1、血浆（ 1-3） - -D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的研究 赵勇 王红 任爱民 张淑文 张丽霞 首都医科大学附属北京友谊医院 100050 摘要： 目的： 观察 血浆（ 1-3） - -D-葡聚糖对深部真菌感染诊断的作用 。 方法：将 2005 年 8 月至 2006 年 6 月北京友谊医院 患者 145例（标本 182份）分为深部真菌感染组和无深部真菌感染组 , 分析比较两组葡聚糖水平；使用 ROC 曲线确定最佳临界值。 结果 ： 深部真菌感染组的葡聚糖水平 64.7 86.0（ 25.5） pg/ml 明显高于对照组6. 3 21.0（ 0.0） pg/ml（ P0.001）；血浆葡聚糖用
2、于诊断深部真菌感染的 ROC 曲线下面积为 0.887（ 95%的置信区间为 0.795-0.979），使用临界值 13.7pg/ml 诊断深部真菌感染的 敏感度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别为 88.9%、 90.2%、 50.0%和 98.7%； Kappa 值 0.588（ P0.05）。 结论： 血浆葡聚糖水平可用于诊断深部真菌感染，本研究使用 GKT-5M Set 动态真菌检测试剂盒检测血浆葡聚糖水平诊断深部真菌感染的最佳临界值为 13.7pg/ml，使用此临界值对深部真菌感染进行诊断的一致性较好。 关键词： 深部真菌感染；诊断； (1-3） - -D-葡聚糖； ROC曲线 E
3、valuation about diagnosis of invasive fungal infection with (1-3)- -D-glucan ZHAO Yong, WANG Hong , REN Aimin , ZHANG Shuwen, ZHANG Lixia. Beijing Capital University of Medical Sciences Affiliated Beijing Friendship Hospital , Beijing 100050 , China Abstract: Objective: To evaluate the diagnosis of
4、invasive fungal infection with (1-3)- -D-glucan(BG). Methods: 145 patients from Beijing Friendship Hospital were divided into two groups according to whether or not diagnosed as invasive fungal infection. Level of (1-3)- -D-glucan of two groups were compared. Optimal cut-off value was established wi
5、th ROC curve. Results: Patients diagnosed as invasive fungal infection have a higher level of BG than the control group. (P value 0.001) Area under curve(AUC) was 0.887 (95% confidence interval between 0.795 and 0.979) when level of BG was used to diagnose invasive fungal infection. The sensitivity,
6、 specificity, and positive and negative predictive values for BG were 88.9%、90.2%、 50.0% and 98.7%, respectively, with Kappa value of 0.588. Conclusion: Level of BG could be used for diagnosis of invasive fungal infection. Optimal cut-off value of plasma BG with GKT-5M Set for diagnosis of invasive
7、fungal infection should be 13.7 pg/ml and, with this cut-off value, agreement of evaluation of BG and criterion of invasive fungal infection for diagnosis of invasive fungal infection was good. Key words: invasive fungal infection; （ 1-3） - -D-glucan; diagnosis; ROC curve 随着免疫抑制患者的增多，临床中发生深部真菌感染的机会也
8、越来越多。一般来说，深部真菌感染通常发生于危重患者，对于这些患者的治疗是否成功很大程度上取决于是否能快速的识别入侵的病原。近年来出现一些快速诊断技术：如高分辨 CT（ HRCT）及象检测真菌抗原和核酸这样的非培养诊断技术。这些技术与 Prentice1提出的深部真菌感染危险分层相结合使得深部真菌感染早期诊断和及时治疗成为可能。其中通过检测体液中真菌抗原或代谢物来诊断深部真菌感染 的研究很多 2，其中之一就是关于真菌的细胞壁成分 （ 1-3） - -D-葡聚糖。 本研究的目的是比较这种新的深部真菌感染检测方法与传统实验室的培养方法之间的关系，评价如何可以更准确的诊断深部真菌感染。 1、材料与方法
