶菌酶的能力增强，使血
29、清中溶菌酶的浓度升高，从而增加了对病原菌的溶解能力；但随着刺激的不断增强，溶菌酶分泌受到抑制，活性有所降低；而随着鱼体自身免疫系统的不断调节，溶菌酶活性又开始上升；第10D以后溶菌酶活性变化不显著，这可能是由于病原菌不断被溶解，使溶菌酶的活性没有太大变化。本实验结果还表明，在感染副溶血弧菌实验组，大黄鱼溶菌酶的活性变化较为明显。磷酸酶是动物体内普遍存在且与动物生命活动密切相关的酶系，它参与动物体内物质的吸收运转、生长分化、分泌等多种生理活动。碱性磷酸酶AKP和酸性磷酸酶ACP也是溶酶体酶的重要组成部分，在免疫反应中发挥着重要作用肖克宇，2007。本实验结果表明，各实验组的大黄鱼在感染后第213
30、D内ACP活性变化较为明显，主要呈现出先升高，后略有下降然后又逐渐升高的趋势，与溶菌酶活性变化趋势类似。其中溶藻弧菌对大黄鱼血清中ACP活性影响最显著。3种致病弧菌对大黄鱼血清AKP活性变化主要表现为哈氏弧菌感染组先下降后显著上升，然后再有所下降之后变化不明显，而溶藻弧菌感染组和副溶血弧菌感染组活性变化总体变现为不显著。不同菌种对大黄鱼酶的影响存在差异性ACP活性变化对溶藻弧菌较为敏感，AKP活性变化对哈氏弧菌较为敏感。超氧化物歧化酶SUPEROXIDEDISMUTASE，SOD是一种重要的抗氧化酶，能够催化超氧阴离子O2的歧化作用，产生过氧化氢H2O2和氧O2，促使机体自由基的形成和清除处于
31、动态平衡。超氧化物歧化酶在9对延缓机体衰老、防止生物大分子损伤等方面具有重要作用。此外，SOD还具有抗菌、抗病毒等效果。已有研究表明SOD活性与生物免疫机能密切相关，对于增强吞噬细胞的防御能力及整个机体的免疫功能有重要作用ZEGERS，1999。本试验结果表明，各实验组在感染后的12D内SOD活性有所下降。当SOD活性降低时，机体内自由基等毒害物质就会积累，细胞便可能受到损伤；2D后SOD活性有所升高，但整体变化不明显，说明3种致病弧菌对大黄鱼超氧化物歧化酶活性影响不明显。过氧化物酶POD是一种氧化还原酶，主要存在于细胞的过氧化物酶体中。过氧化物酶体含有丰富的酶类，其主要作用是将过氧化氢等细胞
32、毒性物质分解，对细胞起到保护作用。过氧化物酶体普遍存在于真核生物的各类细胞中，尤其是在肝细胞和肾细胞中数量特别多，另外过氧化物酶体还具有解毒作用。髓过氧化物酶MPO是一种催化过氧化物还原的酶，通过将过氧化氢和氯离子变为次氯酸来抵抗外来物质，对各种病原菌具有很强的功效。从某些方面来看，过氧化物酶与髓过氧化物酶具有相似的生化性质，都有一定抗菌活性。本实验结果显示，各实验组血清中过氧化物酶活性的变化与髓过氧化物酶活性的变化也存在相似性。其影响主要发生在感染后的110D，表现出先上升，后下降然后再有所上升的趋势，说明大黄鱼血清抗菌活性随感染时间的延长发生了一定变化。另外各实验组酶活性变化也存在差异性，
33、溶藻弧菌对POD和MPO较为敏感，酶活性变化幅度较大。酚氧化酶PO是无脊椎动物重要的非特异性免疫因子，从氧化酶原PROPO被激活到产生黑色素这个过程中往往伴随呼吸爆发李国荣，2003。在某些研究中发现，超氧化物歧化酶活性在病原菌物入侵时有所提高简纪常，2004；杨文鸽，2006；。本实验结果也与之相符各实验组大黄鱼血清中PO活性在感染初期显著提高，增加了其免疫防御作用，而7D以后各实验组酚氧化酶活性基本恢复正常。5结论与展望本实验首次比较了引起大黄鱼溃疡病的三种致病弧菌对其机体损伤的毒力差异，以及对大黄鱼血清中7种免疫相关酶影响的差异性和相关性。研究表明大黄鱼被感染后，血清中7种免疫酶活性的变
34、化均主要发生在病原菌感染前期，说明非特异性免疫因子在感染的早期阶段起主要作用。3种致病弧菌对大黄鱼血清中各种酶活性的影响也存在差异性AKP、PO、SOD和LSZ对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感，ACP、SOD、POD和MPO对入侵体内的溶藻弧菌反应较敏感，LSZ、ACP和PO对入侵体内的副溶血弧菌反应较敏感。这些酶在鱼体抗感染非特异性免疫的启动和效应过程中发挥积极作用，也为养殖大黄鱼弧菌病早期检测指标的选择提供了参考依据。相信，随着对各种致病菌的致病机理，病原来源、侵入途径及对机体致病作用方式的更进一步研究；同时对大黄鱼免疫功能基础研究的深入，特别是对大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理的了解，能对
