1、本科毕业设计（20_届）结构新颖的CYCLIND1CDK4抑制剂的QSAR研究所在学院专业班级生物技术学生姓名学号指导教师职称完成日期年月目录1引言211CYCLIND1CDK4及其抑制剂的作用机理2111CYCLIND1CDK42112CYCLIND1CDK4抑制剂的作用机理212分子对接313QSAR3131QSRA研究的发展现状3132COMFA4133TSAR42分子计算421分子来源及实验相关软件422分子对接5221抑制剂（配体）的构建及CDK4分子的预处理5222GOLD对接523COMFA计算建立3DQSAR模型5231活性分子的构建及其分子叠合5232COMFA计算624TS
2、AR计算建立2DQSAR模型7241抑制剂分子的导入与参数设置7242抑制剂分子结构参数的计算83结果与分析831抑制剂分子对接的活性构象及分析8323DQSAR模型及分析93213DQSAR模型93223DQSAR模型分析11332DQSAR模型及分析123312DQSAR模型123322DQSAR模型分析134讨论13致谢错误未定义书签。参考文献14摘要细胞周期依赖激酶4（CDK4）通过与细胞周期蛋白（CYCLIND1）结合形成复合物能够参与调控细胞周期G1期向S期的过渡。新型CDK4抑制剂噻吩并2,3D嘧啶4腙类衍生物能够通过竞争CDK4的ATP结合口袋抑制其活性，具有抗肿瘤功能。本实验
3、通过GOLD50软件完成CDK4分子与该类抑制剂活性最高的28号分子的柔性对接，并以打分最优的28号化合物构象作为模板构建其余抑制剂进行基于COMFA的3DQSAR建模，结果为Q20740，R20971，F157047，SEE0140，立体场贡献与静电场贡献的百分比比值为617/383。此外，通过TSAR建立的2DQSAR模型结果也很理想，其Q20683，R20978，F10917，S0130。上述二个QSAR模型都具有较强的预测能力，可以指导该腙类CDK4抑制剂衍生物的进一步改造，辅助药物设计。关键词CYCLIND1CDK4；噻吩并2,3D嘧啶4腙类；分子对接；COMFA；TSARABSTR
4、ACTCYCLINDEPENDENTKINASES4CDK4TAKESPARTINREGULATINGTHETRANSITIONFROMTHEG1PHASETOTHESPHASEOFTHECELLCYCLEWHENBINDINGTOACYCLIND1NOVELANALOGUESOFINHIBITORSOFCDK4,THIENO2,3DPYRIMIDIN4YLHYDRAZONES,HAVEBEENFOUNDTOHAVETHEABILITYOFANTITUMORBYBINDINGTOTHEATPBINDINGPOCKETOFCDK4INTHISSTUDYTHEMOLECULARDOCKINGPRO
5、GRESSGOLD50WASUSEDTODOCKTHEMOSTACTIVEINHIBITORMOLECULARNO28TOTHECDK4ANDOTHERANALOGUESWEREBUILTDEPENDENTONTHATMOLECULARTHEN3DQSARMODELWEREBUILTBYTHECOMPARATIVEMOLECULARFIELDANALYSISCOMFA,GAVEACONVENTIONALR2VALUSOF0971WITHACROSSVALIDATEDQ2VALUEOF0740AT6PCS,THEPERCENTAGEOFSTERICANDELECTROSTATICATTRIBUT
6、ESIS617/383ANDTHEFVALUEIS157047,SEEVALUEIS0140,RESPECTIVELYBESIDES,THE2DQSARMODELEDBYUSINGTHETOOLSFORSTRUCTUREACTIVITYRELATIONSHIPSTSARALSOTURNOUTTOBEDESIRABLEWITHQ2VALUEOF0683,R2VALUEOF0978,FVALUEOF10917,SVALUEOF0130BOTHTHEPREDICTIONSOFTHETWOMODELSWERESIGNIFICANTANDIDEALTOGIVERELIABLEDIRECTIONSFORF
