1、本科毕业设计（20_届）假微型海链藻DGAT基因CDNA全长序列的分子克隆和分析所在学院专业班级海洋生物资源与环境学生姓名学号指导教师职称完成日期年月I目录1绪论111生物柴油的研究现状1111生物柴油作为替代燃料的优势1112国外制备生物柴油的原料1113国内制备生物柴油的原料1114存在的问题212微藻制备生物柴油的研究现状2121微藻制备生物柴油的优势2122国外微藻制备生物柴油的研究进展2123国内微藻制备生物柴油的研究进展3124存在的问题和今后研究的方向413DGAT研究现状5131DGAT在TAG合成中的作用5132DGAT的分类52材料与方法621材料622方法6221总RNA
2、的提取6222反转录合成CDNA的第一条链62233RACE引物设计72243RACE获得DGAT基因全长CDNA7225测序分析7226DGAT基因CDNA全长的生物信息学分析73结果与讨论831假微型海链藻DGATCDNA克隆832生物信息学分析8321核苷酸序列分析8322推导的氨基酸序列同源性分析104小结12致谢错误未定义书签。参考文献12II摘要高昂的成本限制了微藻生物柴油的产业化，降低生产成本是关键所在。微藻具有光合作用效率高、环境适应能力强、生长周期短和生物产量高等优势，已经成为制备生物柴油的研究热点。DGAT二酰甘油酰基转移酶催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是
3、该途径的限速酶，对它的研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。在本研究中，选取宁波大学藻种库中性脂含量最高的假微型海链藻（THALASSIOSIRAPSEUDONANA）为材料，提取总RNA，利用RACE技术，获得编码RCDGAT的全长CDNA。该CDNA全长1512BP，开放阅读框为1365BP，编码455个氨基酸，为DGAT1。BLASTX搜索结果显示,假微型海链藻DGAT核苷酸序列与已报道的藻类的同源性较高，其中三角褐指藻同源性54为最高，但与已报道的高等植物只具有3741的相似性。对GENBANK同源性搜索获得的其它植物DGAT基因核苷酸序列进行系统进化
4、分析，通过MAG50分析，修建氨基酸序列长度至421个，发现最先与假微型海链藻聚类合并的是三角褐指藻，接着与变种小球藻（作者翻译）聚合，然后和其余的高等植物聚合。关键词假微型海链藻；DGATCDNA全长；RACE；基因克隆ABSTRACTWITHTHERAPIDGROWTHOFGLOBALECONOMY,FOSSILENERGYISDRAININGAWAY,SUCHASOILANDCOALANDCARBONDIOXIDECO2FROMBURNINGOFFOSSILENERGYCAUSESGREENHOUSEEFFECTTHENPEOPLEPAYTHEIRATTENTIONTOLOOKFORRE
5、NEWABLEENERGYBECAUSEOFHIGHPHOTOSYNTHETICEFFICIENCY,ENVIRONMENTALADAPTION,BIOMASSANDSHORTGROWTHCYCLE,MICROALGAEHAVEBECOMETHEFOCUSOFBIODIESELPRODUCTIONBUTHIGHCOSTLIMITSINDUSTRIALIZATIONOFMICROALGAEBIODIESELREDUCINGCOSTISTHEKEYPROBLEMDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEDGATISACRITICALENZYME,ASITCATALYZESTHETE
6、RMINALSTEPINTPSEUDONANAOILBIOSYNTHESISINTHISTHESIS,WEHAVEISOLATEDACDNAENCODINGDGATFROMTHALASSIOSIRAPSEUDONANAWHICHHASTHEHIGHESTNEUTRALLIPIDCONTENTAMONGTHEMICROALGAECOLLECTIONCENTEROFNINGBOUNIVERSITYANALYSISOFTHESEQUENCEREVEALSTHATTHISCDNAWAS1512BPINLENGTHWITHINTHEFULLLENGTHCDNA,ACLEAROPENREADINGFRAM
