1、本科毕业设计（20_届）海洋细菌THALASSOBACTERSTEMOTROPHICU纤维素酶的产酶特性研究所在学院专业班级生物工程学生姓名学号指导教师职称完成日期年月23目录中英文摘要1引言111纤维素酶的分类112纤维素酶在实际工作生产中的应用1121纤维素酶在酿酒工业上的应用1122纤维素酶在醋酸发酵生产上的应用1123纤维素酶在养殖业中的应用1124纤维素酶在纺织上的应用2125纤维素酶在酱油酿造业上的应用213纤维素酶的发展前景22实验材料方法及准备工作321实验场所322实验材料和方法323培养基的配制324实验用到的主要仪器325实验菌种的来源3251菌株的筛选326实验准备32
2、61羧甲基纤维素钠CMCNA的溶解32623，5二硝基水杨酸（DNS）试剂的配制33测定葡萄糖标准梯度曲线431酶活的定义432实验操作4321葡萄糖标准溶液的配制（2ML/L）44测定菌株的生长曲线和酶活基础曲线541实验操作5411接种及制备菌种液5412粗酶液的制备5413测定酶活的基础曲线5414酶活性的测定5415结果及数据处理5416测定菌株的生物量标准曲线6417结果及数据处理75研究不同条件对产酶的影响851研究PH对该菌株产纤维素酶的影响8511实验操作8521实验结果,852研究培养基发酵温度对细菌产纤维素酶的影响9521实验操作9522实验结果953研究NACL浓度对该菌
3、株的影响10531实验操作104521实验结果1154研究摇床转速对该菌株产酶的影响11541实验操作11542实验结果126结果和讨论13致谢13参考文献155【摘要】纤维素作为地球上分布广，含量丰富的碳水化合物，它的降解是自然界碳素循环的中心环节。纤维素的利用和转化对于解决目前世界能源危机，粮食短缺、环境污染等问题具有十分重要的意义。在宁波大学菌种库里筛选出透明圈和菌种直径比值大的产酶表现比较好的菌株E9，采用2216E液体培养基，在600NM处测定其吸光度测定其生长曲线，再利用3,5二硝基水杨酸（DNS）和CMC（羧甲基纤维素钠）试剂测出其酶活曲线，得出菌株的最佳的生长时期和产酶的最佳时
4、期，通过实验得知在温度25是该菌株产酶的最佳条件，PH为75是该菌株产酶的最佳条件，摇床摇速为100R/MIN是该菌株产酶的最佳条件，培养基NACL含量为3时是该菌株产酶的最佳条件，为研究其最佳的反映条件，优化生产提供基础资料。【关键词】酶活性；发酵温度；培养基初始PH；摇床摇速；培养基德含NACL的量；【ABSTRACT】THEDEGRADATIONOFCELLULOSEPLAYAIMPORTANTROLEONTHECARBONCYCLEINNATURE,WHICHISWIDELYDISTRIBUTEDONEARTHTHEUTILIZATIONANDCONVERSIONOFCELLULOSE
5、ISVERYIMPORTANTTORESOLVETHEENERGYCRISIS,FOODSHORTAGEANDENVIRONMENTALPOLLUTIONWEHADOBTAINED9STRIANSHAVEHIGHACTIVITYTODECOMPOSECELLULOSEWESECLECTONESTRAINS,NAMEDE9,FORRESEACHINGONPROPERTIESOFPRODUCINGCELLULASETHERESULTSSHOWED,UNDERTHE25,PH75,100R/MINAND3NACL,RESPECTIVELY,THEABILTYOFPRODUCINGCELLULASEI
6、SHIGHER【KEYWORDS】ENZYMEACTIVITYFERMENTATIONTEMPERATUREMEDIUMINITIALPHSHAKERSHAKINGSPEEDTHEAMOUNTOFNACLCONTAININGMEDIUM61引言纤维素是自然界里含量最多，种类最复杂的多聚糖类物质，是高等植物细胞的细胞壁的主要的组成成分1。地球上的植物每年光合作用可以合成出大于100亿吨的植物干物质，约占地球植物干重的13，该物质含有很多高能氢键，难以水解，很难被人类和大多数动物直接利用。纤维素酶是能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，隶属与糖苷水解酶系。纤维素酶在药物用品、化工、食品工程、