7、URTHERDEVELOPMENTOFTHEDRUGDESIGNOFTHISCDK4INHIBITORSKEYWORDSCYCLIND1CDK4THIENO2,3DPYRIMIDIN4YLHYDRAZONESMOLECULARDOCKINGCOMFATSAR21引言11CYCLIND1CDK4及其抑制剂的作用机理111CYCLIND1CDK4真核细胞的细胞周期是由细胞周期依赖激酶（CDKS）所调控。CDKS是一类丝氨酸/苏氨酸激酶类家族蛋白质，在真核细胞的生长、发育、增殖以及凋亡中发挥着关键的作用1,2。CDKS与其调控亚基细胞周期蛋白CYCLINS在协调细胞度过细胞周期中发挥作用，并且它们会
8、在特定的时期例如G1期、S期、G2期以及M期被激活。目前已经发现并鉴定的CDKS具有113种，而CYCLIN也具有不同的类型，包括CYCLINACYCLINH等。其中CYCLIND又包括CYCLIND1，CYCLIND2和CYCLIND32。在G1期，由于细胞对有丝分裂素产生应答反应，细胞周期素CYCLIND1将会增多并启动CDK4/6在G1期早期的活化进而引起CYCLINECDK2的激活，后者将有利于细胞通过细胞周期的G1期。值得人们注意的是，CDK4仅限制着细胞度过G1期而CYCLINACDK2却不仅控制着G1期的过渡，同时还控制S期2,3。因此，CDK4是G1期特异的细胞周期依赖激酶。在
9、正常细胞中，肿瘤抑制因子P16对CDK4/6的活性起着负调控的效果，而且CIP/KIP家族的细胞周期依赖激酶抑制因子CKIS对CDK2的活性也起着负性调控。但是，据报道在许多的肿瘤中发现其P16或是RB基因发生了突变，丢失或是基因沉默现象。此外，在大多数的黑色素瘤患者中发现其CDKS发生了突变，相关的调控因子的表达量也表现出异常水平24。从上述都可以看出，RB途径以及CDK4的异常，对于肿瘤来说很关键。目前，WYETH等人5证明内源性CYCLIND1及CDK4的表达将会导致RB蛋白磷酸化以及更多的细胞进入到G1期。而且，其他研究证实当哺乳动物肿瘤细胞进行CDK4基因敲除后，能够防止肿瘤的形成。
10、除此之外，在许多癌症中已经证实CDK4CYCLIND途径失调。它们大多数遗传变异的靶点都是CDK4或CYCLIND1，而其他CDKS和CYCLINS很少发生变异3。这些结果都说明人为选择性的抑制CDK4活性将可能使细胞处于正常的周期中，而且该法可能比抑制CDK2来治疗肿瘤更加有效，特别是对于因INK4蛋白质家族，例如P16的丢失而引发的肿瘤4。112CYCLIND1CDK4抑制剂的作用机理CYCLIND1CDK4抑制剂按照其来源不同可以分为内源性和外源性抑制剂两大类。其中内源性CDK4抑制剂即上文提到的INK4蛋白质家族，如P16,P18等。P16蛋白能够与CDK4/6结合且使其构象改变并进而
11、影响到CDK4/6与CYCLIND1的结合；P18INK4C则通过使CDK上的ATP结合位点歪曲以及催化残基移位，抑制CYCLIND1CDK4复合物的形成来抑制细胞周期G1/S期的过渡并进而抑制肿瘤细胞的异常增殖。针对由CDKS抑制因子INK4家族蛋白质的基因突变、丢失而造成的细胞异常增生，可以通过向细胞中导入相应的该基因或该基因的蛋白质产物（短肽）类似物实现对肿瘤的治疗46。CDK4外源性抑制剂主要是其ATP结合口袋的竞争性抑制剂，且小分子抑制剂与ATP结构存在着一定的联系，正如本文中这种新型CDK4抑制剂，噻吩并2,3D嘧啶4腙类衍生物。由于CDKS这一类激酶能够通过消耗ATP使得其他化合
12、物发生磷酸化反应，并且因此参与细胞周期的调控。所以ATP是否结合于CDK4也决定着后者功能的实现，此也即为CDK4抑制剂作用机理及抑制剂人工设计合成的基本原理7。综上可以看出，CDK4是很有吸引力的癌症治疗靶点。最近，许多CDK4的选择性小分子抑制剂已经人工合成出来了。但是当前仍然存在一个问题，研发获得高效的CDK4抑制剂的报道明显少于相关的CDK2抑制剂5的报道。所以研究CDK4抑制剂定量构效关系能够为该类激酶抑制剂的药物设计提供很有意义的指导，对于辅助新药的合成也很关键。312分子对接分子对接是一种在分子模拟领域中用于预测两个分子间（受体与配体）结合形成稳定复合物时可能的结合模式或相互作用
13、情况的方法8。早在1878年，LANGLEY通过实验证实了由EHRILICH提出的受体学说，并提出药物分子与细胞表面或细胞内部的称为“受体”的特异分子结合后，才能引起细胞产生效应。这种药物与受体之间的特异结合与分子对接中配体（小分子）与受体（大分子蛋白质、DNA或RNA）的特异结合原理一致，因此可以认为分子对接是基于受体学说的基本理论而建立的。此外，FISHER提出的底物与酶之间的相互作用是“锁与钥匙”的关系，它们之间存在着结构的“识别”这一理论也是分子对接依据的来源之一。由于分子生物学与计算机辅助药物设计（CADD）的不断发展，分子对接都是通过相应的对接软件而实现的。在1982年，来自美国的
