1、毕业论文文献综述水产养殖鱼类弧菌病检测研究进展摘要养殖鱼弧菌病发病率高、发病范围广，流行时间为610月，78月为高峰期,一般死亡率为3040，最高可达80以上，已成为制约养殖鱼健康发展的主要瓶颈之一。就国内外研究发展动向,综述了养殖鱼弧菌病的主要检测技术包括传统的检测技术、免疫学技术、分子生物学检测技术等并详细阐明了各个技术的原理、特点及应用。关键词鱼；弧菌病；检测我国是养殖海水鱼大国，养殖海水鱼主要分布在我国黄海南部、东海、台湾海峡以及南海。浙江省网箱养殖海水鱼品种众多。随着鱼类养殖规模的不断扩大,由于养殖密度过高，养殖区域水质恶化严重，以及鱼类经过多代人工繁殖造成性状退化，导致机体抵抗力下
2、降等原因,病害频繁发生且日趋严重。近年流行的病害主要是细菌性疾病弧菌病、肠炎病、烂鳃病等、寄生虫病纤毛虫、指环虫等、水霉病等。其中由弧菌属细菌引起的疾病，危害最为严重，每年都给养殖从业者造成了极大的经济损失。弧菌属的多种弧菌均能引起养殖鱼类弧菌病，症状表现为多种多样溃疡、烂尾、腹水、烂眼等，其中溃疡和烂尾是最常见的症状14。这是一种病程短、范围广、死亡率高的疾病，流行时间为610月，78月为高峰期，一般死亡率为3040，最高可达80以上。在典型的发病网箱内，从出现少量病鱼到大部分发病死亡历时约7D。致病菌的准确快速鉴定是鱼病防治的基础，如何快速准确检测养殖鱼类弧菌病，已成为当前鱼类养殖业十分重
3、要而突出的问题。1鱼类弧菌病病原种类鱼类弧菌病的病原为溶藻弧菌VIBRIOALGINOLYTICUS和哈氏弧菌VIBRIOHARVEYI。另具毛芝娟5、李清禄6等报道，副溶血弧菌VPARAHAEMOLYTICUS，鳗弧菌VPARAHAEMOLYTICUS等均可引起鱼类弧菌病。11鱼类溶藻弧菌病111培养特性溶藻弧菌为嗜温菌，适宜生长温度为1735，溶藻弧菌通常在水温5以上时才可从海水中分离到，溶藻弧菌是亚热带，热带暖水海区最为常见的条件致病菌，其致病性与鱼体健康状况及水环境的理化条件有关。112在鱼类上症状反应目前，鱼类弧菌病病原主要为溶藻弧菌。溶藻弧菌对温度，盐度及酸碱度的适应范围很广。当溶
4、藻弧菌有较强活力时对宿主有较强粘附作用，所以这可能是溶藻弧菌对鱼类致病多发生在水温较高的春夏季的原因之一。鳗弧菌及其胞外产物均有较强毒性，其外毒素中蛋白酶，磷脂酶，溶血素等有很强毒性，对鱼类有很强致病和致死性。可推测，大量溶藻弧菌及其胞外产物是鱼类夏季弧菌病主要病因。溶藻弧菌主要以特异性结合方式粘附于宿主表面，还可借助钙等二价阳离子进行粘附；鱼类有可能通过改变粘液某些理化性质抑制病原性溶藻弧菌的粘附，从而有利于保护自身免受病原菌的侵害。12鱼类哈氏弧菌病121培养特性哈维氏弧菌YHARVEYI为短杆状革兰氏阴性条件致病，已逐渐成为水产动物，包括无脊椎动物如虾和脊椎动物如鱼养殖的一大杀手，给我国
5、尖吻鲈BLOCH、鲈鱼LATEOLABRAXJAPONICUS、花鲈LATEOLABRAXMACULATUS、斜带石斑鱼EPINEPHELUSCOIOIDES、高体蛳SERIOLADUMERILI等海水鱼类带来严重的损失122在鱼类上症状反应哈维氏弧菌的感染不仅损伤患病鱼类的皮肤，造成病鱼外观异样影响其商品价值，造成经济损失，而且还严重损伤其内脏及免疫器官，造成鱼体自身生理代谢紊乱，免疫力和抗病力下降很明显重要脏腑受损，内脏器官功能衰竭是造成感染哈维氏弧菌鱼类病鱼出现死亡的主要原因之一但不论从显微结构还是超微结构来看，患病鱼类鳃组织的病变不明显，也未观察到哈维氏弧菌，鳃是否为哈维氏弧菌侵袭的主