7、废水处理、工业洗涤、中草药提取和畜牧饲料等领域都有很好的应用前景。以往的科学研究纤维素分解菌的研究多集中在真菌，而对细菌的研究很少见诸报道2。产纤维素酶的细菌一般最适PH值为中性至偏碱性，另外，细菌主要产中性和碱性纤维素酶，在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中具有特殊应用价值。我国作为一个纺织大国，每年在纺织业中需消耗纤维素酶5万余T，而目前中性纤维酶主要靠进口，大大提高了生产成本。因此筛选具有高活性纤维素酶的菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。近20年来，随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用，细菌纤维素酶制剂已显示出良好的应用前景3。11纤维素酶的分类
8、纤维素酶的组成比较复杂,通常所说的碱性纤维素酶是具有310种或更多组分构成的多组分酶。根据其作用方式一般又可将纤维素酶分为3类外切1,4葡聚糖苷酶简称CBH、内切1,4葡聚糖苷酶简称EG和1,4葡萄糖苷酶简称BG4。在这3种酶的协同作用下,纤维素最终被分解成葡萄糖。到目前为止,还没有能够在碱性条件下分解天然纤维素的纤维素酶。碱性纤维素酶是一种单组分或多组分的酶,只具有内切1,4葡聚糖苷酶又称CMC酶的活性,有的还与中性CMC酶组分共存5。12纤维素酶在实际工作生产中的应用121纤维素酶在酿酒工业上的应用在进行酒精发酵时添加纤维素酶可显著提高酒精和白酒的出酒率及原料的利用率,降低溶液的黏度,缩短
9、发酵时间,而且酒的口感醇香,杂醇油含量低。纤维素酶提高出酒率的原因可能有两方面一是原料中部分纤维素分解成葡萄糖供酵母使用另外,由于纤维素酶对植物细胞壁的分解,有利于淀粉的释放和被利用。将纤维素酶应用于啤酒工业的麦芽生产中可增加麦粒溶解性,加快发芽,减少糖化液中单一葡萄糖含量,改进过滤性能,有利于酒精蒸馏。用纤维素酶预处理啤酒糟,可提高啤酒糟蛋白酶解率10以上纤维素酶在清香型优质白酒中的应用,出酒率可提高13,而且不影响酒的感官品质在日本清酒生产中,浸米时加入00201的纤维素酶浸泡17H,米的溶解性好,糖化发酵顺利,酒渣少,出酒率高6。122纤维素酶在醋酸发酵生产上的应用醋酸发酵生产工艺对纤维
10、素酶在食醋酿造方面的应用进行了系统研究,结果表明纤维素酶添加量为1050UMOL/MIN,产酒精量比CK提高75238,食醋产量提高025136KG,主料出品率提高512728。123纤维素酶在养殖业中的应用在瘤胃微生物区系结构正常的情况下,添加纤维素酶能以几倍的效率提高粗纤维和其他7营养物质的酵解强度,提高消化吸收水平。在瘤胃发生病理变化即微生物区系失去平衡进入腐解过程时,高活性纤维素酶能迅速调整微生物区系结构,恢复平衡关系和正常酵解、吸收、合成过程。有试验表明在瘤胃正常状态下,添加纤维素酶饲喂奶牛5昼夜以后,其粪便干物质和饲喂前相比,减少了30左右1周以后,封闭牛舍氨气含量下降70左右,粗
11、饲料采食量提高1020,粪便中蛋白质提高810,尿中尿素下降589赵长友,19939。有试验表明,在奶牛饲料中添加纤维素酶可在降低采食量的同时,提高增重和产奶量,提高饲料报酬,而在产奶量增加的同时对乳脂率没有明显影响。纤维素酶在降低采食量的同时提高产奶量的主要原因是反刍动物的摄食量主要受血液内的挥发性脂肪酸VFA浓度的调节。挥发性脂肪酸是纤维素的分解产物,外源性纤维素酶增加了瘤胃中挥发性脂肪酸的生成量,而瘤胃对挥发性脂肪酸的吸收较快,大量的挥发性脂肪酸进入血液,并随其浓度的升高反馈性作用于食物调节中枢,导致采食量下降。一般认为奶牛的产奶量和乳脂率呈负相关,而试验表明在奶牛日粮中添加纤维素酶后,
12、随着产奶量的上升乳脂率呈上升趋势。这说明纤维素酶通过提高奶牛血液中的各种营养物质的含量,增强乳腺细胞对各种营养物质的摄取能力,从而维持乳中的各种营养物质的含量始终处于平衡状态10。124纤维素酶在纺织上的应用纤维素酶在染整上广泛应用,特别在棉织物整理上,经过纤维素酶整理后,棉织物的手感和外观获得很大的改善。由于织物表面的绒毛被除去,处理后织物更光洁,颜色更鲜艳。根据处理的目的不同,可进行生化抛光、柔软滑爽、改善光泽以及石磨水洗等加工11。纤维素纤维织物用纤维素酶处理都伴随着纤维的减量或失重,并引起许多性能变化。减量处理主要是改善织物的柔软度、弹性和悬垂性。减量加工大多数采用液体染色机和水洗机。