14、KUNTZ教授及其科研团队最先开发出了分子对接软件DOCK，该软件的基本原理与现阶段各种分子对接软件原理差别不大，可以说是分子对接软件的雏形。当前应用的分子对接软件除此之外还有AUTODOCK、FLEXX以及GOLD软件9。本文中采用的是GOLD50软件进行的小分子抑制剂与CDK4的分子对接。GOLD是一种用于计算小分子在蛋白质结合位点的分子对接模型的程序。GOLD采用遗传算法（GA），并有配体柔性，以及多达10个用户自主定义的局部蛋白质柔性（包括蛋白质侧链以及骨架柔性）设置等，这对于小分子的柔性对接很适用。13QSAR定量构象关系（QUANTITATIVESTRUCTUREACTIVITYR
15、ELATIONSHIP,QSAR），通过建立物质，例如某药物，其分子结构与其活性之间的数学关系，并进而预测具有更高活性时它该具有的分子结构。因此，QSAR常常作为一种依赖于配体的药物辅助设计方法，在CADD以及新药的开发中发挥重要作用10,11。131QSRA研究的发展现状早在19世纪，关于化合物生物学活性与其化学性质可以用数学模型揭示的理论就已经提出。但是，最早建立这种数学关系的是20世纪英国物理化学家哈密顿。他曾提出的一个经验方程即关于计算苯甲酸解离性质的哈密顿方程。此后，在哈密顿方程基础上不断的改进和发展起来了其他的能够建立起定量构效关系模型的方程等，例如HANSCH方程以及同时期的FR
16、EEWILSON方法。后者是直接以分子化学结构性质与其生物活性进行的回归分析，建立数学模型，正是经典的二维定量构效关系即2DQSAR10。喹诺酮类抗菌药，如诺氟沙星等，正是在2DQSAR模型的指导下合成的。二维定量构效关系在药物化学领域掀起了一场风暴，使人们对药物设计有了新的认识，是一次思维的飞跃即从传统的定性水平上升到定量水平，并能够从一定程度上模拟体内生物大分子与药物作用的结合模式。但是，不可否认2DQSAR本身仍有许多缺陷，存在很多局限性，只能计算结构简单的化合物、取代基性质，对于新型的药物分子结构往往不能找到对应的量化参数12。因此，与现代计算机图像技术相结合的3DQSAR因其能通过计
17、算分子三维空间构象性质（例如，分子形状、空间距离、分子立体场与静电场、疏水场等其他分子场作用力）并与其生物活性之间的建立相应的QSAR模型，并且以图像的形式显示出具体的结合模式，不仅直观、形象，而且便于进一步的药物分子的结构、构象改造，提高了预测配体与受体在体内相互作用的能力，因此便取代了经典的2DQSAR，普遍的应用到药学、环保及其他领域中。当前，三维定量构效关系已经发展了许多的建模方法，最早的有分子形状分析法、距离几何学的QSAR，之后是最普遍、最实用的COMFA、COMSIA，此外还有EVA、COMMA、HASL等等。3DQSAR当前仍是处于起步阶段，仍是是需要不断发展和完善的方法学内4
18、容11。132COMFA比较分子场分析（COMPARATIVEMOLECULARFIELDANALYSIS，COMFA），是依赖于活性分子的应用最广泛，最成功的3DQSAR技术之一，且当受体分子结构未知时COMFA也适用。对于COMFA建模，需要小分子的活性数据及其3D结构。其中，3D结构可以通过X射线晶体分析或是通过2D结构的图解计算以及后续的随机优化获得。COMFA的目的主要是通过从一系列小分子活性数据与其3D形状、带电情况以及形成的氢键的性质中建立数学关系。这种相关反映的是一系列叠合构象中每个叠合分子的性质。这些构象被假设为是活性构象，以共同骨架部分进行叠合。每个分子的这种构象依次进行分
19、子场计算。这些分子场，通常指静电场、立体场，是在常规的3D笛卡尔网格的格点处测算的；格点距离一般设为2。待测的相互作用正是小分子与格点处探针原子之间的作用。应用COMFA时，首先将活性构象的小分子放置于能够完全将其包裹的三维网格中；在每处格点通过探针原子计算每个分子立体场能量（通过LENNARDJONEPOTENTIAL）、静电场能量（通过库伦方程），所有的能量有一定截断值；最后，COMFA采用偏最小二乘分析PLS去预测格点处的能量值来带的活性值。随着对COMFA研究的不断进行，其缺陷也暴露出来了对分子叠合构象要求十分苛刻，稍微改变就可能对结果产生很大的差异；计算立体场与静电场的数学函数之间也