7、EORFWAS1365NUCLEOTIDES,CODING455AMINOACIDS,WHICHISDGAT1THERESULTSOFHOMOLOGOUSANALYSISINGENBANKDEMONSTRATEDTHATTHESEQUENCEHAD3741IDENTITYONTHENUCLEOTIDESEQUENCEWITHADVANCEDPLANT,ANDHIGHERIDENTITYWITHALGAETPSEUDONANAHADHIGHESTIDENTITY,54,WITHPHAEODACTYLUMTRICORNUTUMTHERESULTSOFPHYLOGENETICANALYSISSHOW
8、EDTHATDGATFROMTPSEUDONANAANDFROMPHAEODACTYLUMTRICORNUTUMCLUSTEREDTOGETHERFIRSTLY,ANDTHENCLUSTEREDWITHCHLORELLAVARIABILIS,THENCLUSTEREDWITHOTHERADVANCEDPLANTSKEYWORDSTPSEUDONANADGATFULLLENGTHCDNARACEGENESEQUENCEANALYSIS11绪论近年来，随着全球经济的快速增长，石油和煤炭等化石能源的消耗大幅度上升，化石能源短缺危机已迫在眉睫，对生物质能等可再生能源的关注逐渐成为热点【1】。据统计，2
9、004年我国一次能源消费总量约为197亿吨标准煤，比2003年增长18，其中煤炭占66，石油占22，天然气占28，水电占92，石油进口超过1亿吨。而且随着我国经济的快速发展，对能源的需求量将越来越大，预计到2020年，我国一次能源需求量为2533亿吨标准煤，到2050年这个数字预计将可能达到50亿吨标准煤。同时，能源供需矛盾将日益显现，尤其是石油供需矛盾将更加突出，石油供应安全凸现。另一方面，我国以煤碳为主的能源结构也将带来严重的大气污染，我国粉尘、二氧化碳和氮氧化物排放量的70，二氧化硫排放量的90来自于煤炭的燃烧。其中，二氧化硫和二氧化碳排放量已分别居世界第1位和第2位。20世纪90年代中
10、期，我国酸雨区已占全国面积的30左右。可吸入颗粒物、重金属污染等对生态环境造成的不利影响也日益受到全社会的关注。我国能源大规模开发利用所引起的环境问题，尤其是以二氧化碳为主的温室气体排放问题，已受到世界各国的普遍关注，京都议定书的生效和后京都议定书的开始谈判将使我国在温室气体排放问题上面对的国际压力日趋严重。寻找和开发化石能源的替代能源对保障国家能源安全以及促进经济社会可持续发展具有重要的战略意义。11生物柴油的研究现状111生物柴油作为替代燃料的优势生物柴油，又称单烷基脂肪酸酯，是以动、植物油脂为原料，与醇类经转酯作用获得的单烷基脂肪酸酯。生物柴油作为化石燃料的替代品，与化石柴油和燃料乙醇等
11、其他液体燃料相比，有着突出的特性生物柴油不含石蜡，闪点高，燃烧性能和效率要高于普通柴油，使用时更安全；可以通过种植、养殖或培养源源不断地得到，因而属于可再生资源；生物柴油产品中含硫和氮较少，可以减少产生SO2和NOX对大气的排放量。另外，与以淀粉类作物和木质纤维素类物质发酵产生的燃料乙醇相比，虽然酒精燃烧后尾气排放污染小，但其热值只有普通汽油的2/3，比柴油更低，且乙醇易吸水使燃烧值下降【9】。112国外制备生物柴油的原料按照当前技术，利用动植物油脂等原料生产生物柴油，其原料成本占总生产成本的5085，所以原料成本是决定生物柴油价格的最主要因素【10】。目前世界各国纷纷根据本国国情选择合适的油
12、脂原料生产生物柴油。欧洲和北美地区耕地资源丰富，农业高度发达，因此欧洲各国，尤其是德国，大规模种植油菜，采用菜籽油生产生物柴油，并建立了相应的产品标准。美国主要利用高产转基因大豆，发展以大豆油为原料的生物柴油产业。东南亚国家属于热带雨林气候或热带季风气候，全年高温，雨水丰富，适于规模化种植油棕，棕榈油已成为当地发展生物柴油的重要原料。世界可再生能源生产大国巴西，主要利用蓖蔴籽油进行生物柴油生产。113国内制备生物柴油的原料中国人口众多，人均耕地面积远低于世界平均水平，中国食用植物油脂的缺口较大【9】。因此政府首先要保证有足够的粮油等食物供应。据统计，2003年我国进口油菜和菜籽油等食用油达到2
