1、毕业论文开题报告海洋生物资源与环境一株海水光合细菌的分离鉴定及在轮虫增养殖的应用一、选题的背景与意义光合细菌PHOTOSYNTHETICBACTERIA简称PSB，是地球上最早出现的具有原始光能合成体系的原核生物。光合细菌属于水圈微生物的一种，光合细菌广泛分布于地球生物圈的各处，无论是海洋、湖泊、江河，还是水田、池塘、沼泽、污泥、氧化池、硫磺泉、土壤、极地，甚至在90的温泉中、在300的盐湖里、在深达2000M的深海、在南极冰封的海岸上，都能找到其踪迹。光合细菌具有多种生理功能，代谢类型极为多样，有光能自养、异养和混养多种营养生长方式，具有光合、固碳、降解大分子有机物、固氮、脱氮、硝化、反硝化
2、、硫化物氧化等代谢方式，光合细菌进行光合作用一般是在厌氧光照条件下，以简单的有机物为供氢体，固定CO2进行光合磷酸化和光氧化还原反应。而在好氧黑暗条件下，光合色素的合成受到抑制，胞内缺少内质膜系统，则和好氧型微生物一样，通过氧化磷酸化获取能量，另外还可通过脱氮或发酵获得能量，光合细菌对简单碳化物代谢具有很大的多样性，它也许是自然界发现的营养代谢类型最丰富的微生物之一。因固氮酶的存在而具有固氮能力，光合细菌对氮源的利用较广，一般均可利用铵盐、氨基氮，少数种类还能利用硝酸盐和尿素。这种随着生长条件的变化而灵活地改变代谢类型的特性与其他光合生物一起构成了自然界生态系统的原始生产者，在自然界物质转化和
3、能量循环中起着重要的作用。在鱼类、甲壳类的人工育苗生产中,需供给动物性活饵料。我国自20世纪50年代后期开始，先后开展了轮虫、卤虫、双壳类的卵和幼体、糠虾等动物性饵料的培养和生产。其中轮虫作为鱼、虾、蟹等幼体的开口饵料，其适口性、可得性、营养价值及饲养效果均优于其他饵料，而且轮虫适应性强、生长快、繁殖迅速、培养成本低，极易在生产实践中推广应用。尽管人工微粒饵料的使用越来越多，但作为生物饵料，轮虫在控制水质、提高幼体成活率等方面具有明显的优势。影响轮虫高密度增殖的主要因素为饵料、氧、氨氮的积累和残饵、粪便等代谢产物。在轮虫培养中，随着种群密度的增大，轮虫分泌和水中有机质分解产生的氨将积累到相当浓
4、度，并产生明显的毒性，这些悬浮物有机质还会堵塞回收轮虫用的浮游生物网，不仅阻碍轮虫的回收和清洗，而且伴随着这些轮虫的投喂，还成为了仔、稚鱼疾病的病因。这些有机质更成为细菌的营养源而繁殖出大量的以弧菌、不动杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、霍乱菌、巴氏杆菌、水中产气单胞菌等为优势菌的菌群，严重影响了轮虫的培养，更使轮虫的品质下降。鉴于光合细菌的这些特性以及轮虫增养殖中存在的问题，通过选择合适的光合细菌和确定合适的菌液添加剂量，形成优势菌群，以消耗残饵、粪便等代谢产物，减少氨氮的产生并消耗产生的氨氮。并且在消耗这些阻碍轮虫培养的物质的同时，产生的菌体可以作为轮虫的优质饵料，以使轮虫培养过程中密度、生产力和生
5、产效率都有明显的提高。这一研究结合了当前水产养殖育苗业的发展现状，有助于解决一些实际问题，产生巨大的经济效益，对水产养殖业的发展有积极影响。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题基本内容1光合细菌的分离纯化；2光合细菌基本特性研究；3光合细菌生理特性的研究；4光合细菌16SRDNA测序及其系统发育分析；5褶皱臂尾轮虫的实验室训化；6光合细菌对轮虫增养殖的影响研究；7光合细菌应用于轮虫培养的最佳配比探索；8光合细菌应用于轮虫增养殖的前景探讨。拟解决的主要问题通过本课题完成海水光合细菌的分离鉴定，得到其应用于轮虫增养殖的实际数据，为其在水产养殖育苗方面的应用理论依据。三、研究的方法与技术路线一研究方
6、法1光合细菌的富集样品的采集按照海洋调查规范国家海洋局,1975的要求进行。应用深水采样器采集养殖池海水。应用采泥器采集表层泥样，分别取水样1ML、泥样1G于螺口厌氧管中，加灭过菌的液体培养基至满，拧上螺口帽，混匀。带回实验室，放入32光照强度为30005000LUX的培养箱培养。光下培养约515天，待有红色、粉色、黄色或褐色生长物明显生长后，再连续转接多次以求培养液中光合细菌占优势，待进一步分离。泥样取自浙江宁波的象山、北仑、宁海等地的海水养殖塘，培养基为AT基础培养基。2光合细菌的纯化和鉴定21光合细菌纯化本次实验采用多种方法纯化菌种至DGGE检验出现单一稳定的条带，挑取单菌落接种到扩繁培