13、棉织物经过纤维素酶整理后,手感和外观可以有很大的改善。因为织物表面的绒毛被去除,处理后的织物更光洁、颜色更鲜艳。织物的硬挺度和刚性降低,光滑度和悬垂性提高,使织物获得更好的手感。因此在保证处理效果的同时,避免织物强力过度损失就显得非常重要12。125纤维素酶在酱油酿造业上的应用在酱油的酿造过程中添加纤维素酶,可使大豆类原料的细胞膜膨胀软化破坏,使包藏在细胞中的蛋白质和碳水化合物释放,这样既可提高酱油浓度,改善酱油质量,又可缩短生产周期,提高生产率,并且使其各项主要指标均提高3。采用固体制曲、固态酒精发酵和固态13。纤维素酶实际应用中存在的问题纤维素酶作为畜禽饲料添加剂,从作用机理和实际生产中看
14、,均能说明是个良好的添加剂。但目前在应用方面还存在一些问题。如同种类动物不同发育阶段的酶系变化,以及饲喂纤维素复合酶后对动物消化酶系分泌的影响,需深入研究。2各种动物的最佳添加量。3加工、贮存对酶活的影响,以及饲料中的其他物质对纤维素酶的影响,都需深入研究。此外,添加纤维素酶后由于营养物质的利用率提高,如何对原有配方进行修订也是值得研究的问题14。13纤维素酶的发展前景据统计,1995年,世界工业酶的销售量大于10亿美元预计到2005年,销量将达到1720亿美元,而1999年实际达到16亿美元16。工业酶总供应量的60来自于欧洲,其8余40来自于美国和日本,而且大约75的工业酶是水解酶,其中糖
15、苷水解酶居第二位15。目前纤维素酶的应用还主要集中在微生物纤维素酶的应用上。现在纤维素酶已被广泛地应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多个领域中。随着人们对纤维素酶研究工作的深入,纤维素酶必将在食品、饲料、环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用17。如何加大对纤维素酶研究和开发的科技投入和经费投入,改变目前规模小、工艺设备落后、菌种酶活低、生产成本高、生产技术水平低下的现状,尽快采用各种行之有效的高新技术,发展具有中国自己知识产权的新酶种、新产品、新剂型,满足市场的需求是当务之急。同时,动物纤维素酶与微生物酶系有所不同,作为一个新的纤维素酶体系,它的研究也具有重大的理
16、论价值,因此,可能成为纤维素酶研究的热点18。2实验材料方法及准备工作21实验场所宁波大学曹光彪科技楼5楼22实验材料和方法MGSO47H2O，氯化钠，氯化钙，碳酸氢钠，氯化钾，溴化钾，硼酸，磷酸高铁，琼脂，刚果红染色剂，羧甲基纤维素钠CMCNA，酒石酸钾钠，3，5二硝基水杨酸，氢氧化钠，重蒸酚，无水亚硫酸钠，蛋白胨，酵母浸出液。23培养基的配制2216E培养基蛋白胨5G，酵母膏1G，磷酸高铁001G，琼脂18G，人工海水（每1L人工海水含MGSO47H2O6658G，NACL26726G，CACL21153G，NAHCO30198G，KCL0721G，KBR0067G，H3BO30058G）
17、1L,琼脂18G，PH值7678。（不使用天然海水是因为拿到手的天然海水是近海海水，富营养化污染太严重，为了实验数据的可靠性，所以用人工海水）24实验用到的主要仪器离心机，紫外可见光分光度计，高压蒸汽灭菌窝，控温摇床，超净工作台，恒温培养箱，4度冰箱25实验菌种的来源251菌株的筛选由前期的筛选筛选出的产酶状况相对不错的菌株THALASSOBACTERSTEMOTROPHICU作为实验对象。26实验准备261羧甲基纤维素钠CMCNA的溶解羧甲基纤维素钠CMCNA在海水中很难溶解并且在溶解过程中不能一起倒入，否则会造成结块至不溶，在加入的时候要轻轻拨入，均匀的撒在人工海水液体表面，若是加入速度9
18、过快在人工海水表面形成少量的白色结块可用滴管吸取少量人工海水滴在其上，溶入后静置一天，让羧甲基纤维素钠CMCNA和人工海水形成相对均匀的粘稠性溶液。注意事项（1）溶解、盛放CMC的器具不能用金属容器，可用不锈钢容器或木盆，陶瓷或者塑料器皿盛放，防止二价金属离子渗入。（2）每次使用CMC后，应及时盖上瓶盖，防止CMC吸潮变质。2623，5二硝基水杨酸（DNS）试剂的配制称取酒石酸钾钠1820G，溶于500ML蒸馏水中，水浴加热（切不可超过50），于热溶液中依次加入3，5二硝基水杨酸（DNS）63G，NAOH210G，重蒸酚50G，无水亚硫酸钠50G，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000M