13、50万吨，用以满足国内日益增长的消费需求。我国2004年111月份进口食用油脂625万吨，其中大豆油进口为239万2吨，同比增长56；菜籽油进口32万吨，同比提高118倍；棕榈油进口为216万吨，比上年同期提高12倍。2005年全年累计直接进口油脂为653万吨，其中棕榈油进口433万吨，大豆油进口1694万吨，菜籽油及其他进口506万吨。海关总署表示，2008年112月我国共进口了816万吨植物油，同比增长了26。这决定了今后很长时间内，中国食用植物油生产只能是力争满足人们生活需要，不可能出现足量剩余植物油用来发展生物柴油。种植草本油料作物油菜、大豆等需要大量土地，中国不可能利用大量的耕地来提
14、供生物柴油原料。中国如果进口大量的大豆油、菜籽油用于生产生物柴油，其成本太高，市场竞争力差，需要大量的政府补贴，并不符合中国的国情。我国木本油料植物资源丰富，麻疯树、黄连木、油桐、乌桕等含油量可达20【9】。因此我国目前主要以野生油料木本植物种子和废弃动植物油脂为原料生产生物柴油。生物柴油原料的发展潜力巨大，麻疯树、黄连木等油料植物可满足500万吨/年生物柴油装置的原料需求，废弃动植物油回收每年可生产约200万吨生物柴油。114存在的问题绿色植物中草本油料作物的含油量较高，收获的种子存储和加工比较简便，但我国现在还需要从国外进口大量食用油，不能依靠大豆、油菜等来大量生产生物柴油【9】。其他非食
15、用油料作物也可以作为生物柴油的生产原料，但也会与粮油棉等作物争地、争水、争肥。木本油料植物可以利用荒山野岭来种植，不与农作物争地，还可以绿化环境，改良生态，在我国已有企业实施的成功范例。但这些树木的含油果实一般一年只收获一次，而且存储的成本较高，以此为原料进行生物柴油生产会受到季节的限制。另外，在生物柴油制备方法方面，物理法得到的燃料油不适合在柴油发动机中长时间使用。化学法和生物酶法都各有优缺点，但都有成本过高的缺陷。目前生物柴油的制备主要是利用化学酯交换法。12微藻制备生物柴油的研究现状121微藻制备生物柴油的优势作为新一代生物柴油原料，微藻拥有很多优势。例如微藻种类繁多，分布极其广泛。全球
16、已经鉴定的微藻大约有40000种，且其数量还在不断增加。大多分布在江海湖泊中，不与农作物争地，可以整年生长。微藻通常呈单细胞或丝状体，结构简单，整个生物体都能进行光合作用，所以光合作用效率高，生长周期短、速度快。微藻还可利用微生物发酵技术，在光反应器中高密度、高速率培养。在同样条件下，微藻细胞生长加倍时间通常在24H内，对数生长期内细胞物质加倍时间缩短至35H【11】。微藻油脂含量高。例如葡萄藻（BOTRYOCOCCUSBRAUNII）的含油量为细胞干重的2575。而高等植物种子的脂肪酸含量仅为干重的1520左右。其油脂组成与一般油料植物相似，以C16、C18系脂肪酸为主。微藻能吸收并利用工农
17、业生产中排放出的大量CO2和氮化物或从废水中取得氮、磷等，有利于改善环境。122国外微藻制备生物柴油的研究进展20世纪50年代，美国麻省理工学院在校园内建筑物的屋顶开始进行养殖藻类生产生物燃料的试验，并在研究报告中第一次提到了藻类生物燃料。31978年，美国能源部可再生能源国家实验室开始养殖微藻生产生物燃料项目AQUATICSPICESPROGRAM，简称ASP项目的研究，研究内容从微藻筛选、微藻生化机理分析、工程微藻制备到中试。研究人员在美国加利福尼亚州、夏威夷州、新墨西哥州等地进行了中试放大。中试装置运行了一年，可获得高达005KG/M2D的工程微藻，微藻含油量达到4060。该项目持续到1
18、996年，19781996年累计投入科研经费2505万美元。由于油价上涨，2007年底美国能源部又将这个中断了11年之久的项目重新启动【10】。进入21世纪后，研究工作出现了新的进展，逐步从实验室走向中型规模验证和生产放大阶段。2002年，美国圣地亚国家实验室在LIVEFUELS公司资助下，利用分子生物学反应工程技术进行增加微藻细胞含油量和产量方面的研究，经过5年的工作，制取出了性能类似大豆油的海藻油，油脂含量丰富，可生产生物燃料。其研究表明，仅需美国土地面积的03就可生产出满足全美国需要的运输燃料。该项目的目标是到2010年研究获得经济可行的生物柴油【8】。2005年12月，第一辆采用海藻燃
19、料和大豆油调合比例为19的示范轿车在印度进行了1500KM的实车试验。除科研机构外，众多的生物燃料公司、投资公司也涌入了该研究领域。美国GREENFUEL技术公司开发的海藻技术于2005年在ARIZONA的APS电厂完成了中试，选用高生长率的海藻，置于装有水的大型试管内，置于直接的阳光照射下。美国可再生能源集团REG于2008年8月21日宣布，该公司已拥有规模化的商业化技术，可生产大量高质量的海藻生物柴油，柴油质量超过ASTMD6751和EN14214M标准。美国SAPPHIRE公司2008年9月宣布投资1亿美元开展养殖海藻生产生物燃料的研究，SAPPHIRE公司有两个引人注目的投资商比尔盖茨