7、养基中扩大培养，视纯化效果多次分离纯化3代或更多代，镜检无异常方初步认为纯种。22DNA模板的制备传统法提DNA（LILETAL,1999）或者用基因组DNA快速提取法将收集的菌体细胞用无菌PCR用水悬浮，在沸水浴中煮1015MIN，随后离心，取上清液直接作为PCR扩增的DNA模板。23细菌16SRRNA基因V3区的PCR扩增采用对大多数细菌的16SRRNA基因V3区具有特异性的引物对（1）引物341FGC5CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCTACGGGAGGCAGCAG3518R5ATTACCGCGGCTGCTGG3扩增产物长约230BP用于D
8、GGE分析。（2）PCR反应体系模板25NG；引物4MOL/L；DNTP200MOL/L；10BUFFER25L；MGC1215MMOL/L；DNA聚合酶075U；补双蒸水到25L。（3）PCR反应条件采用降落PCR，94预变性5MIN；前10个循环为9430S，656030S，7230S（其中每个循环后复性温度下降05）；后18个循环为9430S，6030S，7230S；最后72延伸5MIN。24琼脂糖凝胶电泳取5LPCR产物进行15的琼脂糖凝胶电泳，20MIN后观察结果，然后利用FR复日紫外/可见光分析生物凝胶成像系统进行拍照。25变性梯度凝胶电泳与银染参照MUYZER（1993）等人方法
9、，PCR产物加入到10（WT/VOL）聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶的变性范围为4065。利用BIORAD公司的DCODESYSTEM电泳仪，在55、180V条件下，采用1TAEBUFFER电泳300MIN，然后常规银染显色。2616SRDNA克隆文库的构建（1）将活化好的CP3菌液离心收集菌体。（2）用溶菌酶SDS裂解菌体细胞，再用酚氯仿提取DNA。（3）用细菌16SRDNA通用性引物27F和1541R对所提取得DNA进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后再进行切胶回收，用UNIQ10柱式通用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。（4）将回收后的扩增产物与PMD18载体相连接，然后转化入大肠杆菌中，扩繁，在
10、含有氨苄青霉素和XGAL的LB琼脂培养基上选择具有氨苄青霉素抗性的白色转化子。（5）随机挑取60个阳性克隆提取质粒，质粒提取参照文献SAITOUNETAL,1997。用341FGC与518R扩增，再用DGGE对扩增产物进行筛选，确定DGGE胶上不同带型的数量和代表性克隆。（6）将选取出来的代表性克隆送上海生工测序。3光合细菌培养条件的优化从碳源利用、氮源、无机电子供体利用、维生素需求、耐盐性、最佳酸碱度范围、生长速度等方面描述试验菌株。每个水平均做三个重复，在SPDJ系列水平净化工作台上接种，之后在RXZ300B人工气候箱内，282培养；OD值测定时以蒸馏水为空白对照，所测菌液以蒸馏水稀释四倍
11、，培养基同样以蒸馏水为空白对照测得OD值，最终实际OD值菌液OD值培养基的OD值。4饵料的准备小球藻取自宁波大学藻种室，用灭菌海水加小球藻3号营养液进行实验室培养；面包酵母取于高泥育苗场，用300目纱布过滤到烧杯（盛海水）中，取过滤得到的溶解液投喂轮虫。5褶皱臂尾轮虫的获得以及训化实验中用到的褶皱臂尾轮虫可采于宁波象山高泥育苗场，在实验室条件下用面包酵母和海水小球藻投喂，查阅相关书籍和文献，探索轮虫生长最佳条件，达到驯化的目的。6光合细菌应用于轮虫增养殖的研究取生长旺盛期的光合细菌培养液，8000R/MIN条件下常温离心3分钟，弃去上清液，保留菌体。把菌体加入轮虫培养液，观察轮虫生长情况并技术