19、L，储存于棕色瓶中避光4冰箱保存，放置一周后使用，使用前用烧结玻璃过滤（有效期6个月）。注意事项3，5二硝基水杨酸（DNS）和NAOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NAOH。否则会产生难溶性的沉淀，且配制过程中，溶液的加热温度不宜超过50。3测定葡萄糖标准梯度曲线31酶活的定义将上面的操作后每分钟产生1UG葡萄糖所需要的酶量定义为一个酶活单位，制备葡萄糖梯度液。并将各个时段的酶活力和最高酶活力的比值作为以下曲线的坐标Y轴。32实验操作3,5二硝基水杨酸在强碱溶液中与还原糖在沸水中加热反应后被还原成棕红色的氨基化合物，该有色物质在540NM处有最大的吸光度，且在一定浓度范围内（0208范围内
20、线性较好），还原糖的量与反应液的颜色强度（吸光度OD值）呈线性关系，利用分光光度仪，以分析纯葡萄糖为还原糖测定的标准品，在540NM处按梯度依次测定各葡萄糖浓度对应的反应液的吸光度（OD值）大小，通过电脑处理数据，定制葡萄糖标准曲线，确定3,5二硝基水杨酸比色定糖法测定还原糖的回归方程。321葡萄糖标准溶液的配制（2ML/L）准确称取2000MG分析纯的葡萄糖（预先在105干燥至恒重），用少量蒸馏水溶液后定容至1000ML冰箱保存备用。实验测定及线性方程按表1进行实验操作，在50水浴中准确反应30MIN，然后在沸水浴中反应5MIN，操作完毕后流水冷却，加蒸馏水定容至25ML，摇匀，用1CM的比
21、色皿于540NM处测光密度值，并记录A540NM处测的各浓度及样品对应的OD值10表13,5二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线的实验加样操作记录表试管编号0123456782000UG/ML葡糖糖标准溶液（ML）00204060811214163,5二硝基水杨酸（ML）222222222蒸馏水2181614121080604用线性回归方法算出线性回归的数据算出线性回归数据，得出线性方程Y000463X01444，制出下列曲线0010203040506070163248648096112128标准葡萄糖溶液显色浓度A540NM处对应的吸光度（OD值）3,5二硝基水杨酸法测定葡萄糖表准曲线图13,5
22、二硝基水杨酸的葡糖糖标准曲线4测定菌株的生长曲线和酶活基础曲线41实验操作411接种及制备菌种液在超净工作台里接种选定菌种至2216E液体培养基2大概7或者8环（接种太少结果不明显），和空白不加菌种的2216E液体培养基放在100R/MIN摇床上置入28恒温培养箱。412粗酶液的制备取培养基2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液。413测定酶活的基础曲线11将接种的发酵培养基在28，100R/MIN培养条件下发酵培养，分别测定发酵了0，4,8,12,24,28,32,36H的酶活力。414酶活性的测定用PH9的甘氨酸NAOH缓冲液配制5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液。取0
23、5ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5MIN，取出后流水冷却至室温，于540NM测定还原糖的量，空白组一样操作。415结果及数据处理将刚配制好的培养液摇匀，取培养基2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液，用PH9的甘氨酸NAOH缓冲液配制5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5分钟，取出后流水冷却至室温，于540NM测定还原糖的量，空白组一
24、样操作。然后用移液枪吸取200UML放入点板，并且取平行3次，在空白组里也取200UML放入点板，用推入分光光度测量仪器，在540NM处测定他们的吸光度。刚放进恒温培养箱的时候时间指数记为0，测得的结果空白组为0007，3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3，结果分别为0005，0004,0006,；当时间指数为4的时候测定它们在540NM处的吸光度，操作和第一次一样，后面的操作和第一次一样，测得空白组结果为0004,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3，结果分别为0103，0137,0170；当时间指数为8的时候测定它们在540NM处的吸光度，测得空白组结果为0006,3个平行组记