20、私人名下的一家投资公司CASCADEINVESTMENTS和为洛克菲勒家族服务的投资合作商VENROCKPARTNER。SAPPHIRE公司宣称通过一种用太阳光、二氧化碳和光合海藻的工艺研制出了辛烷值达91的绿色汽油，而且生产的绿色燃料与现有的从炼油厂到加油站的销售网络设施完全兼容，显示了微藻汽油与第一代生物乙醇相比的优势所在。123国内微藻制备生物柴油的研究进展虽然我国微藻养殖的历史不长，技术上与先进国家存在一定的差距，但近十多年来发展很快。螺旋藻、小球藻等微藻的养殖也逐渐受到重视。微藻生产生物燃料的研究取得了很大进展。清华大学生物技术研究所缪晓玲等通过异养转化细胞工程技术获得高油脂含量的异
21、养小球藻，其脂含量高达细胞干重的55，是自养藻细胞的4倍。将制备的微藻离心分离获得微藻细胞，经蒸馏水洗和冷冻干燥成为粉状后，用正己烷萃取细胞中的油脂，分离除去萃取剂后得到皂化值和酸值分别为1893MGKOH/G和897MGKOH/G的油脂，其相对分子质量为933，相当于菜籽油的相对分子质量。鉴于获得的油脂酸值较高，研究人员利用酸催化酯交换技术进一步得到生物柴油和副产物甘油，得到的生物柴油符合ASTM相关标准。缪晓玲等还开发了微藻异养发酵生产生物柴油技术。通过细胞控制技术获得异养小球藻。异养小球藻细胞中油脂类化合物大量增加，蛋白质含量下降。利用独创的淀粉酶解和两步法半无菌培养基技术，以淀粉为原料
22、发酵生产富油脂小球藻。实验室研究结果表明，与常规制备技术相比，成本下降58倍，油脂质量分数达99以上【1】。山东海洋工程研究院与有关机构合作开展了海藻的能源化利用研究，目前已在实验室取得了初步成果，培育出了富油微藻，最高含油量已达到68，并在此基础上制取生物柴油。中国水产科学研究院、中科院海洋研究所等单位也正在开展以海洋藻类为原料生产生物柴油的研究。4目前已建立了化学法和脂肪酶法生产生物柴油的关键技术与工艺路线，生物柴油的收率达到98以上，收集获得了含油量超过28的藻类，并对海藻油脂的提取进行了研究。该项目技术已完成了小试、中试，并已向北京、上海、湖北武汉、湖南长沙、河北廊坊和山东几家公司转让
23、。据了解，抚顺石化研究院已开展微藻利用的探索性研究，对能够利用二氧化碳并富集油脂的藻类进行筛选和培养，掌握了葡萄藻、小球藻、小环藻等典型藻种的培养条件和生长特性。正在对藻种改良，光反应器，以及油脂、糖类、纤维素等目标产物分离进行深入研究。2008年，河北新奥集团通过微藻固定二氧化碳并制备生物质能源项目，以微藻为原料，成功进行了生物柴油和生物燃气的中试。该公司预计在35年内逐步实现藻类生物能源的产业化。124存在的问题和今后研究的方向高昂的生产成本是利用微藻生产生物柴油所面临的第一个瓶颈问题【9】。假设采用含油量为30的微藻来生产生物柴油，那么从培养、收集、提炼到成品，成本约为191元/L。而我
24、国2008年0号柴油的价格只有61元/L，此价格还包括了税收、运输、利润等费用。其次是微藻大规模培养的问题。微藻类的大规模培养系统一般可以分为两大类开放式培养系统和封闭式培养系统。开放式培养系统一般是指室外的露天人工制造的培养池或特定环境下的小规模湖泊，其优点是造价低廉、操作简便、生产成本较低，但由于培养环境不稳定、培养条件无法控制，培养效率较低，只能用于螺旋藻、小球藻、盐藻等少数特定微藻的培养。封闭式培养系统也被称为光生物反应器，是目前流行的微藻培养系统，有柱状、平板式、管道式等多种形式，具有培养环境可人工控制、光利用效率高、操作简单等优点，可以实现微藻的高密度、大规模培养。但封闭式光生物反
25、应器在大规模培养过程中的生产成本相对较高。脱水是微藻采收过程中最非常重要的一个环节。微藻个体较小，除个别种类之外，一般只有几个微米到十几个微米大小，一般的固液分离方法很难适用于微藻。另外，与一般微生物不同，微藻细胞周围大多富含糖，当微藻细胞达到一定浓度时呈现出非牛顿流体特性，给采收工作带来了很大的困难。以生产能源为目的的微藻养殖规模巨大，大量的废培养液如果处理不当，会对环境造成严重污染。微藻培养过程中除了产油外，还会产生多种不饱和脂肪酸和其它物质如蛋白质等，这些物质会对后处理精炼过程产生影响，影响生物柴油的品质和增加生产成本。针对以上微藻制备生物柴油中存在问题，当前和今后的研究重点应集中在以下
