1、 本科学生实验报告 学号： 124120463 姓 名： 学院： 生命科学学院 专业、班级： 12级生物技术班 实验课程名称： 酶工程实验一 教 师： 吴倩 云南师范大学教务处编印 实验一 淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 一、目的要求 1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。 2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。 二、基本原理 （一）淀粉酶产生菌的分离 1.菌种的采集 要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。 胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。
2、 2.富集培养 原理：采集 到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。 富集的方法：控制培养的温度、 pH和营养成分等。 3.菌种的分离 淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。 淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。 （二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与 3， 5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内 ，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在 540n
3、m 进行测定。 2.酶活定义：在一定 pH5.5、 37条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1 mol 葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位 U/g。 酶活计算公式 ： 酶活（ U/g） =A 5 K N 1000/（ T W） A:样品的 OD 值 (平 均值 ) K:标准曲线的斜率 N:稀释倍数 5:0.2 毫升反应液转换为 1 毫升体积 T:反应时间（ min） 1000:转换因子 1mmol=1000mol W:葡萄糖的分子量（ 180.2g/mol） 3 绘制标准曲线 先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度 A。 以 A 为横坐标，浓度
4、c 为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。 然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量 三、器材 1试剂 : 可溶性淀粉、碘、碘化钾、 HCl、柠檬酸、 Na2HPO412H2O 等 2培养基 : 分离、纯化培养基 3仪器 : 平皿、 三角瓶 、大试管、 1mL和 10mL移液枪、涂棒； 天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。 四、操作步骤 （一）淀粉酶产生菌的分离 1.培养基的配制及灭菌 倒平板配制分离培养基 高压灭菌 30min 冷却至约 50 倒
5、 7块平板 /140mL 冷却备用 2.制备土壤稀释液 称取土样 1g，放入 9mL无菌水试管中，摇动 10min，静置 10min,制备得到 10-1土壤稀释液； 用无菌吸管吸出 1mL 土壤悬液，加入盛有 9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到 10-2土壤稀释液； 再从中吸出 1mL加入盛有 9mL 无菌水的大试管中，混匀后得到 10-3 土壤稀释液； 以此类推，分别制备得到 10-4、 10-5、 10-6、 10-7土壤稀释液。 3.涂布 用无菌吸管分别吸取 10-3、 10-4、 10-5 、 10-6 和 10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌
6、玻璃涂棒涂匀。 4.培养纯化 挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板， 37倒置培养 2 3d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得 纯培养 )。 5.产淀粉酶微生物的鉴定 向平板内加入稀碘液数滴后进行观察 （二） 淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制 1.淀粉酶产生菌的发酵 分离培养基（ 140mL） 的配制： 可溶性淀粉 ： 0.7g 蛋白胨 ： 0.7g 酵母膏 ： 0.7g KH2PO4 : 0.07g MgSO47H2O :0.02g CaCl22H2O : 0.08g 琼脂 : 2.8g 配置发酵培养基 200mL/组（ 40mL/瓶） 将纯培养得到的（透明圈最大 的） 菌落接种于
7、发酵培养基中 30 150r/min 摇瓶发酵约72h。 2.葡萄糖标准曲线的制作 精确称取 0.100g 葡萄糖，用缓冲溶液定容至 100ml，制得浓度为 1mg/ml的葡萄糖的标准溶液。标准曲线如下图表所示： 葡萄糖标准溶液 体积（ ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 葡萄糖含量（ mg） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 缓冲液（ ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS (ml) 3 3 3 3 3 3 3 定容总体积 (ml) 15 15 15 15 15 15 15 OD（ 540nm） 待测酶液的制备