9、 1.1 病例选择 北京友谊医院感染内科 2005 年 8 月至 2006 年 6 月住院肺炎患者以及感染内科会诊全院其他科室诊断为可能真菌感染的患者共 145例（其中男 88 例，女 57 例），平均年龄 65.1 岁（ 17-85 岁），其中诊断为真菌感染患者（真阳性）共 14 例，诊断标准按照欧洲肿瘤研究治疗组织（ EORTC） 深部真菌感染合作组（ IFICG）和国家过敏及感染类疾病研究所（ NIAID）真菌病研究组（ MSG）对深部真菌感染的定义和分类进行判断 3，判断过程结合临床，病例出院后进行总结。按照 Mennink-Kersten4的研究，只有确诊和高度疑似深部真菌感染才被认
10、为真阳性，只有非深部真菌感染被认为真阴性，其中确诊和高度疑似深部真菌感染患者的一般信息详见表 1。 1.2 标本采集 感染内科入选患者进行抗生素治疗一周后采血，分送血浆葡聚糖检和血真菌培养，同时送检痰、尿、便真菌培养及真菌涂片，特殊患者留取腹水和脑脊液真 菌培养。取样过程监测保持尽量无菌原则以减少污染，样本由我院实验室标准真菌培养基接种，真菌的识别使用传统方法 9。全院其他科室诊断可能深部真菌感染的患者立即采血及留取其他标本同前，视病情情况决定一周后是否再次留取标本。共留取用于检测血浆葡聚糖的标本 182 份，其中来自确诊病例和高度疑似病例（真阳性）共 18 份，其余为可能感染病例（ 18 份
11、）和无真菌感染病例（ 146 份，真阴性）。 1.3 仪器与试剂 MB-80 微生物动态快速检测系统、 T01 智能恒温仪、冰浴槽以及 GKT-5M Set 动态真菌检测试剂盒，均由北京金山川 科技发展公司提供。 1.4 血浆 1， 3- -D 葡聚糖检测方法 1， 3- -D 葡聚糖可以被 G 因子检测出来， G 因子是马蹄蟹的一种凝血因子。 5本研究利用真菌葡聚糖激活酶反应主剂中的相应因子后形成凝固蛋白，根据其浊度变化对真菌葡聚糖浓度进行定量。具体步骤为：用无热原抗凝采血管采取静脉血 2ml， 3000 转离心1 分钟，取上清 0.1ml，加入 0.9ml 的样品处理液 D 中，混匀后置于
12、70恒温 10 分钟，取出后立刻放入冰水浴中，为待测血浆样品。待测血浆样品 0.2ml 直接加入酶反应主剂 A 中，溶解后移液至标准玻璃反应管中， 插入 MB-80 微生物快速动态检测系统中进行反应， 1 小时后自动计算待测血浆中真菌葡聚糖含量。厂家提供的血浆中真菌葡聚糖正常值为 10pg/ml。 1.5 统计分析 应用统计软件包 SPSS 11.0 进行统计学描述及检验，深部真菌感染组与非深部真菌感染组的血浆葡聚糖水平为非正态分布，记录为（ x S（中位数）形式，采用独立样本秩和检验（ Mann-Whitney），取 P0.05 为具有统计学差异。另绘制利用血浆葡聚糖水平及培养真菌、涂片真菌
13、是否阳性诊断深部真菌感染的 ROC 曲线，依敏感度和特异度需要，确定本方法检测血浆葡聚糖诊断深部真菌感染的最佳临界值，其后使用诊断实验的一致性检验 Kappa 值判断一致性满意度，取 P0.05 为具有统计学差异。 2、结果 深部真菌感染组的葡聚糖水平 64.7 86.0（ 25.5） pg/ml 明显高于无深部真菌感染组的葡聚糖水平 6. 3 21.0（ 0.0） pg/ml （ P0.001），差异有明显统计学意义。 血浆葡聚糖用于诊断深部真菌感染 ROC 曲线下面积为 0.887（ P0.05）， 95%的置信区间为 0.795-0.979。其与单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性
14、对深部真菌感染的提示作用相比如图 1所示，后两者的 ROC 曲线位于葡聚糖的曲线下方，其曲线下面积分别为 0.840（ 95%置信区间 0.744-0.936）和 0.833（ 95%置信区间0.738-0.927），提示血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断的准确性好于单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染的判断。 不同血浆葡聚糖水平作为界值的敏感度和特异度详见表 2。结合单纯依靠各种标本真菌培养是否阳性判断深部真菌感染的敏感度和特异度，本研究认为 GKT-5M Set 动态真菌检测试剂盒 检测血浆葡聚糖水平诊断深部真菌感染的最佳临界值为 13.7pg/ml。而以血浆葡聚糖水平
15、13.7pg/ml 为临界值对深部真菌感染的诊断敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值和准确率分别为 88.9%、 90.2%、 50.0%、 98.7%和 90.1%，一致性检验 Kappa 值为 0.588（ P0.05），提示其对深部真菌感染诊断的一致性较好。而涂片真菌阳性和培养真菌阳性对深部真菌感染诊断的 Kappa 值分别为 0.397 和 0.449，提示单纯依靠涂片真菌阳性诊断深部真菌感染的一致性不理想，而培养真菌阳性的诊断作用亦不及血 浆葡聚糖的作用，只能结合临床进行分析。 3、讨论 随着医疗技术的发展，危重患者的生存时间越来越长，广谱抗生素广泛的用于危重患者感染的降阶梯抗炎治