26、几个方面首先，高产油藻种的筛选，并借助基因工程和代谢工程进一步提高微藻油脂含量。其次，微藻的大规模培养，需要较好解决微藻最佳的培养条件和最低的成本消耗，即选择合适的光照方式，提高光能利用率；选用合适的培养系统，达到最大培养数量。除了日光和外置光源照射外，采取最小化光的传输路径、最大化照明表面积与培养液体积比率等的设计，如加装内部照明装置的纤维玻璃光生物反应器等也可以较好解决光照等问题，提高产率。再次，培养基循环使用，做到废水零排放。最后，开发高效率、低能耗的微藻采收装置；开发更适合生物柴油生产使用的催化剂和生产工艺，提高催化效率和生物柴油品质。微藻提取油脂后，藻渣可以加工成动物饲料或其他产品，
27、也可以进行厌氧发酵生产甲烷。513DGAT研究现状131DGAT在TAG合成中的作用如图1所示，DGAT二酰甘油酰基转移酶催化TAG（三酰甘油）合成途径的最后一步反应，也是该途径的限速酶【3,6,15,16,17】，对它的研究对于进一步提高微藻含油量，降低生物柴油生产成本，有着十分重要的意义。几种植物DGAT基因已被克隆和分析【12,13,14,19】，这些特定作物的DGAT可能有一些有效完成油酸的酰化作用的特殊结构【21,22】。图1植物三酰甘油的生物合成途径图132DGAT的分类根据从NCBI蛋白数据库中已知的物种中DGAT蛋白的氨基酸序列，运用生物信息学软件DNAMAN60分析可以把它们
28、分为3类DGAT1、DGAT2和DGAT3基因家族。DGAT1基因家族只存在于动物和植物中。高等植物DGAT1蛋白的氨基酸残基数一般在480550之间，不同物种的DGAT氨基端前100个氨基酸残基相似性较低低于20，而位于100以后的氨基酸残基相似性较高大于70，可能正是这种N端差异导致了不同植物DGAT1酶属性的不同。一般情况下，植物DGATL具有9L0个跨膜结构域，在N端有一个由100多个氨基酸组成的亲水域，该亲水域位于内质网膜的胞质面。DGAT2基因家族的成员在动物、植物和酵母中都存在，并且与DGAT1基因家族没有明显的相关性。目前对植物DGAT2的研究较少，仅在拟南芥、油菜、蓖麻等少数
29、植物中克隆出来。蛋白序列分析发现，C端明显比N端保守，同样也具有相似的亲水结构域和疏水结构域。几种已知的DGAT2蛋白具有23个跨膜结构域。DGAT3基因是SAHA等从发育中的花生子叶细胞质中克隆的一个与TAG合成相关的基因，该基因属于DGAT基因家族，但是与DGATL和DGAT2基因家族的相似性不足10，其蛋白序列与上面两种DGAT家族同源性很低，但是具有类似DGAT蛋白功能基序。该蛋白含有345个氨基酸，推测其分子量为41KD，不存在跨膜结构和信号肽序列，因此推测该蛋白定位于细胞质中，是一种可溶性蛋白。对宁波大学微藻种质库的63株微藻尼罗红染色法筛选【18】，表明中性脂含量最高的为假微型6
30、海链藻（TPSEUDONANA）【2】。所以本研究选定该藻种为实验材料，提取并测定了它的合成三酰甘油的关键酶二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）序列，并进行了序列比对以及生物信息学分析。对该基因的测序和序列分析将为深入研究假微型海链藻DGAT基因表达特征及其编码蛋白在微藻中代谢的功能提供理论依据，对于探明DGAT的生物合成和代谢机理具有重要意义。被分离出的基因可直接用于改变微藻和高等产油植物的脂质成分，对未来高含量羟基脂肪酸原料的研究提供参考。2材料与方法21材料实验材料假微型海链藻（TPSEUDONANA）取自宁波大学微藻种质库，于5000ML三角瓶中，在温度20，盐度2530，光照强度为50U
31、MOL/M2S，光暗比12H12H的条件下采用NML3培养液（表1）培养10D。表1NML3培养液配方营养成分含量（G/L）KNO3100KH2PO410EDTANA220C6H5O7FE5H2O1MNSO405VB16103VB125105NA2SIO3（硅藻）222方法221总RNA的提取首先，将三角瓶中的假微型海链藻（TPSEUDONANA）离心，去上清，得到100MG的藻泥于2MLEP管中。然后加入1ML的TRIZOL试剂，超声波清洗机中超声5MIN后提取总RNA。最后用20LDEPC水（RNASEFREE）溶解RNA，测定RNA的浓度和OD260/OD280的值。222反转录合成CD