6、要器官，这还有待于进一步研究论证13鱼类副溶血弧菌病131培养特性副溶血性弧菌又称嗜盐菌,VIBRIOPARAHAEMOLYTICUS是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌。本菌嗜盐畏酸，在无盐培养基上，不能生长，36食盐水繁殖迅速，每89分钟为1周期，低于05或高于8盐水中停止生长。在食醋中13分钟即死亡，加热56510MIN灭活，在1盐酸中5分钟死亡。2鱼类病原检测方法21传统方法检测与诊断传统方法检测包括直接培养、生理生化方法、组织切片观察法和超薄切片电镜观察法,是目前养殖鱼类弧菌病诊断的主要方法。金珊4等对浙江省12个鱼类养殖区所发生的弧菌病进行病原菌的分离，从病鱼的肝、肾、脾、血液等组织
7、共获得30多株细菌。经过形态学观察、培养特征、生理生化特性试验和人工感染试验等研究，但从传统的直接培养、生理生化方法、组织切片观察法以及电镜形态观察检测,都是从所表现的性状来判断的，从某种意义来讲,不具有充分的说服力，并且花费时间长，而鱼类弧菌病病程短，从少量发病到大部分发病死亡只有7D，可能会延误了病情的诊断和治疗。22免疫学检测技术免疫学技术是利用特异性抗原抗体反应,观察和研究组织细胞特定抗原或抗体的定位和定量技术。具有高特异性、高灵敏性等特点，该技术将抗原、抗体的免疫反应相结合,缩短了病原菌的检测时间,提高了诊断的准确性，是目前养殖鱼类弧菌病早期检测技术中研究较为广泛、深入的检测技术。2
8、21免疫荧光技术荧光抗体技术是根据抗原抗体反应具有高度的特异性，以荧光素作为标记物，与已知的抗体结合不影响其免疫特性作为标准试剂，用于鉴定未知的抗原，可在荧光显微镜下检查呈现荧光的特异性抗原抗体复合物及其存在部位。此项技术是应用免疫反应的特异性与灵敏性，并与显微镜的精确性相结合，成为现代免疫学研究中的标记免疫检测方法之一。王军7、鄢庆枇8等分别建立了检测鱼类溶藻弧菌,副溶血弧菌的间接荧光抗体快速检测技术。免疫荧光技术不仅能快速检测患病动物的病原，检测的时间一般不超过3H，为疾病的及时对症治疗赢得了宝贵的时间，而且该方法还能够检测到带菌状态或未发病的被感染个体。姚斐9等报道了利用间接免疫荧光技术
9、还可检出处于活的非可培养状态的细菌，由于活的非可培养状态的细菌仍具有毒性，并可在一定条件下复苏造成疾病的暴发流行，因此加强活的非可培养状态病原菌的检测在鱼类弧菌病的预测预报上是很有意义的。但免疫荧光技术的缺点是非特异性染色问题难以完全解决；操作程序较繁琐需要特殊的昂贵仪器荧光显微镜；染色标本不能长期保存等。222免疫酶技术免疫酶技术也是免疫学诊断的一条新途径,与免疫荧光技术相比，它只需普通光学显微镜即可进行观察。它利用了抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，通过肉眼或显微镜观察及分光光度计测定,达到在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的位置,以及对其进行定量的目的。该方法具有高效、经济
10、、方便等特点。按是否将抗原或抗体结合到固相载体上,免疫酶技术可分为固相、均相和双抗体酶免疫测定技术。酶联免疫吸附试验ELISA是目前应用最广泛的固相免疫酶测定技术。杨鸢劼10等建立了检测鳗弧菌的间接ELISA技术，其检测的敏感性阈值为1105个/ML。鄢庆枇11、王军12分别改良了间接ELISA法检测鱼类溶藻弧菌和副溶血弧菌，其最低检测极限分别为为97104CFU/ML和50104CFU/ML。酶联免疫吸附试验ELISA不仅可以用于患病鱼类的诊断，也可以用于无病症带菌鱼类的检测,结果可多次重复，稳定，底物显色清晰，不需特殊仪器用肉眼即可观察，快速，并同时可测大量的样品。为了更好地将这种快速、灵
11、敏、准确的检测方法应用于养殖生产实践，必须要在缩短检测时间、提高检测灵敏度和降低检测成本等方而做更深入地研究，如果能将研究成果转化为商品化的检测试剂盒，将会具有良好的应用前景。若再将这些检测鱼类弧菌病的ELISA法进行有机组合，确定相应的检测程序，即可以建立起养殖鱼类弧菌病早期诊断和预防系统，这对指导鱼类弧菌病的防治工作具有重要意义。免疫学方法虽比传统方法在许多方面有了较大进步，也存在不少问题。抗体在体内的形成往往需要一段时间，而且抗体一旦产生,即使病愈后还可能长时间存在,阳性结果还不能做出确诊。酶联免疫吸附实验具备免疫学方法的长处，灵敏度高，但操作麻烦，除了对抗血清要求严格外，还可能存在一定
