1、生物技术在水产食品中的应用090214401生物技术 092 刘小超生物技术在水产食品中的特殊地位生物技术的研究应用已经成为世界各国水产科技竞争的焦点和国际交流合作的热点。水产生物技术在解决良种培育、生殖调控、病害防治、种质资源保存、濒危物种保护以及水环境监测与污染治理等行业关键性重大科技问题方面表现出巨大的应用价值和前景，同时也取得了令人鼓舞的应用成果。目前，我国的水产生物领域正在加快研究步伐，在功能基因筛选与克隆、重要性状分子标记筛选与应用、水产动物遗传连锁图谱构建、性别控制与单性苗种培育、分子标记或基因标记辅助选育以及水产养殖动物胚胎干细胞培养和细胞库建立等方面都已经取得了较好的进展。在
2、水产分子育种学、保护生物学、分子系统学、分子免疫学以及转基因研究等方面已经开始应用基因组研究技术和方法，并通过基因组资源推动了各个研究领域的快速发展。近十几年来，生物技术研究迅猛发展，呈方兴未艾之势。特别是转基因动物（Trmssenic animals）的研究，推动了转基因鱼（Tranenic fish）研究工作的开展。生物技术应用于水产养殖，比如促进鱼体生长、增强鱼体的抵抗力、培育优良品种等均作出重要贡献。实践证明，生物技术在水产养殖中所起的作用越来越明显。生物技术在水产食品中的应用实践 增加鱼产量1l 促进鱼类生长1982 年，Palndter 等将大鼠的生长激素基因注入小鼠受精卵原核中，
3、获得了快速生长，其成体比一般小鼠大 1 倍。1985 年朱作言等在世界上首次报道在鱼类中进行转基因的研究，其中常用的基因转移片段为生长激素基因。人们希望用鱼类和哺乳动物的生长激素基因向鱼类转移以期获得有实用价值的个体大、生长速度快的“超级鱼”。目前已有不少实验室获得了多种能快速生长的转生长激素基因鱼，其促生长作用非常明显，尤其是蛙科鱼类，这一技术具有很强的促生长作用。Du 等用由美洲大绵鳚抗冻蛋白启动子结合大鳞大麻哈鱼生长激素 cDNA 组成的“全鱼”基因转移到红科鱼类的胚胎中。研究显示，对注射生长激素基因的成年鲑鱼促生长效果平均为对照组的 35 倍，对某些个体，尤其在生长的最初几个月，其生长
4、速度可以为对照组的 1030 倍（Du 等，1992；Devlin 等，1994）。还有一些试验是用别的鱼或非鱼启动子进行的，虽然得到相似的结论，但生长效果都没有鲑科鱼类显著。最近在黑鲷的研究中发现，生长激素不仅可以促进生长，还可以提高鱼苗的成活率（巫爱珍，1997）。12 控制繁殖行为在水产养殖上，由于雌雄鱼的经济性状不一样，如生长速度、个体大小、成熟年龄、繁殖方式、体色。体型等均有差异，所以控制鱼类的性别，选择具有最佳生长性能的性别进行单性养殖，不仅对阐明鱼类性别分化和性别决定机制等理论非常重要，同时在水产养殖中也具有多方面的实践意义。在提高群体生长率方面，海鲈、鲤鱼、鲤科鱼类雌鱼比雄鱼生
5、长快，而虾类雄性比雌性生长快，罗非鱼雄性比雌性生长快 4050。在同等条件下，实行单性养殖，不但会提高单位面积产量，而且还具有很多重要的作用，比如，在控制繁殖速度方面，罗非鱼由于成熟早、繁殖快，造成密度过大，抑制群体生长，降低产量和质量，单性养殖雄性罗非鱼则可有效控制其繁殖。提高产量；在提高商品鱼质量方面，单性养殖可使鱼生长快，个体大，减少生殖能量的消耗，使吸收的营养物质主要在肌肉中沉积，增加可食部分，提高肉的品质。要获得单性养殖，可以有很多种方法，通常都是用甲基睾丸素处理仔鱼，使其产生雄性表型；也可以用相近种之间的特异性杂交，改变基因组成，从而产生单性杂种；另外，还可以生产雌性个体，进行单性