32、NA的第一条链取各样品RNA1G按TAKARAPRIMESCRIPTTMRTPCRKIT【21,22】（宝生物工程有限公司）操作方法在一个DEPC水处理过的PCR管中加入总RNA1G，OLIGODTPRIME25M1L，DNTPMIXTURE（10MMEACH）1L，加RNASEFREEDH2O补至10L，PCR仪上65反应5MIN后，离心数秒使模板RNA、引物等的混合液聚集于PCR管底部。然后加入5PRIMESCRIPTTMBUFFER10L，RNASEINHIBITOR（40U/L）05L，PRIMESCRIPTTMRTASE（FOR2STEP）05L，RNASEFREEDH2O5L，混匀
33、后PCR仪上进行反转录反应3010MIN，4230MIN，955MIN，得到的CDNA产物可直接用于基因全长CDNA的克隆7或放20保存。2233RACE引物设计按照NCBI上公布的假微型海链藻（TPSEUDONANA）CCMP1335的DGAT基因的全长序列（XM_0022871791），用PRIMERPREMIER50设计DGAT基因的特异性引物，接头及接头引物由3和5FULLRACECORESETVER20试剂盒提供（表2）。表2假微型海链藻（TPSEUDONANA）3RACE引物引物名称PRIMERNAME引物序列PRIMERSEQUENCE（53）3RACEADAPTOR含有由TAK
34、ARA独特设计的DT区域及ADAPTORPRIMER部分3RACEOUTERPRIMERTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3RACEINNERPRIMERCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGGGENESPECIFICOUTERPRIMERTTGGGTCGATCTGATATCCGENESPECIFICINNERPRIMERATCATATCCTCCCTCGAAG2243RACE获得DGAT基因全长CDNAOUTERPCR反应体系为50L反转录反应液3L，1CDNADILUTIONBUFFER7L，GENESPECIFICOUTERPRIMER10M2L，3RA
35、CEOUTERPRIMER10M2L，10LAPCRBUFFERMG2FREE4L，MGCL2（25MM）3L，TAKARALATAQ（5U/L）025L，DH2O2875L。反应条件943MIN；9430S，5530S，7215MIN，35个循环；7210MIN。INNERPCR反应体系为50L稀释后的OUTERPCR产物1L，DNTPMIXTURE25MMEACH8L，10LAPCRBUFFERMG2FREE5L，MGCL2（25MM）5L，TAKARALATAQ（5U/L）05L，GENESPECIFICINNERPRIMER10M2L，3RACEINNERPRIMER10M2L，DH2
36、O265L。反应条件943MIN；9430S，5530S，7215MIN，35个循环；7210MIN。225测序分析取5ULPCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，检测3RACEPCR扩增产物。取2UL扩增产物连接到05ULPMD18T受体上，16过夜连接。连接产物中加入大肠杆菌感受态细胞，冰上放30MIN，42热激45S，再在冰上放45MIN，每管加入1MLLB培养基，37摇床培养1H。混匀转化后，在含有AMP100MG/L的LB固体平板上充分涂干，倒置平板于37培养1218H。挑取白色菌落加入到含AMP100MG/L的LB液体培养基中，37震荡过夜。在无菌条件下取菌液1ML分装小管，加入50甘油和
37、100UL菌液做PCR检测。把阳性克隆送上海生工测序。226DGAT基因CDNA全长的生物信息学分析将所得到的序列在NCBI的BLAST进行比对【7,13】,核苷酸序列的相似性比对在NCBI的BLASTN8HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLASTN中分析,并确定开放阅读框分析ORF,（HTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/GORF/GORFHTML）将其推导相应的氨基酸序列比对在NCBI的BLASTXHTTP/WWWNCBINLMNIHGOV/BLASTX中分析运用MAG50软件对推导的氨基酸序列与已知报道植物推导的氨基酸序列进行系统进化分析。3结果与讨论31假微型海链藻D