12、程度的交叉反应，并且其结果受样品浓度影响，易出现假阳性或微阳性。随着现代分子生物学技术的高速发展，聚合酶链式反应和分子杂交等手段为鱼类弧菌病检测提供了新N的研究思路。23分子生物学检测技术231PCR及其衍生技术酶链反应技术PCR是指在引物的作用下,体外酶促反应，迅速扩增DNA片段的一种方法。该技术具有特异性好、对感染早期诊断非常有效、检测速度快且灵敏等优点。国内外关于弧菌的分子检测主要集中在霍乱弧菌，副溶血弧菌的研究上,偏重于医学、食品安全和水域环境方向13,14，但对养殖鱼类弧菌病早期检测具有很强的借鉴意义，是未来鱼类弧菌病检测发展的主流。KIM，LEE等针对副溶血弧菌部分TOXR基因，直
13、接溶血素基因,PR72H片段分别建立了多种特异性PCR检测方法1518。CONEJERO和LPANG针对哈维氏弧菌的部分TOXR基因和溶血素基因分别建立了特异性PCR检测技1921。常规的PCR检测法为单对引物扩增一种病原体DNA，一次只能检测一种病原体或一个基因型别，基因型别和混合感染的检测显得操作烦琐，费时且成本高，而且容易产生漏诊。而养殖鱼类可能致病性弧菌种类多，病症表现多样，难以用一种方法进行确诊。多重PCR技术是将多对引物混合后于一个反应管中同时进行多种病原体扩增,能有效地解决上述问题,一种方法能检出多种致病性弧菌,使得诊断及分型变得简捷。DIPINTOA22根据胶原酶基因设计引物建
14、立的多重PCR技术能同时检测溶藻弧菌和副溶血弧菌。但多重PCR容易产生非特异性条带,对引物特异性要求较高，PCR体系和反应条件需要反复摸索优化。232PCR与分子杂交联用技术国内外构建弧菌的基因文库或部分基因文库的研究工作并不算多，对于一些弧菌的特异性核酸探针的制备尚有较大困难。另外，分子杂交检测灵敏度要比PCR方法低，分子杂交联用法来检测病原可以提高灵敏度。蒋鲁岩23等在PCR技术基础上，合成探针，应用DIG标记试剂盒对特异扩增产物进行标记，标记探针可与副溶血弧菌DNA的TDH基因特异性地杂交，从而建立了副溶血弧菌的斑点杂交检测方法。可以同时处理数百甚至上千份样品,适于大批量标本检测，同时应
15、用非放射性探针，快速简便且对操作者健康无害。副溶血弧菌也是鱼类弧菌病的可能致病菌之一，将之进行改良制成试剂盒也可应用于鱼类弧菌病的检测中。2416SRRNA和热激蛋白基因检测技术16SRRNA为所有生物体生存所必需的基因序列并且也是较保守的序列之一。16SRRNA的序列检测已被成功地建立为一种鉴定微生物种、属、家族种类的标准方法。目前，16SRRNA检测技术在人医及兽医开始得到广泛应用，在水产病害方面也开始运用。但由于16SRRNA的进化速度非常慢，即太保守,无法区分某些种系非常接近的菌种及同一菌种的不同菌株。而热激蛋白HEATSHOCKPROTEIN,HSP是另一类常用于生物进化和分类研究的
16、大分子物质。广泛存在于细菌及真核生物细胞中。其主要功能是作为分子伴侣参与蛋白质肽链折叠和组装。进化速度比16SRRNA快,携带更多的多态信息。我们对养殖鱼类多种致病性弧菌分别进行16SRRNA和HSP分子鉴定，发现HSP60基因更适合用于研究海洋弧菌系统分类鉴定，以HSP60基因构建的系统树在置信度上普遍明显高于16SRRNA基因。这与李宁求24、张伟妮25、KWOK26等的研究结论一致。3总结鱼类细菌病的诊断包括对患病鱼的症状、组织病理、疾病发生的环境条件甚至用药情况的观察分析，最后尚须经过致病菌分离与鉴定过程以达到确诊。对于鱼类弧菌病的检测,最早也是采用这种方法，但由于传统的细菌鉴定进行生