20、存在着问题。当前对COMFA的改进研究也正是从以上两方面考虑，此外还包括其他如新场的引进，变量的选择以及统计学处理方法的改进等方面12,13。133TSARTSAR（TOOLSFORSTRUCTUREACTIVITYRELATIONSHIPS），是由OXFORDMOLECULAR公司开发，主要用于研究定量结构活性关系，并可以认为是一种2DQSAR软件。目前，TSAR软件属于ACCELRYS公司所有。TSAR软件能计算出分子组成、分子指数、几何、电荷和量子化参数。组成参数反映了分子的组成信息，主要包括分子中原子、基团、环的数目以及分子量等；分子指数包括分子的连接性指数、形状指数、拓扑指数；几何参
21、数描述了分子的大小和形状，主要包括惯性矩、分子体积和表面积等；电荷参数描述了分子中电荷的分布信息，主要包括总偶极、偶极矩和取代基键偶极等；量化参数主要反映了分子中的电荷分布以及分子轨道能量等信息，描述分子的反应、分子之间的静电相互作用以及分子轨道之间的相互作用，量化参数主要包括生成热、偶极矩、HOMO以及LUMO能量等。综上所述，可以看出TSAR软件能够提供研究定量结构活性关系的所有功能，因此，TSAR软件可应用于医药、农药和毒理等方面的2DQSAR建模对于相应的分子设计或改造提供辅助指导的作用14。2分子计算21分子来源及实验相关软件本文的CDK4小分子抑制剂来源于文献7,15。本文所采用的
22、CDK4激酶晶体结构其数据取自PDB晶体数据库PDBID2W9FPDB。分子对接使用GOLD50软件完成。本文CDK4小分子抑制剂的比较分子场分析（COMFA）是应用SYBYL73分子设计软件包，并在LINUX操作系统下完成的3DQSAR模型的构建。本次实验采用TSAR33版本软件，利用TSAR计算所构建的抑制剂结构参数，以TSAR自带的统计分析法构建2DQSAR模型，且其中参数设置如无特别说明则均为默认值。522分子对接221抑制剂（配体）的构建及CDK4分子的预处理选取对CDK4抑制活性最好的第28号小分子进行GOLD分子对接。该分子是在SYBYL73软件中应用SKETCH模块构建，并对配
23、体加氢、GASTEIGEHCKEL电荷，结构优化时其参数设置为MAXINTERATION为1000；GRADIENT为0005；COLOROPTION为FORCE。出于对抑制剂小分子在体内的溶解后性质的考虑，对28号小分子其结构上的伯胺进行质子化处理，其余参数无特别指明时均为默认值，小分子抑制剂图形参见图1（其中RN为相应取代基），以MOL2格式保存用于GOLD软件对接。对于CDK4蛋白质晶体结构，用SYBYL73软件中的BUILD/EDIT模块去除晶体中的水分子，并用BIOPOLYMER模块进行蛋白质晶体的加氢。图1抑制剂结构图FIGURE1STRUCTUREOFTHEINHIBITOR22
24、2GOLD对接首先定义抑制剂的作用位点也即CDK4的ATP结合口袋，可以用坐标原子或是根据抑制剂而划定范围等方法来定义活性口袋。此处，本文则是采用将该腙类抑制剂放置于CDK4晶体ATP口袋内并将周围6距离定义为活性口袋的方法。CDKS该类激酶家族以及其他激酶，它们的ATP结合口袋三维结构在进化上高度保守，因此其ATP口袋具有同源性。CDKS分子的ATP结合口袋的共同特点是适合与分子量小于600的疏水、平面的小分子结合，且结合方式是通过与酶形成疏水键和氢键（例如CDK2激酶83位LEU及81位GLU能与小分子形成二个氢键）。对于CDK4而言，小分子抑制剂则是分别与93位VAL分子骨架上羰基氧原子
25、以及氨基氮原子形成二个氢键。此外，CDK4分子的ATP结合口袋特征除上文描述的方面之外其蛋白质骨架上的氨基酸侧链往往具有柔性，特别是12位的ILE及35位的LYS。因此，本实验在用GOLD进行配体与受体的对接时，对受体即CDK4分子进行氢键限制和侧链柔性设置（即将上文提到的两个氨基酸残基设置成柔性）。其余参数按默认设置完毕之后，执行GOLD，以遗传算法进行受体与配体的分子柔性对接。其打分函数为分子力场GOLDSCORE函数，在计算结果中打分值的高低代表抑制剂配体的活性高低16。选取得分值高且与ATP口袋对接合理的构象为抑制剂小分子的活性构象用于后续比较分子场分析中。23COMFA计算建立3DQ