6、养殖，然后用类固醇进行性转变，生成具有雄性基因型、有生殖力的雄鱼，并使其产出单性后代（Mair 等，1997）。通常动植物细胞染色体为两组。由自然环境因素或人工特殊处理形成两组以上染色体的动植物称为多倍体。三倍体生物具有两个重要特点，即高度不育和生长比正常二倍体迅速。前者对控制某些放养或移植的生物种群数量、扩散等是一条有效的措施，也可大大提高许多生长速度因性别而差异的动植物的产量；后者不言而喻可缩短养殖周期和提高生物产量。总之，三倍体鱼本身并不是由于染色体数目增加了一组而加速了生长，主要是利用三倍体的不育性，在繁殖季节把营养物质转用于肌肉生长并防止肉质下降。从 70 年代起，各国研究者都分别对
7、许多鱼类、甲壳类和贝类等水生生物进行了人工诱导多倍体的研究。许多鱼类多倍体的研究者选择在精子入卵时而卵的第二极体排出之前，对卵进行物理（如冷或热休克、静水压等）和化学药物（如秋水仙素、CB 等）的处理，以阻止第二极体排放从而诱导产生具有 3 组染色体的三倍体（关瑞章等，1998）。Valentrt 1975）对奥利亚罗非鱼的受精卵进行冷处理，诱导出 75的多倍体且孵化率高达 90 。我国洪云汗（1990）对鳙鱼卵在第一次卵裂前进行热处理，获得了 563的四倍体。使用静水压诱导鱼类多倍体的研究也很多。中科院水产研究所的桂建芳等（1991）对水晶彩鲫应用静水压力进行三倍体和四倍体的诱导研究，获得了
8、 100的三倍体且孵化率为对照组的 90左右；同时，也获得了四倍体胚胎。尹洪滨等（1996）也应用静水压诱导产生三倍体鲶鱼。13 提高抗病力鱼、虾、贝疾病严重威胁着水产养殖业的发展。目前，人们用来对付细菌性疾病的主要手段仍然是使用抗生素，但细菌适应性很强，较易产生抗药性，而且抗生素对病毒性疾病无能为力。因此除了要加强病原体检测之外，更重要的是要培育抗病抗逆性强的水产养殖品种以及开发新的疾病防治技术。近些年来的实践表明，生物技术在这些应用领域大有潜力可挖，如利用重组 DNA 技术导入抗病抗逆性基因以获得抗病抗逆性强的转基因水产动植物，另外也可将基因工程疫苗和反义技术应用于水产养殖疾病防治。13l
9、 基因工程疫苗利用基因工程技术可将从细菌或病毒中分离出的具有免疫保护性的抗原基因与载体结合，然后将此重组 DNA 转入大肠杆菌或酵母菌等体外表达系统中，从而大量生产作为疫苗用的抗原蛋白质。这种基因工程疫苗与常规疫苗相比，具有抗原专一、可应用发酵技术进行大量生产等特点。目前，许多国家已经制备出了基因工程疫苗，并在实际中应用。在水产养殖方面，欧、美、日本等已成功地将弧菌、产气单胞菌、爱德华氏菌等鱼类病原菌制备成全细胞灭活疫苗，并且用从菌体中提取的脂多糖、胞外蛋白等有效抗原，制备出了单克隆抗体等生物工程疫苗并商业化生产。如 Gilmore 等（198）把从传染性造血组织坏死病毒中分离到的糖蛋白基因
10、G 的 Sau3AI 片段转入埃氏大肠杆菌中，得到一种具有较强免疫原性的糖蛋白抗原，该基因工程疫苗能有效防治传染性败血症的感染。l.32 反义技术反义技术是近十多年来发展起来的反义核酸技术和核酸技术的总称，可以用来特异性地阻断病毒功能的发挥。反义核酸技术可分为反义 RNA 技术和反义DNA 技术，但一般常指反义 RNA 技术。反义 RNA 技术是以 DNA 有义链为膜板合成的 RNA 及其衍生物，它可通过与相应的 mRNA 互补结合而阻断其功能。目前，使用人工合成的反义 RNA 已在原核细胞和真核细胞中成功地抑制了多种病毒基因的表达。核酶则是一种具有催化作用的 RNA，它通过碱基配对与靶 RN
11、A 相互识别、结合并催化水解靶 RNA，因此它既有反义 RNA 的作用，又能以序列特异性切断靶 RNA。实验证明，核酶也可以抑制病毒的复制和表达，转入基因可以传代。现有不少研究显示，核酶可用于对病毒靶 RNA 进行切割。不过目前还未见到有关成功应用反义技术来治疗水产养殖动植物病毒性疾病的报道，但作为一种特异性较强的治疗技术，反义技术还是很有应用开发潜力的。1 4 提高鱼体耐低温能力水体温度低对很多鱼体都会造成相当大的应激，大多数鱼类都不能生活在0l的冷水中。尤其是在温和气候里生活的敏感鱼群在遇到罕见的低温时，甚至可能会全部地死亡，因而低温对鱼类的影响，成为在水产养殖中较为严重的问题。但是，有一