17、理生化特征的试验分析费时长，工作量大，且准确性也不是很高，不利于鱼病的及时医治。养殖鱼类的弧菌病研究大多集中在疾病描述、流行病学、病原鉴定、致病机理、防治方法等方面。而关于鱼类弧菌病的检测研究主要集中在免疫学方法上。免疫学方法不仅可以检测发病鱼，还可以检测潜伏期的带菌个体，是目前国内外关于鱼类弧菌病的早期检测中研究最广泛最成熟的技术，但每次只能检测出一种病原菌，难以用抗血清分辨相关菌群且敏感性较低，并且离应用到基层生产实践还有一定的距离。而养殖鱼类可能致病性弧菌种类多，病症表现多种多样，难以用一种方法进行确诊。分子生物学技术的发展为养殖鱼类弧菌病的检测提供了新的研究思路，尤其是多重PCR技术，
18、可以在基本不增加费用和工作量的前提下，及时检出致病性弧菌，能有效地减少漏诊率，提高检测效率，方便、准确,更适宜于生产实践的普及推广及流行病学调查，是一种较为经济、实用的检测手段。目前关于鱼类弧菌病的研究主要是对该菌的分离鉴定以及该菌的致病性还有一些基本的培养特性，其他方面如免疫学、病理学等方面很少涉及。然而作为重要的海洋致病菌，对其的研究有着极其重要的经济价值和生态价值。本综述就鱼类弧菌病做了简单阐述，希望能对将来的研究有参考价值。参考文献1林克冰,周宸,刘家富,等海水网箱养殖鱼类弧菌病的病原菌J台湾海峡,1999,1233423452王军,苏永全,张朝霞,等闽南地区养殖鱼类细菌性疾病的病原生
19、物学研究J厦门大学学报自然科学版,2001,40185913金珊,蔡完其,王国良,等养殖鱼类细菌性疾病的病原研究J浙江海洋学院学报自然科学版,2002,2132252304金珊,王国良海水网箱养殖鱼类弧菌病的流行病学研究J水产科学,2005,24117195毛芝娟,刘国勇,陈昌福鱼类溃疡病致病菌的初步分离与鉴定J安徽农业大学学报,2002,2921781816李清禄,陈强海水网箱养殖鱼类细菌性病原鉴定与感染治疗研究J应用与环境生物学报,2001,754894937王军,鄢庆枇,苏永全,等溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测J海洋科学,2002,267148鄢庆枇,苏永全,王军,等鱼类弧菌病的荧光抗体
20、快速诊断研究J集美人学学报自然科学版,2001,642912959姚斐,寇运同,陈刚,等间接免疫荧光抗体检测活的非可培养状态的副溶血弧菌J海洋科学,2000,249101210杨鸢劼,陈辉酶联免疫吸附法快速检测鳗弧菌J上海交通大学学报农业科学版,2005,231697611鄢庆枇,方恩华,鱼类溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测J台湾海峡,2004,231566112王军,鄢庆枇,苏永全,等养殖鱼类副溶血弧菌的酶联免疫吸附法研究J台湾海峡,2001,20334635013RIVERAING,LIPPEK,GILAI,ETALMETHODOFDNAEXTRACTIONANDAPPLICATIONO
21、FMULTIPLEXPOLYMERASECHAINREACTIONTODETECTTOXIGENICVIBRIOCHOLERAEO1ANDO139FROMAQUATICECOSYSTEMSJENVIRONMICROBIOL,2003,5759960614DONOVANTJANDVANNETTENPCULTUREMEDIAFORTHEISOLATIONANDENUMERATIONOFPATHOGENICVIBRIOSPECIESINFOODSANDENVIRONMENTALSAMPLESJINTJFOODMICROBIOL,1995,261779115KIMYB,OKUDAJ,MATSUMOTO
22、C,ETALIDENTIFICATIONOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSSTRAINSATTHESPECIESLEVELBYPCRTARGETEDTOTHETOXRGENEJJCLINMICROBIOL,1999,3741173117716LEECY,PANSF,LEEYS,ETALDETECTIONANDIDENTIFICATIONOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINFAECALSAMPLESOFOUTBREAKPATIENTSBYINVITROAMPLIFICATIONOFTHERMOSTABLEDIRECTHAEMOLYSINGENEFRAGMENTJJC
23、HINAGRICCHEMSOC,1994,32510311217LEECY,PANSF,CHENCHSEQUENCEOFACLONEDPR72HFRAGMENTANDITSUSEFORDETECTIONOFVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINSHELLFISHWITHTHEPCRJAPPLENVIRONMICROB,1995,6141311131718TADAJ,OHASHT,NISHIMURAN,ETALCOMPARISONOFMOLECULARMETHODSFORTYPINGVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSJJCLINMICROBIOL,1999,378247324
24、7819CONEJEROMJUANDHEDRVDACTISOLATIONOFPARTIALTOXRGENEOFVIBRIOHARVEYIANDDESIGNOFTOXRTARGETEDPCRPRIMERSFORSPECIESDETECTIONJJAPPLMICROBIOL,2003,95360261120CONEJEROMJUANDHEDRVDACTPCRDETECTIONOFHEMOLYSINVHHGENEINVIBRIOHARVEYIJJGENAPPLMICROBIOL,2004,50313714221PANGL,ZHANGXH,ZHONGY,ETALAUSTINIDENTIFICATION
25、OFVIBRIOHARVEYIUSINGPCRAMPLIFICATIONOFTHETOXRGENEJTHESOCIETYFORAPPLIEDMICROBIOLOGY,LETTERSINAPPLIEDMICROBIOLOGY,2006,43324925522DIPINTOA,CICCARESEG,FONTANAROSAM,ETALDETECTIONOFVIBRIOALGINOLYTICUSANDVIBRIOPARAHAEMOLYTICUSINSHELLFISHSAMPLESUSINGCOLLAGENASETARGETEDMULTIPLEXPCRJJOURNALOFFOODSAFETY,2006,
26、26215015923蒋鲁岩,陈光哲,祝长青,等应用地高辛标记的寡聚核酸探针检测副溶血弧菌J检验检疫科学,2002,124111224李宁求,白俊杰,吴淑勤,等斜带石斑鱼3种致病弧菌的分子生物学鉴定J水产学报,2005,29335636125张伟妮,周丽,邢婧,等养殖大菱虾腹水症病原菌SR1的分离及鉴定J中国水产科学,2006,13460360926KWOKAY,WILSONJT,COULTHARTM,ETALPHYLOGENETICSTUDYANDIDENTIFICATIONOFHUMANPATHOGENICVIBRIOSPECIESBASEDONPARTIALHSP60GENESEQUENCESJCANJMICROBIOL,2002,4810903910