26、SAR模型COMFA模型反映的是CDK4小分子抑制剂空间构象与其抑制CDK4分子活性之间存在的关系，主要通过相应的立体场、静电场能量与抑制剂活性进行统计分析而表现17。231活性分子的构建及其分子叠合以GOLD软件对接后的28号小分子抑制剂的结构为模板，在SYBYL73中构建其余135号小分子，并进行分子力学优化（其优化的参数设置与28号分子参数一致）、添加GASTEIGEHCKEL电荷，保存于统一数据库（MDB格式）。同样出于对抑制剂小分子在体内的溶解后结构性质可能发生变化的考虑，对18、19、29、30、33、34号等6个小分子其结构上的伯胺也进行质子化处理。构建结束后，便可进行分子叠合。
27、此处，还是以对接后的28号为模板，并选取公共骨架部分（共12个原子，图1中标注的原子）进6行点对点叠合（FITATOM）。图2所示为35个抑制剂分子叠合图，存放与新数据库备用。图235个抑制剂分子叠合图FIGURE2ALIGNMENTOF35INHIBITORMOLECULARS232COMFA计算本文中CDK4的35个抑制剂小分子其结构与活性数据参见表1，CDK4小分子抑制剂活性均以实测值的IC50（MMOL/L）表示，实验中换算为LGIC50MM，亦可记作为PIC50，其数值越大代表其活性也越大，反之亦反。COMFA计算时，其参数设置为COMFA场类型为TRIPOSSTANDARD，FIE
28、LDVALUES类型为BOTH（即包括立体场STERIC，静电场ELECTOSTATIC），阈值（CUTOFFS）均设置为300KCAL/MOL。探针原子类型选择甲烷分子的CSP3，带1个正电荷。对于网格的参数设置，在本次实验中REGION首先选择CREATEAUTOMATICALL（即系统自动生成网格）进行后续的PLS（偏最小二乘分析）及QSAR分析。由于考虑到COMFA对格点位置比较敏感18，本次实验中使用了一个编写的SPL小软件，进行了转动（ROTATE）、平动（TRANS）调整并获得最优的格点，此后再用PLS处理CDK4抑制剂的活性数据LGIC50与COMFA计算值并建立3DQSAR模
29、型。PLS计算时，其注滤值（COLUMNFILTERING）参数设置为20。主成分数的确定是通过进行交叉验证（采用LEAVEONEOUT）决定，之后再进行一次非交叉验证来建立3DQSAR模型即COMFA模型。COMFA预测模型可以通过相应的三维等值线图显示计算结果17，并直接给出影响该腙类CDK4抑制剂活性的静电场、立体场的直观信息。因此，在PLS之后可执行VIEWQSAR，显示相应的图像。表35个CDK4抑制剂的结构、活性的实测值TABLE1STRUCTURESANDACTUALVALUESOF35INHIBITORSOFCDK4NOR1R2R3R4LGIC50ACTUAL1ETHHTHIO
30、PHENYL25842MEHHTHIOPHENYL21593IPRHHTHIOPHENYL37814TBUHHTHIOPHENYL34217续表1NOR1R2R3R4LGIC50ACTUAL5MEETHTHIOPHENYL1276678IPRETETHHHMEHHTHIOPHENYLTBUCYCLOPROPYL2053177518869IPRHH2PYRIDINYL252810IPRHH3PYRIDINYL273211IPRHH4PYRIDINYL309312IPRHHPHENYL279913IPRHHFRANYL287114TBUHH2PYRIDINYL253915TBUHH3PYRIDIN
31、YL279416TBUHH5METHYL2PYRIDINYL256717TBUHH6METHYL2PYRIDINYL279618TBUHH6AMINOMETHYL2PYRIDINYL276219TBUHH6METHYLAMINOMETHYL2PYRIDINYL31522021TBUTBUHHHH6DIMETHYLAMINOMETHYL2PYRIDINYL6MORPHOLIN4YLMETHYL2PYRIDINYL3818338222TBUHH6HYDROXYMETHYL2PYRIDINYL298923TBUHH4CARBOXYPHENYL255824TBUHH4HYDROXYMETHYLPHEN
