1、毕业论文开题报告海洋生物资源与环境鲈鱼CD4基因的CDNA克隆一、选题的背景与意义鲈鱼（LATEOLABRAXJAPONICUS）属鲈形目，鮨科，花鲈属，是我国重要的海水养殖经济鱼类。近年来，随着鲈鱼养殖业的迅猛发展，养殖密度日益扩大，鱼体免疫能力逐渐下降，发病率日趋提高，造成严重的经济损失。鱼类的免疫系统日益为人所关注，对鱼类免疫系统的研究不仅为高等生物免疫演化途径提供重要的参考,同时也为日趋严重的养殖鱼类的病害防治提供必要的免疫理论与应用基础。鱼类主要的免疫细胞包括淋巴细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、血栓细胞、树突状细胞DC、黑色素巨噬细胞等。淋巴细胞是机体免疫应答功能的重要细胞成分，其中T
2、淋巴细胞介导细胞性免疫。T淋巴细胞中，CD4主要表达于辅助T（TH）细胞，是TH细胞T细胞抗原受体（TCELLRECEPTORTCR）识别抗原的共受体，与MHC类分子的非多肽区结合，参与TH细胞TCR识别抗原的信号转导。近年来在鱼类免疫相关基因方面进展迅速,已经克隆出包括牙鲆、虹鳟、鲫鱼、斑马鱼等多种鱼类的T细胞表达的主要基因,如TCR包括、IKAROST细胞早期表达的转录因子、P56LCKT细胞特异性激酶、MHCI/II、CD3、CD4、CD8等KUROBET,ETAL2005,LANGENAUDM,ETAL2005,TAYLORAIS,ETAL2005,BUONOCOREF,ETAL200
3、6,CUESTAA,ETAL2006。但目前国内对于这些基因研究不多，对CD4基因的研究更少。该实验以鲈鱼为实验材料，对其CD4基因进行克隆，增加关于鲈鱼T细胞免疫应答的新的了解，以期为鱼类的免疫系统研究做一点基础。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题内容本研究通过提取鲈鱼肾脏等组织中RNA，逆转录成CDNA，设计兼并引物，对该基因进行PCR克隆从而得到该基因的核心序列。为以后CD4基因分析、表达，鉴别真骨鱼类的T细胞亚群、鱼类养殖抗病做基础研究。拟解决问题有实验前鲈鱼培养条件，RNA提取过程中出现的污染情况，PCR克隆最优条件的确定及琼脂糖凝胶电泳时胶体的浓度等。三、研究的方法与技术路线1鲈
4、鱼各组织获得鲈鱼中取出肌肉、肝脏、心脏、脑、肾脏、皮肤、肠组织迅速放入80冰箱中待用。2RNA的提取将组织从80冰箱中取出，放在冰上解冻，待组织解冻后，用DEPC泡过的剪刀剪一小块组织于EP管中，剪碎组织。A分层取50100MG组织（新鲜或70及液氮中保存的组织均可）置15ML离心管中，加入1MLTRIZOL充分匀浆，室温静置MIN，使样品充分裂解；每1MLTRIZOL加入200L氯仿，剧烈振荡混匀后室温放置35MIN使其自然分相。BRNA沉淀412,000RPM离心1015MIN。样品会分成三层黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中；在上清中加入等体积冰冷的
5、异丙醇，室温放置1020MIN。412,000RPM离心10MIN，弃上清，RNA沉淀于管底。CRNA漂洗RNA沉淀中加入1ML75乙醇（用RNASEFREE水配制），温和振荡离心管，悬浮沉淀。每1MLTRIZOL加入1ML75乙醇；45,0008,000RPM离心12MIN，弃上清；短暂快速离心，用移液器小心吸弃上清，注意不要吸弃沉淀。室温放置12MIN晾干沉淀。D溶解RNA沉淀中加入50100LRNASEFREE水，轻弹管壁，以充分溶解RNA。3设计引物主要通过软件BIOEDIT和PRIMER50来完成。4RNA逆转录成CDNA在EP管中加入2L的RNA，1L上游引物、1L下游引物，1L的
6、反转录酶和1L的OLIGODT，加入蒸馏水至体系共20L。于42反应1H。5通过聚合酶链式反应（PCR）扩增PCR体系（50L）DDH2O345LBUFFER5LDNTP4LF13LR13LTAQ酶05L模板05L6将PCR产物取5L进行琼脂糖凝胶电泳，若条带符合大小则切胶回收（用试剂盒）。7切胶回收的产物连接上载体，转化到感受态细胞中，涂板，37过夜培养。8测序9结果分析四、研究的总体安排与进度2010年910月预实验2010年12月实验前期准备1查询中英文资料、文献2翻译2篇外文文献3撰写综述2011年13月进行试验1RNA提取2引物设计3CDNA提取4PCR克隆5送公司测序2011年3月
7、撰写论文1实验数据整理、分析2完成论文初稿并交指导老师修改2011年5月准备答辩1完成论文正稿2准备毕业答辩五、主要参考文献1VANDERSARAM,APPELMELKBJ,VANDERBROUKEGRAULSCM,BITTERWASTARWITHSTRIPESZEBRAFISHASANINFECTIONMODELTRENDSMICROBIOL200412451E72CROUCHSPM,KOZLOWSKIR,SLATERKJ,FLETCHERJTHEUSEOFATPBIOLUMINESCENCEASAMEASUREOFCELLPROLIFERATIONANDCYTOTOXICITYJIMMUN
8、OLMETH199316081E83CAINKD,LAPATRASE,SHEWMAKERB,JONESJ,BYRNEKM,RISTOWSSIMMUNOGENICITYOFARECOMBINANTINFECTIOUSHEMATOPOIETICNECROSISVIRUSGLYCOPROTEINPRODUCEDININSECTCELLSDISAQUATORGAN19993667E724TAFALLAC,COLLJ,SECOMBESCJEXPRESSIONOFGENESRELATEDTOTHEEARLYIMMUNERESPONSEINRAINBOWTROUTONCORHYNCHUSMYKISSAFTE