8、： a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件 4000 转 /5分钟，将离心后的上清液倾入试管中，稀释一定倍数测定其酶活力 b.底物溶液 2%淀粉溶液（需当天配置） 称取 2.0克可溶性淀粉，用约 80mL 缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解； 冷却，并用缓冲液定容至 100mL。 注： 如果测定所得 OD 值不在有效值（ 0.2-0.8）范围内，则相应地降低或增大 稀释倍数后再进行测定。 淀粉酶酶活测定方法 操作步骤 空白管 样品管 A 样品管 B 步骤 1 吸取 1.8mL 可溶性底物溶液 吸取 1.8mL可溶性底物溶液 吸取 1.8mL可溶性底物溶液 步骤 2 37保温 5分钟 37保温
9、 5分钟 37保温 5分钟 步骤 3 加入待测酶液 0.2毫升 加入待测酶液 0.2毫升 步骤 4 37精确保温 15min 37精确保温 15min 37精确保温15min 步骤 5 加入 3mLDNS 试剂终止反应 加入 3mLDNS 试剂终止反应 加入 3mLDNS试剂终止反应 步骤 6 混 合均匀 混合均匀 混合均匀 步骤 7 加入 0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸 5min 沸水浴煮沸 5min 沸水浴煮沸 5min 步骤 8 流水冷却 流水冷却 流水冷却 步骤 9 加蒸馏水 10mL，混匀 加蒸馏水 10mL，混匀 加蒸馏水 10mL，混匀 步骤 10 OD540nm 比色 OD54
10、0nm 比色 OD540nm 比色 五、 酶活测定注意事项 注： 1.试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； 2.移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或 DNS 时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸 取同一种溶液时可以不用更换枪头！ 3.精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； 4.避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时； 5.实验结果的记录与分析 六 、实验报告 （一）淀粉酶产生菌的分离 结果 筛选 结果 稀释 倍数 产淀粉酶菌落数 菌落形态 透明圈 大小 10-3 6 菌落疏松，呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状，大多为白色，有的为淡黄色和黑
11、色 1.1cm,1.0cm 0.9cm,0.8cm 0.5cm,3cm 10-4 1 绒毛状，圆形，白色 0.8cm 10-5 1 絮状，白色 0.9cm 10-6 1 絮状，淡黄色 0.5cm 10-7 0 （二） 葡萄糖标准曲线绘制 葡萄糖标准曲线的制作 编号 1 2 3 4 5 6 葡萄糖含量 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 OD（ 540nm） 0.084 0.285 0.491 0.718 0.922 1.133 糖化酶活力测定结果 编号 样品管 A 样品管 B OD（ 540nm） 0.332 0.289 糖化酶活力的计 算 葡萄糖标准曲线y = 0.9479x +
12、 0.126R2= 0.999800.20.40.60.811.21.40 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2OD葡萄糖含量（mg/ml）系列1线性 ( 系列1 )OD 的平均值 =（ A+B） /2=(0.332+0.289)/2=0.3105 根据酶活计算公式： 酶活（ U/g） =（ (A K+b) N 1000/（ T W） 5 A:样品的 OD 值 (平 均值 ) K:标准曲线的斜率 N:稀释倍数 5:0.2 毫升反应液转换为 1 毫升体积 T:反应时间（ min） 1000:转换因子 1mmol=1000mol W:葡萄糖的分子量（ 180.2g/mol） 代入数据可得 ：
13、 酶活（ U/g） =（ (A K+b) N 1000/（ T W） 5 =(0.3105 0.9479+0.126） 1 1000/(15 180.2) 5 = 0.7775 3、思考题：请你建立一个 “ 筛子 ” ，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。 答： 采集土样 (除土层表面枯枝、 杂草和砂石， 收集距表层 5cm10cm 土壤 ) 将 采集的土样进行 10 -1 10 -6 梯度稀释 后， 分别涂布于 改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板 初筛培养基上 ，在 30 的恒温箱中培养 3d，然 后观察 菌落周围 是否 形成透明 水解圈。 因为培养集中含有 水溶性较差的植酸钙，因而含植酸钙的平板上会呈现浑浊态。若菌株代谢产生植酸酶，植酸钙被酶降解， 在菌落周围形成透明 水解圈， 可起到一定指示作用。 此外可 选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等 4 种常用染色剂添加至平板初筛培养基中，在加深培养基 背景色的同时， 以增强植酸钙水解后形成的透明圈可见 性。