32、YL292925TBUHH3DIMETHYLAMINOMETHYLPHENYL415026TBUHH4DIMETHYLAMINOMETHYLPHENYL367827TBUHH42HYDROXYETHYLMETHYLAMINOMETHYLPHENYL415228TBUHH4AMINOMETHYLPHENYL420929TBUHH4METHYLAMINOMETHYLPHENYL396930TBUHHISOINDOLIN5YL362731TBUHH2METHYLISOINDOLIN5YL358032TBUHH2ISOPROPYLISOINDOLIN5YL369133TBUHH1,2,3,4TETRA
33、HYDROISOQUINOLIN7YL403234TBUHH1,2,3,4TETRAHYDROISOQUINOLIN6YL398435TBUHHPHENYL270624TSAR计算建立2DQSAR模型241抑制剂分子的导入与参数设置将上述由SYBYL73构建的CDK4抑制剂小分子数据库导入TSAR。本实验中抑制剂的活性数据仍是以上述的LGIC50（MM）形式表示。在计算抑制剂分子的结构性质之前先定义取代基，以便后续取代基性质的计算。本实验中，取代基的定义顺序与表1一致。由于本实验中由SYBYL中构建好的直接导入的抑制8剂分子已经经过优化处理，所以在TSAR中不再进行几何优化。242抑制剂分子结
34、构参数的计算本次实验用TSAR33计算抑制剂分子结构的各种理化性质，包括下述描述子描述分子性质的如分子质量、表面积、体积、惯性矩、VERLOOP参数、偶极矩、分子连接性指数、分子形状指数、分子折射、亲脂性和亲酯参数等；描述分子的连接性指数、形状指数、拓扑指数、电拓扑指数；由半经验分子轨道程序VAMP计算出的静电性质（包括总电荷、静电能、原子电荷等等）与结构优化（包括真空、溶液中单点能量优化）等等。由于计算的参数类型多达168，故不一一列举。3结果与分析31抑制剂分子对接的活性构象及分析由GOLD50软件执行的抑制剂与CDK4的柔性对接其对接结果可参见图3。图中所示为28号小分子抑制剂与CDK4
35、的ATP结合口袋对接模式。观察此图可以发现，28号小分子已经结合到CDK4的ATP口袋内部，而且抑制剂分子的公共骨架的两个母环朝向口袋的内侧，4AMINOMETHYLPHENYL取代基位于ATP口袋的出口处。图328号抑制剂与CDK4的ATP口袋结合模式图FIGURE3BINDINGMODELOFTHEDOCKEDNUMBER28INHIBITORINTHEATPPOCKETOFCDK49图4抑制剂与CDK4的分子对接模式FIGURE4DOCKINGMODELOFTHEINHIBITORWITHCDK4MOLECULAR图4所示为28号小分子与CDK4的ATP口袋的具体作用模式图。从图中不仅可
36、以观察到28号小分子与CDK4结合时的有效构象，而且可以看到抑制剂与ATP口袋形成氢键以及整个口袋的大致的趋向。小分子抑制剂分别与CDK4的93位VAL分子骨架上羰基氧原子以及氨基氮原子形成二个氢键。正如GOLD软件所设置的氢键限制一样，可以看到上图中该28号抑制剂分子的构象比较合理可以作为模拟CDK4结合的合理的抑制剂活性构象，并可以作为其余抑制剂小分子构建时的参考模板。323DQSAR模型及分析3213DQSAR模型本次实验获得的3DQSAR模型即COMFA模型，结果理想。由COMFA模型得出的关于该CDK4小分子抑制剂的计算值与残差见表2。该预测模型其统计学参数最优主成分数为6，交叉验证
37、系数Q2为0740（一般情况下认为Q206就意味着模型很好，具有很强的预测能力）；非交叉验证系数R2为0971，F157047，SEE0140。在本文的COMFA模型中，其立体场的贡献是3133而静电场的贡献是1948，二者百分比比值为617/383。表2实测值与模型给出的计算值与残差值表TABLE2ACTUAL,CALCULATEDANDRESIDUALVALUESOFCOMFAMODELNOACTUALCOMFACALCULATEDRESIDUAL125842482010222159210900503378134780303453421127635151193009400836205325