9、RVIRALHAEMORRHAGICSEPTICEMIAVIRUSVHSVINFECTIONDEVCOMPIMMUNOL200529615E265BROCKMANMA,KWONDS,TIGHEDP,PAVLIKDF,ROSATOPC,SELAJ,ETALIL10ISUPREGULATEDINMULTIPLECELLTYPESDURINGVIREMICHIVINFECTIONANDREVERSIBLYINHIBITSVIRUSSPECIFICTCELLSBLOOD2009114346E566TREDENS,LANGENAUDM,TRAVERD,LOOKAT,ZONLITHEUSEOFZEBRAF
10、ISHTOUNDERSTANDIMMUNITYIMMUNITY200420367E797DAVISMMNATURE，1988，3343954028LANGENAUDM,ZONLITHEZEBRAFISHANEWMODELOFTCELLANDTHYMICDEVELOPMENTNATREVIMMUNOL20055307E179SCAPIGLIATIG,ROMANON,ABELLILMONOCLONALANTIBODIESINTELEOSTFISHIMMUNOLOGYIDENTIFICATION,ONTOGENYANDACTIVITYOFTANDBLYMPHOCYTESAQUACULTURE1999
11、1723E2810SCAPIGLIATIG,MAZZINIM,MASTROLIAL,ROMANON,ABELLILPRODUCTIONANDCHARACTERISATIONOFAMONOCLONALANTIBODYAGAINSTTHETHYMOCYTESOFTHESEABASSDICENTRARCHUSLABRAXLTELEOSTEA,PERCICTHYDAEFISHSHELLFISHIMMUNOL19955393E40511王卫卫,等硬骨鱼免疫系统的组成与免疫应答机制研究进展海洋科学进展201028225826212WALYN,GRUFFYDDJONESTJ,STOKESCR,DAYMJTH
12、EDISTRIBUTIONOFLEUCOCYTESUBSETSINTHESMALLINTESTINEOFHEALTHYCATSJCOMPPATHOL20011241728213TISCHENDORFFONTHEEVOLUTIONOFTHESPLEENEXPERIENTIA1985411455214GRACEMF,MANNINGMJHISTOGENESISOFTHELYMPHOIDORGANSINRAINBOWTROUT,SALMOGAIRDNERIRICH1836DEVCOMPIMMUNOL198042556415ZAPATAAG,CHIBAA,VARASACELLANDTISSUESOFTH
13、EIMMUNESYSTEMOFFISHINIWAMAG,NAKANISHIT,EDITORSTHEFISHIMMUNESYSTEMSANDIEGOACADEMICPRESS1996P16216BOEHMT,GONZALEZSARMIENTOR,KENNEDYM,RABBITTSTHASIMPLETECHNIQUEFORGENERATINGPROBESFORRNAINSITUHYBRIDIZATIONANADJUNCTTOGENOMEMAPPINGEXEMPLIFIEDBYTHERAG1/RAG2GENECLUSTERPROCNATLACADSCIUSA19918839273117FISHELS
14、ONLCYTOLOGICALANDMORPHOLOGICALONTOGENESISANDINVOLUTIONOFTHETHYMUSINCICHLIDFISHESCICHLIDAE,TELEOSTEIJMORPHOL19952231759018ROMANON,TAVERNETHIELEAJ,FANELLIM,BALDASSINIMR,ABELLIL,MASTROLIAL,VANMUISWINKELWB,ROMBOUTJHONTOGENYOFTHETHYMUSINATELEOSTFISH,CYPRINUSCARPIOLDEVELOPINGTHYMOCYTESINTHEEPITHELIALMICRO
15、ENVIRONMENTDEVCOMPIMMUNOL1999231233719ZAPATAALYMPHOIDORGANSOFTELEOSTFISHIULTRASTRUCTUREOFTHETHYMUSOFRUTILUSRUTILUSDEVCOMPIMMUNOL198154273620LAMSH,CHUAHL,GONGZ,WENZ,LAMTJ,SINYMMORPHOLOGICTRANSFORMATIONOFTHETHYMUSINDEVELOPINGZEBRAFISHDEVDYN2002225879421谢海侠,聂品鱼类胸腺研究进展水产学报20032271929322WESTERFIELDMTHEZE
16、BRAFISHBOOKAGUIDEFORTHELABORATORYUSEOFZEBRAFISH,3EDEUGENE,ORTHEUNIVERSITYOFOREGONPRESS199523LINKBA,GRAYMP,SMITHRS,JOHNSWINTRAOCULARPRESSUREINZEBRASHCOMPARISONOFINBREDSTRAINSANDIDENTICATIONOFAREDUCEDMELANINMUTANTWITHRAISEDIOPINVESTOPHTHALMOLVISSCI2004454415E2224TREDENS,LANGENAUDM,TRAVERD,LOOKAT,ZONLITHEUSEOFZEBRASHTOUNDERSTANDIMMUNITYIMMUNITY200420367E7925VANDERSARAM,APPELMELKBJ,VANDERBROUKEGRAULSCM,BITTERWASTARWITHSTRIPESZEBRASHASANINFECTIONMODELTRENDSMICROBIOL200412451E7