12、。试验中添加不同剂量的光合细菌作为对照，相同剂量处理时设置平行，其他条件都相同。根据实验数据求得光合细菌最佳配比。二技术路线四、研究的总体安排与进度201011毕业论文选题。20101112制定研究计划和实验方案201012开题答辩与综述。20101220111实验相关仪器的采购，实验计划的进一步修改和完善。2011120114实验的具体操作以及两篇外文文献的翻译。201134数据和材料整理、分析。201145论文撰写、提交并答辩。褶皱臂尾轮虫海水的过滤、消毒饵料（小球藻、酵母菌）的准备500ML锥形瓶中海水培养小球藻光合细菌选取及纯化培养轮虫定量接种于培养有定浓度小球藻的海水加入不同剂量的光
13、合菌，设置对照观察培养，轮虫计数，增殖率，成活率数据整理，得到结论光合细菌培养条件的优化件的优化采集环境水样实验室训化菌剂的推广应用环境中光合细菌的富集、分离及鉴定五、主要参考文献1成永旭,蒋霞敏,张德民,等生物饵料培养学M中国农业出版社,20052孙东红,邹宁,赵红庆,李晓娜褶皱臂尾轮虫的培养研究中国水产,2005,471743张德民紫色非硫细菌多相分类及分子生态学研究M博士论文,19984MADIGANMT,ANDJGORMERODTAXONOMY,PHYSIOLOGYANDECOLOGYOFHELIOBACTERIA,INBLANKENSHIPROBERTE,MTMADIGANANDCE
14、BAUER,ED,ANOXYGENICPHOTOSYNTHETICBACTERIAJ,KLUERACADEMICPUBLISHERS1995,217295魏玉利光合细菌的培养及应用J生命科学仪器,2007,327306王桂文,周兴,李海鹰光合细菌的应用现状与前景J广西科学院学报,1995,11116207崔战利光合细菌的基本特性及应用价值J黑龙江八一农垦大学学报,1999,11120258沈萍微生物学M北京高等教育出版社,20009HUGENHOLTZPHILIP,PITULLECHRISTIANETALNOVELDICISIONLEVELBACTERIALDIVERSITYINAYELLOW
15、STONEHOTSPRINGJBACTERIOL,1998,180236637610许兵,丁明宇,毛景华,徐怀恕光合细菌对褶皱臂尾轮虫的饵料价值海洋湖泽通报,199211王鉴,祝国芹不同浓度的光合细菌对轮虫繁殖的影响水产科学,200412WANGYOUZHI,WANGFENGJUN,BAOLITREATMENTOFCHINESETRADITIONALMEDICINEWASTEWATERBYPHOTOSYNTHETICBACTERIAJOURNALOFNORTHEASTAGRICULTURALUNIVERSITY2005,121374113刘勇,张德咏光合细菌PSB1菌株的分离鉴定及其生物学特性
16、的研究J生命科学研究,2000,4423363314施安辉,李桂杰,徐海燕,等光合细菌菌种的分离、富集培养、纯化和菌种鉴定及净化水质的研究J内陆水产,2002,10404115宋志文,席俊秀,张锡一株光合细菌的分离筛选及对污水的净化效果J青岛建筑工程学院学报,2004,254636616刘建红,张肇铭光合细菌处理垃圾渗滤液静态试验研究J太原师范学院学报,2003,23666817穆军,章非娟,黄翔峰等厌氧酸化好氧光合细菌法处理含硫酸盐高浓度有机废水J中国环境科学,2005,25330230518王玉芬,张肇铭等光合细菌球形红细菌厌氧降解氯代苯J中国环境科学,2007,27111111519李乐
17、,李兰生等固定化光合细菌降解氧化乐果J农业环境科学学报,2006,25增刊72172420史国富,张肖洪光合细菌与中药制药结合康强胶囊的应用研究J山西中医学院学报,2003,43151621王锦,刘清俊,张肖渺康强硒在恶性肿瘤治疗中的作用J山西医药杂志,1998,271767722罗源华，刘勇,张德咏等一株降解甲氰菊酯的光合细菌的分离鉴定及其降解酶初步分析J天津农业科学，200923吴向华,杨启银,刘五星,等一株沼泽红假单胞菌的分离与鉴定J环境与健康杂志,2004,21210110324黄志勇,王海胜,蒋培霞,等几株光合细菌的分离鉴定及在养殖罗非鱼中的应用J微生物学通报,2005,324727825陈繁忠，朱好根利用光合细菌处理养猪场污水的试验研究J环境工程,2000,1851012