38、36048310续表2NOACTUALCOMFACALCULATEDRESIDUAL717751729004681886184400029252826260098102732283701051130933153006012132799287128192837002000341425392596005715279428080014162567247400931727962776002018276228080046192031523818318237650030005321338233260056222989292800612325582598004024292928610068254150390
39、1024926367838290151274152423300812842094174003529396940940125303627350701203135803565001532369137690078333435403239842706398439882696004800040010COMFA预测模型的三维等值线图参见图5、6，同时显示了立体场与静电场信息，并且可以选中任意的点通过该图显示相应的分子场信息，便于抑制剂小分子有效结构的改造。图中，绿色区域代表若是在该处有大体积的取代基则能够增强抑制剂活性；黄色区域代表该处需要小体积的取代基才利于增强抑制剂活性；红色区域代表该区域需要增加负电
40、荷以提高活性；而蓝色区域代表在该区域增加正电荷可以提高抑制剂活性18,19。11图5抑制剂的立体场等值线图图6抑制剂的静电场等值线图FIGURE5STERICCONTOUROFTHEINHIBITORFIGURE6ELECTROSTATICCONTOUROFTHEINHIBITORCOMFA模型关于对35个CDK4小分子其抑制CDK4活性的预测值与实际观测值之间的相关图见下图7。10152025303540451015202530354045CALCULATEDPIC50ACTUALPIC50图73DQSAR模型的实测值与计算值相关关系图FIGURE7COMPARISONOFTHEACTUAL
41、VALUESWITHCALCULATEDVALUESOF3DQSARMODEL3223DQSAR模型分析如立体场三维等值线图5所示，图中为28号分子（其抑制剂活性最好），其上方的绿色区域（位于R4取代基区域）引入大体积的取代基后可使抑制剂活性提高，正如27、29、33、34号等分子在此处的支链较大活性也相对其他分子有提高。图中黄色区域（R2、R4取代基变化的区域）减小取代基空间位阻可使抑制剂分子活性提升，例如13号分子正因为此处为五元环取代基FRANYL的折叠构象具有空间位阻而使其活性不高，而活性最高的28号分子在此处正是位阻小。此外图中右下方的绿色色块（R1取代基区域）提示此处引入大体积取代
42、基后也能提高抑制剂活性，这也正如文献7所报道的（即此处引入异丙基、叔丁基后其CDK4的抑制活性得到提升）。观察静电场等值线图6，发现对于公共骨架之外的4个不同取代基对抑制剂活性的影响情况来说，只有R4取代基的变化与CDK4抑制剂的静电场变化最相关。图中28号分子的上方蓝色色块提示此处增加正电荷能够提升抑制剂活性，例如29、33、34号等分子其活性相对有提升。图中2个红色色块提示该12处应增大负电荷以提高抑制剂活性，例如具有较高活性的25、27、29、33、34号抑制剂分子在此处不带电荷。值得注意的是，考虑到在红色色块处28号分子其上的伯胺带正电荷，因此可以考虑在进一步改造活性最好的28号小分子
43、结构时此处不带电荷的处理。此外，图中间的一个蓝色色块提示此处也应增加正电荷以提高活性。综合立体场、静电场的两张图可以发现，R3取代基处的变化并没有显示出相关的静电场、立体场信息也即暗示此处取代基的改变对活性的提高没有更多的影响，而针对R1、R2、R4等3个取代基的进一步改造对于提高CDK4抑制剂活性更有价值。观察COMFA模型给出的抑制剂分子的活性预测值与实际值的相关图，可以看出预测值与实际值很接近，而且结合该模型的Q2（0740），R2（0971）更说明该3DQSAR模型质量佳，能够预测并提供该腙类CDK4抑制剂衍生物分子结构的进一步改造的侧重点信息。332DQSAR模型及分析3312DQS
44、AR模型由TSAR计算的参数通过与抑制剂分子的活性建立相关，就可建立相应的2DQSAR模型。用TSAR进行多元线性回归MLR，通过交叉验证（选择LEAVEONEOUT）求出相应的系数即Q2，通过非交叉验证获得相应的系数R2。文献14,20认为上述的诸多关于抑制剂的结构参数中若有两种参数其相关性大于7时，那么二者具有较大自相关，应只保留其中最大相关性的参数进行后续的分析及模型质量的考察。综上，经多元线性回归分析之后，获得下述2DQSAR模型PIC500531X10962X20592X30925X400495X50136X6192X70452X8000723X9000102X10305；N35，R