25、为培养组1，培养组2，培养组3，结果分别为0297，0323,0325；当时间指数为12的时候测定它们在540NM处的吸光度，测得空白组结果为0004,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3，结果分别为0584，0574,0559；因为我从早上8点开始测，测到12个小时的时候已经晚8点了，半夜实验室是不开门的，所以当时间指数为24的时候测定它们在540NM处的吸光度，测得空白组结果为0008，3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3，结果分别为0573，0559,0547；当时间指数为28的时候它们在540NM处的吸光度，一样，测得空白组结果为0006,3个平行组记为培养组1，培养组2，
26、培养组3，结果分别为0551，0535,0547；当时间指数为32的时候测定它们在540NM处的吸光度，测得空白组结果为0007,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3，结果分别为0531，0535,0546；当时间指数为36的时候测定它们在540NM处的吸光度，测得空白组结果为0009,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3，结果分别为0413，0450,0430；将吸光值转化为酶活力单位U作为纵坐标，时间为横坐标绘制曲线。如图2120002004006008010120140481224283236时间（H）酶活力（U酶活力图2酶活力的基础曲线中间12H24H的跨度太大，可能是造成
27、了曲线不是很圆滑在起初的8H，酶活力比较低，此时有可能是因为培养基中有足够的营养物质，菌体生长快而产酶少，当培养到12H时酶活力最大，随后营养物质被消耗完，以及次级代谢产物的分泌和菌体的裂解，酶活力下降416测定菌株的生物量标准曲线每隔4个小时测定一次生物量。在超净工作台里用移液枪取菌种液200UML的3管，空白2216E液体培养基1管，1ML的菌种液一管和空白2216E液体培养基2ML一管，在取之前切记都要均摇，使菌种液尽量保持均一。取空白2216E液体培养基200UML的一管和菌种液200UML的三管放入点板推入分光光度计测定他们在600NM的分光度，记录数据，绘制标准曲线图。417结果及
28、数据处理每隔4个小时测定一次生物量。在超净工作台里用移液枪取菌种液200UML的3管，空白2216E液体培养基1管，1ML的菌种液一管和空白2216E液体培养基2UML一管，在取之前切记都要均摇，使菌种液尽量保持均一。取空白2216E液体培养基200UML的一管和菌种液200UML的三管放入点板推入分光光度计测定他们在600NM的分光度，刚配好的时候时间指数记为0，测得的空白组吸光度为0044测得3个平行培养组培养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为0067，0059,0075；过了4个小时，时间指数记为4，操作和第一次一样，后面测定操作都和第一次一样，测得的空白组吸光度为0038，测得3个平
29、行培养组培养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为0349，0302,0296；过了8个小时，时间指数记为8，测得的空白组吸光度为0036，测得3个平行培养组培养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为0887，0876,0809；过了12个小时，时间指数记为12，测得的空白组吸光度为0036，测得3个平行培养组培养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为1836，1936,1907；过了24个小时，时间指数记为24，因为我从早上8点开始测，测到12个小时的时候已经晚8点了，半夜实验室是不开门的，测得的空白组吸光度为0047，测得3个平行培养组培13养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为1808，184