38、GATCDNA克隆改进的SDS/酚法提取假微型海链藻的总RNA，电泳观察是否有DNA污染图2,利用紫外光吸收法测定RNA的浓度和OD值。泳道3浓度达到450NG/UL，OD260NM/OD280NM值为18。提取的RNA完全能够满足下一步普通反转录与RACE反转录的需要。图2假微型海链藻总RNA电泳结果以特异引物3RACEOUTERPRIMER与GENESPECIFICOUTERPRIMER，反转录CDNA为模板，PCR扩增目标基因片段，电泳无条带。以特异引物3RACEINNERPRIMER与GENESPECIFICINNERPRIMER，反转录CDNA为模板，PCR扩增目标基因片段，电泳有条
39、带，回收、测序得到1512BP的CDNA序列（图4），NCBI上BLAST比对后，发现与数据库中的假微型海链藻（TPSEUDONANA）CCMP1335DGAT基因的相似性达到99。图3假微型海链藻DGAT3RACEPCR产物32生物信息学分析321核苷酸序列分析测序得到假微型海链藻DGAT基因全长1512BP（图4），开放阅读框为1365BP（图5），其中起始密码子ATG位于57BP处，终止密码子TAA位于1418BP处,推导的氨基酸序列含455个氨基酸。12345M121512BP28S18S5S9图4假微型海链藻（TPSEUDONANA）DGAT基因的CDNA全长10图5假微型海链藻DG
40、ATCDNAORF核苷酸序列及其推导的氨基酸序列322推导的氨基酸序列同源性分析假微型海链藻DGAT核苷酸推导出的氨基酸序列为DGAT1，与已报道的藻类的同源性较高，分别为三角褐指藻54和变种小球藻43，与三角褐指藻同源性最高。与已报道的其它高等植物DGAT基因序列有3741的同源性，欧洲油菜和芥菜有41同源性，其次为玉米、大豆、江南卷柏、卫矛，为40，其余皆低于40。结果表明，此研究从假微型海链藻中克隆到的DGAT基因与已报道的高等植物同源性不高，与藻类同源性稍高，但总体来讲同源性都不高表3。表3假微型海链藻DGAT基因和已知其它植物的DGAT基因推测核苷酸相似性比较中文名拉丁名登录号蛋白相
41、似性（）11续表3中文名拉丁名登录号蛋白相似性（）三角褐指藻PHAEODACTYLUMTRICORNUTUMXP00217775354变种小球藻CHLORELLAVARIABILISEFN50697143欧洲油菜BRASSICANAPUSAAD40881141芥菜BRASSICAJUNCEAAAY40784141蓖麻RICINUSCOMMUNISXP002514132140玉米ZEAMAYSABV91586140大豆GLYCINEMAXATT7362940江南卷柏SELAGINELLAMOELLENDORFFIIXP00296416540卫矛EUONYMUSALATUSAAV3108340向日
42、葵1HELIANTHUSANNUUSACD67882139葡萄VITISVINIFERAXP00227934539百脉根LOTUSJAPONICUSAAW51456139向日葵2VERNONIAGALAMENSISABV21945138中亚热带红壤区油桐VERNICIAFORDIIABC94471138蓝蓟ECHIUMPITARDIIACO5563538橄榄OLEAEUROPAEAAAS01606137烟草NICOTIANATABACUMAAFL9345137323推导的氨基酸序列系统进化分析对GENBANK同源性搜索获得的其它植物DGAT基因核苷酸序列进行系统进化分析，通过MAG50分析，修
43、建序列长度至421个氨基酸，发现最先与假微型海链藻聚类合并的是三角褐指藻，接着与变种小球藻和其余的高等植物聚合。先与江南卷柏聚类，再与玉米、向日葵2和向日葵1、橄榄和蓝蓟、烟草、芥菜和欧洲油菜、中亚热带红壤区油桐和蓖麻、卫矛、葡萄、百脉根和大豆聚类（图6）。12图6不同来源的DGAT基因推导的氨基酸序列聚类分析结果4小结此研究采用RACE技术,从假微型海链藻种获得了DGAT基因的全长序列,对该序列分析发现，该基因全长全长1512BP，开放阅读框为1365BP，其中起始密码子ATG位于57BP处，终止密码子TAA位于1418BP处,推导的氨基酸序列含455个氨基酸。通过NCBI上BLAST比对后