12、些硬骨海水鱼群含有很高水平（1025 mgmL）的血清抗冻蛋白（AFP）或血清抗冻糖蛋白（AFGP），它们通过阻止冰晶的生成能够有效地降低冻结温度。这些蛋白质的结构可以稍微的变化，只要拥有 AFGP 的一级结构和 AFP 的四级结构即可具有耐低温的能力（Fletcher 等，2001）。大多数抗冻蛋白最初在肝脏中表达，而有一些受生长激素（GH）的负调节，表现出季节性的变化。在一些鱼体中，发现该蛋白也可以在皮肤、鳃和其他外周组织中表达。对这些抗冻蛋白特别是美洲拟蝶中抗冻蛋白进行分离、定性和调节，是水产研究者今后主攻的重点，部分研究者已经在鱼体中验证了这一蛋白在降低冻结温度方面潜在的应用，特别是大
13、麻哈鱼。给金鱼注射抗冻蛋白也提高了鱼体的耐寒能力，试验温度为 0 ，延续 12 h，此时对照组的鱼体全部死亡（Wang 等，1995）。给乳香鱼幼鱼或罗非鱼注射或口服抗冻蛋白时，也能提高鱼体抗冻能力，温度可由 26降到 13。经抗冻蛋白处理过的罗非鱼，死亡率为 34，对照组为 60；而乳香鱼注射低剂量（100gg bw）的抗冻蛋白，其死亡率为 22 2，对照组为 70（Wu等，1998）。在温度接近鱼体生长生理权限的国家，当鱼群拥有该基因将有利于水产养殖业的商业发展。在其他的脊椎动物中，该蛋白也可以保护它们的细胞膜不受冷水和冻结的损害，这可能是通过改变该动物的膜结构来实现的（Rubinsky
14、等，1992）。通过这一方法，还可以增强膜的稳定性。研究表明，鱼体的这些抗冻蛋白能够帮助羊胚胎在低温（4）的情况下保存，冷冰保藏抗冻蛋白能够保护猪卵母细胞免受冰的损害（Arav 等，1993 ； Baguisi 等， 1997）。冷冰包藏抗冻蛋白在鱼卵和鱼胚胎中的作用有待于进一步地研究。1 5 出现新的转基因技术目前常用的生产转基因鱼的方法是向受精卵中注射 DNA。外源基因的整合、表达和筛选工作是在个体水平上进行的，不仅工作繁琐、周期较长、成功率低，而且后代的遗传性状也常出现分离。将来在转基因鱼生产中最为有前途的工具将是胚胎于细胞（ESC）技术，利用 ESC 作为基因载体，得到基因整合的细胞，
15、将载体 ESC 直接进行核移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物。ESC 在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞，即可以得到携有目的基因的转基因动物。因为一个优良的 ESC 系不仅可以用于各种目的的基因转化，用各种方法将外源DNA 导入细胞，而且外源基因的整合数目、位点、表达程序以及稳定性等都可以在细胞水平上进行加工、筛选，在很大程度上加快了动物遗传工程的进程。现在已有不少有关 ESC 作为外源基因载体生产转基因动物的报道。 Hooper 用逆转录病毒 DNA 随机插入和同源重组法得到了次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）缺失的 ESC 系，并获得了 HPPT 缺失的嵌合体小鼠，建立了猪TGF
16、BI。DNA 的 ESC。曾讳清将 HGF 基因导入小鼠 ESC，获得了转染 HGF 基因的 ESC。Hong 等（1996）将这一技术用于转基因鱼一青鳉中，培育出 mesl 细胞的前体物，该前体物与小鼠的 ESC 具有很多相同的特征。但是，把这一技术应用到鱼体中仍是一个漫长的过程（Hong 等，1996，1998 ，2000）。2 生产新品种2l 生物传感器传感器是能接受规定的被测量按照一定规律将其转换成可用信号（主要是电信号）的器件或装置（传感器技术与发展，1987），它通常由敏感元件、转换元件及相应的机械结构和电子线路所组成。人们把用固定化的生物体成分（酶、抗原、抗体、激素）或生物体本身