16、疗，免疫抑制剂的应用改善了器官移植患者的器官排异，但深部真菌感染（ invasive fungal infection, IFI）亦较前更常见。尽管进行有力的抗真菌治疗，深部真菌感染的死亡率仍居高不下，原因之一就是深部真菌感染的早期诊断困难，从而造成抗真菌治疗的延迟。一部分深部真菌感染的诊断是在尸检时才确立的。抗真菌治疗的尽早进行对深部真菌感染的预后置关重要 6。传 统的诊断方法通常敏感性差，作为金标准的组织病理学和深部组织培养通常由于其有创性，在血小板减少和凝血功能异常以及其他类型的危重患者并不适用，在国内也时常为患者及家属拒绝，导致确诊病例很少 3。本研究的真阳性病例 16 例中确诊病例仅
17、 1 例，为腹水培养及连续 5 次血培养均为白色念珠菌，而且抗真菌治疗有效，从而明确诊断，全部病例中并无深部组织病理确诊病例，与既往文献的报道是一致的。其余 15 例均为高度疑似深部真菌感染，其中有 2 例微生物学并无阳性发现，但临床表现符合深部真菌感染，广谱抗生素抗炎无效，试用抗真菌治疗后病情好转 ，本研究中诊断为高度疑似深部真菌感染，对 EORTC/IFICG 和 NIAID/MSG 关于深部真菌感染的定义和分类中缺少抗真菌治疗反应进行补充，有待于进一步研究确定其合理性。 本实验为临床前瞻性实验，目的是分析血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断实验的准确性，确定其是否可以用于早期诊断深部真菌感染
18、。（ 1-3） - -D-葡聚糖是一种多聚糖成分，特异的存在于除结合菌和隐球菌外的其他真菌 7。原核生物、病毒和人类的细胞都没有葡聚糖，如果其出现在血和其他无菌体液中就提示深部真菌感染，常见的病原为曲霉菌和念珠菌，通过葡聚糖 水平测定都可以检测出来，甚至有报道卡氏肺囊虫感染时葡聚糖水平也会出现升高，可能与其具有真菌的特征有关。 10。而有研究表明 11新型隐球菌产生葡聚糖少于念珠菌和曲霉菌，而曲霉菌感染时葡聚糖上升的程度与宿主免疫力和病原的数量有关，只要霉菌被厚壁的纤维组织包绕，葡聚糖就不能进入血中。而本实验的病例尚未包括曲霉菌和隐球菌感染，可能与收集病例数量少有关，有待于扩大病例数量后进行观
19、察。尽管有许多试剂盒可以检测葡聚糖，但在除日本外的其他国家经验有限，国内目前上市的葡聚糖检测手段有金山川公司的比浊法，一些国内的研究证 明其可以有效的诊断深部真菌感染。本研究深部真菌感染组的血浆葡聚糖水平明显高于对照组，提示其对深部真菌感染的诊断有一定的可行性。加之其标本采取方法较严格的传统培养或病理标本采取方法更为方便，在临床中有很大的开发和研究价值。 Odabasi8按葡聚糖高于 60pg/ml 为阳性指标，对 98 例血液肿瘤患者进行每周两次的筛选。在所有证实深部真菌感染的患者中（ 6 例念珠菌血症， 1 例镰刀霉感染， 1 例丝孢酵母菌感染）及高度疑似深部真菌感染的患者中以出现至少 1
20、 例的样本阳性确定诊断，凭借葡聚糖先于临床诊断平均 4 天。对于确诊和高 度疑似的感染，单次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为 100%、 82%、 40%和 100%。两次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为 60%、 93%、 50%和 95%。本研究按葡聚糖高于 13.7pg/ml 为阳性指标单次阳性的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为88.9%、 90.2%、 50.0%、 98.7%，与文献的报道相差不大，但临界值相差较大，考虑可能与试验方法不同有关，本文的临界值是由样本与G 因子反应后通过比浊法测定并计算得出，是否可与其他文献的临界值进行比较
21、或用于作为其他 方法（如 ELISA）得出的血浆葡聚糖水平的正常值有待于进一步在相同样本上测定比较后决定。本研究提示血浆葡聚糖水平对深部真菌感染诊断的准确性好于单纯依靠各种标本真菌培养或真菌涂片是否阳性对深部真菌感染的判断，分析原因主要是后两者在阳性的情况下不能区分感染和定植，而需要依赖于临床的评价；有研究提示 11，真菌在口腔、尿路、支气管的定植并不会导致血浆葡聚糖升高到 20pg/ml 以上，从而在鉴别真菌感染和真菌定植方面更少依赖临床的评价。 4、结论 血浆葡聚糖水平可用于诊断深部真菌感染，本研究使用GKT-5M Set 动态真菌检测试剂盒检测血浆葡聚糖水平诊断深部真菌感染的最佳临界值为
22、 13.7pg/ml，使用此临界值对深部真菌感染进行诊断的一致性较好。 致谢 感谢北京友谊医院感染内科实验室文艳老师和王婧同学在实验室技术方面提供的帮助，感谢金山川公司及时提供的试剂及技术支持。 参考文献 1 Prentice, H. G., C. C. Kibbler, and A. G. Prentice. 2000. Towards a targeted, risk-based, antifungal strategy in neutropenic patients. Br. J. Haematol. 110:273 284. 2 Hopwood V, Evans EGV. Serolo
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