44、，发现与数据库中的假微型海链藻（TPSEUDONANA）CCMP1335DGAT基因的相似性达到99。BLASTX进行同源性比对分析，假微型海链藻DGAT核苷酸序列与已报道的藻类的同源性较高，分别为三角褐指藻55和变种小球藻43，与三角褐指藻同源性最高，为54。与已报道的其它高等植物DGAT基因序列有3741的同源性。对GENBANK同源性搜索获得的其它植物DGAT基因核苷酸序列进行系统进化分析，通过MAG50分析，修剪序列长度至421个氨基酸，发现最先与假微型海链藻聚类合并的是三角褐指藻，接着与变种小球藻和其余的高等植物聚合，其结果表明不同物种的DGAT基因进化程度不同。该研究中克隆出与产油
45、密切相关的DGAT基因的DGATCDNA全长，其转基因研究不仅能了解其功能，而且还有助于借助分子方法共抑制、RNAI或导入新基因等实现对油脂成分的改造【20,25】，这对于日趋发展的生物能产业来说商业价值很大【7，13】。相信今后随着产油机理和油脂生物合成途径的研究深入和基因工程技术的不断完善，微藻产能将会有更广阔的应用前景【23,24】。参考文献1嵇磊，张利雄，姚志龙等利用藻类生物质制备生物燃料研究进展J石油学报石油加工，2007，236152王金娜，严小军，周成旭，徐继林产油微藻的筛选及中性脂动态积累过程的检测J生物物理学报，2010，2653刘波，孙艳,刘永红，赵宗保产油微生物油脂生物合
46、成与代谢调控研究进展微生物学，2005，1514刘源，姜运良猪DGAT1基因部分序列的克隆及分析山东学术年会，2005，246248135李栒油菜种子含油量相关基因PEPC和DGAT的克隆及遗传转化研究湖南农业大学博士论文6马海明，施启顺，柳小春DGAT相关基因的研究进展遗传学报，2005，32（12）132713327祁银燕，刘雅莉，李莉，王跃进风信子DFR基因全长CDNA的克隆及序列分析中国农学通报，2009，252462678钱伯章海藻生产乙醇和生物柴油燃料成新宠J可再生能源，2007，2531011059贾虎森，许亦农生物柴油利用概况及其在中国的发展思路J植物生态学报，2006，302
47、22123010ALGAEBLOOMTWOORGANIZATIONSANDCOUNTLESSCOMPANIESSTRIVETOBRINGTHEDREAMOFALGAEBIOFUELSTOLIFEJBIOFUELSDIGEST,2008911CHISTIYBIODIESELFROMMICROALGAEJBIOTECHNOLADVAN,2007,2529430612ASSAFBARDI,KIMBERLEETHAMATRAKOLN,KAYDPAULGFALOWSKI,ETCDIATOMGENOMESCOMEOFAGE,GENOMEBIOLOGY,2JANUARY,200913XIAOHUAHE,CH
48、ARLOTTATURNER,GRACEQCHEN,JIANNTSYHLIN,ANDTHOMASAMCKEONCLONINGANDCHARACTERIZATIONOFACDNAENCODINGDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEFROMCASTORBEANJLIPIDS,2004,39431131814EVIRGINIAARBRUST,JOHNABERGES,CHRISBOWLER,THEGENOMEOFTHEDIATOMTHALASSIOSIRAPSEUDONANAECOLOGY,EVOLUTIONANDMETABOLISMSCIENCE,2004,3061015LEHN
49、ERR,KUKSISABIOSYNTHESISOFTRIACYLGLYCEROLSJPROGRESSINLIPIDRESEARCH,1996,35216920116LUNGSC,WESELAKERJDIACYLGLYCEROLACYLTRANSFERASEAKEYMEDIATOROFPLANTTRIACYLGLYCEROLSYNTHESISJLIPIDS,2006,41121073108817MORTENSONSH,BORSHEIMKY，RAINUZZOJKETA1FATTYACIDANDELEMENTALCOMPOSITIONOFTHEMARINEDIATOMCHAETOCEROSGRACILISSCHUTTBIO1,1988,12217318518ALONZOF,MAYZAUDPSPECTROFLUOROMETRICQUANTIFICATIONOFNEUTRALANDPOLARLIPIDSINZOOPLANKTONUSINGNILEREDMARCHEM,1999,6728930119HOBBSDH,LUC,HILLSMJCL