45、20978，Q20683，S0130，F10917。上述方程中相应的XN代表的参数及其意义可参见表3所示，而计算值与实测值的相关图参见图8。表32DQSAR模型方程中XN代表所代表的参数及意义TABLE3PARAMETERSANDIMPLICATIONSOFTHEXNIN2DQSARMODELEQUATIONXN参数意义X1X2VERLOOPL参数R2取代基VERLOOPB1参数R4取代基多维立体参数（STERIMOLPARAMETER）的长度参数L解释R2取代基长度大小多维立体参数的四个宽度参数（B1,B2,B3,B4）中B1参数，解释R4取代基宽度大小X3VERLOOPB2参数R1取代基多
46、维立体参数的宽度参数中的B2参数，解释R1取代基宽度大小X4VERLOOPB3参数R1取代基多维立体参数的宽度参数中B3参数，解释R1取代基宽度大小X5DIPOLEMOMENTXCOMPONENTR4取代基R4取代基的X向量偶极矩大小X6ROTATABLEBONDSR4取代基R4取代基的可旋转键数目X7IPSOATOMESTATE指数IPSO原子的电性拓扑指数X9VAMPQUADPOLEXX全分子由VAMP计算的全分子四极场XX的静电能X10VAMPQUADPOLEYYY全分子由VAMP计算的全分子四极场YYY的静电能133322DQSAR模型分析对于上述2DQSAR模型的质量优劣是以相应的验
47、证系数来衡量，仍旧是Q2，R2。该模型交叉验证系数Q20683，说明由TSAR构建的2DQSAR模型预测能力已经很不错，而非交叉验证系数R20978，也说明该模型拟合程度比较理想。因此，该模型也说明本实验研究的腙类CDK4抑制剂本身分子结构中所蕴含着的各类信息能够解释抑制剂分子的结构与活性之间的关系，特别是R4取代基的性质对于抑制剂活性的影响相对其他取代基较多。此外，本实验的2DQSAR模型提示对于改造小分子结构以进一步提高CDK4抑制剂活性，可以从以下方面考虑减小R2取代基的VERLOOPL参数，R4取代基的VERLOOPB1参数、DIPOLEMOMENTXCOMPONENT、全分子的VAM
48、PQUADPOLEXX参数、VAMPQUADPOLEYYY参数；增加R1取代基的VERLOOPB2参数，R4取代基的ROTATABLEBONDS参数，全分子的IPSOATOMESTATE指数、5MEMBEREDAROMATICRINGS参数。10152025303540451015202530354045CALCULATEDPIC50ACTUALPIC50图82DQSAR模型的实测值与计算值相关图FIGURE8COMPARISONOFTHEACTUALVALUESWITHCALCULATEDVALUESOF2DQSARMODEL4讨论本实验所研究的CDK4抑制剂，噻吩并2,3D嘧啶4腙类衍生物
49、，以分子对接所得到的28号小分子抑制剂的活性构象为模板而构建的其余34个小分子抑制剂经过COMFA计算以及TSAR计算而分别构建的3DQSAR与2DQSAR模型都得到较为理想的结果。其中，通过GOLD50软件而进行的28号小分子与CDK4的ATP口袋的分子对接获得了对接较为合理的小分子抑制剂的构象。这对于后续的3DQSAR的COMFA建模很关键，直接影响到建立的模型的质量，影响到模型能否真实的反应出该类抑制剂其三维空间结构与生物活性的关系。而后续的建模结果证实，上述的分子对接结果确实较为合理以及理想。3DQSAR模型的评价指标Q2为0740，R2为0971；2DQSAR模型的评价指标Q2为0683，R2为0978。其中Q206时，说明该模型预测能力已经很好，而R2越大则说明模型拟合程度越好。通过综合考虑上述二个模型，可以发现由COMFA得到的3DQSAR模型质量优于TSAR构建的2DQSAR模型，与一般文献所提示的三维定量构效关系模型要优于二维定量构效关系模型的结论相符合，也合理的解释了当前3DQSAR建模不断发展并在一定程度上取代经典的2DQSAR建模的重要原因11。不过，本实验获得的143DQSAR模型与2DQSAR模型都具有较强的预测能力，可以用于指导该腙类CDK4抑制剂衍生物分子结构的进一步修饰与改造。二个模型一致提示该抑制剂分子的R3取代基的变化对于进一步