30、3,1840；过了28个小时，时间指数记为28，测得的空白组吸光度为0050，测得3个平行培养组培养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为1545，1545,1526；过了32个小时，时间指数记为32，测得的空白组吸光度为0048，测得3个平行培养组培养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为1160，1198,1172；过了36个小时，时间指数记为36，测得的空白组吸光度为0067，测得3个平行培养组培养组1，培养组2，培养组3吸光度分别为0750，0789,0809绘制曲线，如图300511520481224283236时间（H）吸光值细菌的OD值图3细菌的生长曲线5研究不同条件对产酶的影响。5
31、1研究PH对该菌株产纤维素酶的影响511实验操作对照组纯2216E培养基不加菌种实验组配制2216E液体培养基2000ML。分装到7个200ML的锥形瓶里，标号并且用01MOL/L的NAOH和01MOL/LHCL调这7个锥形瓶的PH为5,55,6,65,7,75,8，每个锥形瓶接种1（5环），都放入28的恒温培养箱，150R/MIN摇速的摇床上培养12个小时。取培养基2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5MIN，取出后流水冷却至室温，
32、于540NM测定，结果如下14512结果及数据处理从PH为5的培养基和空白组各取2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5MIN，取出后流水冷却至室温，这样再操作2次，一共取3个平行，用移液管取200UML放入点板，推入分光仪在540NM处测定，得出结果空白组为0006,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3,测得结果分别为0327,0334,0336；从PH55的培养基和空白组各取出2ML，和上面的操作一样，以下操作和上述一致，得出
33、结果空白组为0005,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3,测得结果分别为0426,0416,0403；从PH6的培养基和空白组各取出2ML，和上面的操作一样，得出结果空白组为0004,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3,测得结果分别为0475,0487,0482；从PH65的培养基和空白组各取出2ML，和上面的操作一样，得出结果空白组为0004,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3,测得结果分别为0511,0511,0528；从PH7的培养基和空白组各取出2ML，和上面的操作一样，得出结果空白组为0005,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3,测得结果分别为0573
34、,0572,0585；从PH75的培养基和空白组各取出2ML，和上面的操作一样，得出结果空白组为0004,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3,测得结果分别为0563,0559,0567；从PH8的培养基和空白组各取出2ML，和上面的操作一样，得出结果空白组为0005,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3,测得结果分别为0436,0428,0439；将吸光值转化为酶活力单位U作为纵坐标，PH为横坐标绘制曲线。如图40002004006008010120145556657758培养基的初始PH值酶活力（U）酶活力平均值图4培养基初始PH对产酶的影响52研究培养基发酵温度对细菌产纤维素
35、酶的影响521实验操作研究发酵温度在15,20，25,304个温度时，温度对其产酶的影响。2216E液体培养基2L，1L培养基接种5环，摇匀分装到4个锥形瓶，每个锥形瓶200ML，并每个温度都设置一个对照组，以最佳时间12H为培养终点。取培养基2ML放入5000转4离心机15中离心10MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5MIN，取出后流水冷却至室温，于540NM测定，测定他们的OD值522结果及数据处理从发酵温度为15的培养基和空白组2ML放入5000转4离心机中离心1