35、其疾病防御提供重要的理论基础，且为将来各类免疫增强剂的筛选以提高大黄鱼自身免疫抗病力奠定基础，这对水产养殖业的健康可持续发展和保障水产品质量安全都有重要的意义。参考文献1陈昌福,罗宇良,蔡冰,等饲养水温对草鱼溶菌酶活性的影响J中国水产科学,1996,3326282简纪常,吴灶和大黄鱼库道虫病的初步研究J湛江海洋大学学报,2003,23129343简纪常,叶剑敏,吴灶和溶藻弧菌脂多糖对石斑鱼免疫功能的影响J水生生物学报,2004,281103105104金珊,王国良,赵青松,等海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的流行病学研究J水产科学,2005,24117195李国荣,张士璀,李红岩,等酚氧化酶研究概况特
36、性、功能、分布和在胚胎发育中的变化J海洋科学,2003,274486刘青,赵恒寿鱼类常用免疫指标及其检测技术J渔业现代化,2007,34328307苏永全,张彩兰,王军,等,大黄鱼养殖M北京海洋出版社,20041108孙峰,张煜,李立德,等感染嗜水气单胞菌对鲫鱼非特异性免疫功能的影响J中国海洋大学学报,2005,3558158189孙建和,严亚贤,陈怀青,等鲫鱼的细胞免疫应答研究J上海农学院学报,1998,162899110王国良,祝璟琳,金珊养殖大黄鱼3种致病弧菌的分子鉴定及其系统发育分析J海洋与湖沼,2008,39216216711王宏田,徐永立,张培军,等假雄牙鲆不同组织中溶菌酶比活性的
37、研究J海洋科学,2000,24107812王军,鄢庆枇,苏永全,等免疫添加物对大黄鱼血液白细胞数量及其吞噬功能的影响J海洋科学,2001,259444613吴志鹏,王三英三联疫苗对大黄鱼常见细菌性疾病免疫保护的实验研究J厦门大学学报自然科学版,2004,43111511814肖克宇,邓时铭,向建国,等水产动物免疫与应用M北京科学出版社,200713919015薛飞,刘涛,周维仁,等绿原酸对异育银鲫血液非特异性免疫因子的影响J江西农业科学,2007,214815116鄢庆枇,苏永全,王军,等口服免疫添加剂对养殖大黄鱼免疫机能影响的初步研究J集美大学学报自然科学版,2001,6313413717杨
38、文川,李立伟,石磊,等福建海水养殖鱼类寄生贝尼登虫病原学研究J台湾海峡,2001,20220520918杨文鸽,黄晓春,李花霞,等葡聚糖与其羧甲基衍生物对养殖大黄鱼非特异免疫作用J浙江农业学报,2006,181162019张辉,张海莲碱性磷酸酶在水产动物中的作用J河北渔业,20035121320郑天伦,王国良,黄家庆,等养殖大黄鱼溃疡病的病原菌及其防治药物J浙江大学学报理学版,2006,33557357721郑天伦,王国良,金珊网箱养殖大黄鱼弧菌病的中草药防治J水产科学,2005,242242522CHENXH,LINKB,WANGXWOUTBREAKSOFANIRIDOVIUSDISEASE
39、INMARICULTUREDLARGEYELLOWCROAKER,PSEUDOSCIAENACROCEA（RICHARDSON）,INCHINAJJFISHDIS,2003,2661561923CHRISTOPHERJBAYNE,LENAGERWICKTHEACUTEPHASERESPONSEANDINNATEIMMUNITYOFFISHJDEVELOPMENTALANDCOMPARATIVEIMMUNOLOGY,2001,2572574324ZEGERSN,KLUTERE,VANDERSTAPE,ETALEXPRESSIONOFTHEPROTECTIVEANTIGENOFBACILLUSANTHRACISBYLACTOBACILLUSCASEITOWARDSTHEDEVELOPMENTOFANORALVACCINEAGAINSTANTHRAXJMICROBIOL,1999,87309314