36、0MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5MIN，取出后流水冷却至室温，取200UML放入点板推入分光仪，测定吸光度，这样操作3次取3个平行组，于540NM测得空白组吸光度为0009，测得的3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0357,0339,0344；从发酵温度为20取2ML，和上述操作一样，测得的空白组为0007，测得的3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0424,0447，0443；从发酵温度为25取2ML，和上述操作一样，测得的空白组为00
37、05，测得的3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0555,0545，0567；从发酵温度为30取2ML，和上述操作一样，测得的空白组为0005，测得的3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0526,0507，0539；将吸光值转化为酶活力单位U作为纵坐标，发酵温度为横坐标绘制曲线。如图400020040060080101201415202530发酵温度（）酶活力（U）酶活力曲线图5发酵温度对该菌株产酶的影响由于该菌株来自大海。对一定盐度的依赖是海洋微生物的典型特征，因此推断NACL的浓度对该菌株产酶应该有比较明显的影响53研究NACL的浓度对该菌株的影响531实验方法用含
38、NACL分别为1，2，3，4，5的人工海水分别配制2216E培养基各200ML，接种1（5环），分别放入5只锥形瓶标号，都放在100R/MIN摇速的摇床上，一起放入28恒温培养箱恒温培养12个小时，取培养基2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶16液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5MIN，取出后流水冷却至室温，于540NM测定。532结果及数据处理从含NACL为1的2216E培养基2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液
39、与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5分钟，取出后流水冷却至室温，于540NM测定。从中取200UML推入分光仪测定吸光度，这样操作3次，取3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3测得的吸光度为0375,0369,0372；从含NACL为2的2216E培养基2ML，和上述操作一样，测得的3个平行组培养基1，培养基2，培养基3分别为0509,0510,0539；从含NACL为3的2216E培养基2ML，和上述操作一样，测得的3个平行组培养基1，培养基2，培养基3分别为0582,0585,0581；从含NACL为4的221
40、6E培养基2ML，和上述操作一样，测得的3个平行组培养基1，培养基2，培养基3分别为0526,0525,0521；从含NACL为5的2216E培养基2ML，和上述操作一样，测得的3个平行组培养基1，培养基2，培养基3分别为0327,0328,0321；将吸光值转化为酶活力单位U作为纵坐标，含NACL浓度为横坐标绘制曲线。如图600020040060080101201412345NACL的含量（）酶活力（U）酶活力曲线图6NACL的浓度对该菌株产酶的影响54研究摇床转速对该菌株产酶的影响541实验方法配制2216E培养基1000ML，分装到5个200ML锥形瓶里，每只瓶子接种量为1（5环），调整
41、PH为75，分别放到摇速为75R/MIN，100R/MIN，125R/MIN，150R/MIN，175R/N的摇床上放入28的恒温培养箱培养12个小时，取培养基2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5MIN，取出后流水冷却至室温，于540NM测定。542结果及数据处理17从培养在摇床摇速为75R/MIN的培养基和空白组中取培养基2ML放入5000转4离心机中离心10MIN，取上层清液。取05ML离心好的培养基上清液与2ML的5的羧甲基纤
42、维素钠CMCNA底物溶液在50水浴30MIN，加入3MLDNS试剂，将试管放入沸水中水浴5分钟，取出后流水冷却至室温，于540NM测定。从中取200UML推入分光仪测定结果，这样操作3次，测得的空白组为0005，3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0549,0536,0546；从培养在摇床摇速为100R/MIN的培养基和空白组中取培养基2ML，和上述一样操作，测得的空白组为0004，3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0585,0579,0590；从培养在摇床摇速为125R/MIN的培养基和空白组中取培养基2ML，和上述一样操作，测得的空白组为0004,3个平行组记为培
43、养组1，培养组2，培养组3分别是0537,0529,0535；从培养在摇床摇速为150R/MIN的培养基和空白组中取培养基2ML，和上述一样操作，测得的空白组为0005,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0545,0451,0469；从培养在摇床摇速为175R/MIN的培养基和空白组中取培养基2ML，和上述一样操作，测得的空白组为0005,3个平行组记为培养组1，培养组2，培养组3分别是0379,0374,0389；将吸光值转化为酶活力单位U作为纵坐标，摇床摇速为横坐标绘制曲线。如图700020040060080101201475100125150175摇床摇速（R/MIN）酶活
44、力（U）酶活力曲线图7摇床摇速对该菌株产酶的影响186结果讨论从单因素分析结果来看，该菌株最佳的培养NACL浓度为3，最佳的发酵的温度为25，最佳的培养PH值为70，最佳的摇床摇速为100R/MIN，在发酵过程中，证实了猜想NACL的浓度对其的影响，表现了其属于海洋微生物的独特特征。通过实验得到的发酵最佳条件，优化条件对产酶的产量很大幅度的提高。虽然此试验比较粗浅，但也使我进一步的了解该菌株的产酶特性。参考文献1顿宝庆,吴薇,王旭静,等一株高纤维素酶活力纤维素分解菌的分离与鉴定J中国农业科技导报,2008,1011131172陈合,张强菌酶共降解玉米秸秆的工艺研究J农业工程学报,2008,24
45、32702733韩学易,陈惠,吴琦,等产纤维素酶枯草芽孢杆菌C36的产酶条件研究J四川农业大学学报,2006,2421791814刘爱华,梁运祥产纤维素酶细菌的筛选及在菜粕蛋白改性上的应用J湖北农业科学,2007,4658248275吴敏峰,耿秀蓉,祝小等产纤维素酶芽孢杆菌的分离鉴定J饲料工业,2006,272021243983996洪泂,黄秀梨纤维素酶的应用J生物学通报,1997,1071218194214317李素芬,霍贵成纤维素酶的分子结构组成及功能J中国饲料,1997,171312141161208司笑丁纤维素酶在酒精工业中的探讨J酿酒科技,2004,6161621401459邱雁临纤
46、维素酶的研究和应用前景J粮食与饲料工业,2001,8133031273010尚维,刘群纤维素酶在清香型优质白酒中应用初探J酿酒科技,1996,2132021454711邱雁临纤维素酶对啤酒糟蛋白酶解率的影响J粮油加工与食品机械,2001,95394012杨玉华,刘德海,王子光纤维素酶在食醋酿造中的应用J河南农业大学报,1999,4139839913张智,刘复军纤维素酶在酱油酿造上的应用研究J中国调味品,1997,82151914闫训友,刘志民,史振霞,张惟广纤维素酶在食品工业中的应用进展J食品工业科技,2004,10714014215刘德海,杨玉华,李新杰,等纤维素复合酶对奶牛的应用效果J饲料研究,2000,524293016冯杰,余东游纤维素酶在动物营养上的研究进展J饲料研究,2000,53202217MKBHATRESEARCHREVIEWPAPERCELLULASESANDRELATEDENZYMESINBIOTECHNOLOGYJBIOTECHNOLOGYADVANCES,19944819920218RAMANSONIA,DKSANDHUB,SKSONIC,LOCALISATIONANDOPTIMISATIONOFCELLULASEPRODUCTIONINCHAETOMIUMERRATICUMJJOURNALOFBIOTECHNOLOGY73,1999564351