17、（细胞、细胞器、组织）作为敏感元件的传感器称为生物传感器（Biosensor）（生物传感器及其应用， 1993）。生物传感器目前广泛应用于环境检测等领域。人类赖以生存的环境质量，是目前举世瞩目的重大问题。随着科学技术的不断发展，人类开发利用自然资源的能力和范围不断扩大。与此同时，人类的生产、生活活动对环境的影响也逐渐增强，环境日益受到来自生产、生活的废弃物的污染，水质的污染就是一个尤为严重的问题，污染物大多起源于工业废物和污水。被污染的水质对鱼体的影响通常表现出生殖机能障碍，雄性鱼体雌性化等（Tyler 等，1998；Summer，1998）。因为我们能够检测到水中特定的生物与有机化合物或金属
18、化合物的生化反应，因此可以把该生物作为生物传感器的敏感元件来测定污染水平。通常是用细胞色素 P450lA 对有机化学物质，包括芳香烃和二恶英反应而检测污染物水平，这些污染物能够诱导细胞色素基因蛋白表达或 mRNA 水平的变化。另外，也有用金属硫蛋白来检测水中金属的污染程序，因为金属硫蛋白是在肝脏中产生的能结合金属的蛋白质，对重金属有解毒作用。由于这种蛋白质的含量随重金属的投入 而上升，所以可通过重金属的投入来诱导外源基因的表达。目前在水质检测中还没有用活的生物传感器，这是因为种群筛选还不能检测污染物的程度，而现有的生物传感器又能够很有效地检测水体中污染物水平（例如通过直接整合感受器、DNA 启
19、动子、辅激活物或辅阻遏物）。但是因为大多生物传感器只特异性对特定的化合物群起作用，而且在试验过程中需要大量工作和花费。因此，活的生物传感器这一方法虽然存在缺陷，但它仍有研究的价值。现在也有很多水产研究者正在研究用别的方法来检测水质污染程度，例如，通过基因编码开花期蛋白（GFP）溶入启动子会与水中污染物发生反应。这些启动子是来源于一些诱导基因：（1）编码由应激、重金属或化学毒素诱导的热应激蛋白或金属硫蛋白；（2）由雌激素或异种雌激素诱导的雌激素效应元件；（3）有致癌物诱导的肿瘤标记基因（Cong，1991 ；1997）。 GFP 作为报告基因能够被用来作为转基因有机体连续的定性生物传感器测定水体
20、中污染物的水平，并在消除酶或特异性蛋白试验时，提供快速而有效的结果。以前也有学者把 RAD54 溶入 GFP 中完成酵母细胞的转化，细胞在 DNA 受到损害时变绿（Afanassiev 等，2000）。22 新品种的观赏鱼类世界对观赏鱼类需求的不断增加，为利用转基因技术开发具有新的形状和颜色的新品种打开了市场，目前应用于开发观赏鱼表型多样性方法主要为注射染料或选择有种，很明显转基因方法将优于前两种方法。利用基因编码荧光蛋白，如红（RFP）、蓝（BFP）、黄（YFP）、青色（CFP），以不同的组合可以产出绿。红、蓝、黄或青色鱼体。现在已有研究者通过把开花期颜色编码基因溶入到鱼组织特异性启动于上，
21、已经成功地生产出新颜色的观赏鱼类。而且，GFP，RFP，YFP 可以分别在皮肤或骨骼肌中得到表达，根据这一特性，加等（1999）成功地生产出两种颜色的观赏鱼，皮肤显示绿色，而骨骼肌是红色的。利用转基因技术和选择育种技术使鱼体携带不同的转基因，在未来可以产出很多种多色的观赏鱼类。生物技术在水产食品中应用的展望目前生物技术发展非常迅速，应用也非常广泛。但从总体上来说，不管是国内还是国外，将生物技术应用于水产养殖业目前还很不广泛，尚处于起步阶段。虽然如此，近些年来国际上许多国家竞相利用生物技术来改造传统的水产养殖业。我国作为一个水产养殖大国，水产养殖业发展较快，但也面临育种、病害防治等诸多挑战，因此将生物技术应用于水产养殖优良品种培育、种质鉴定、病原体检测以及疾病防治等领域就很有发展潜力和经济价值，并且将对水产养殖业的发展产生重大而深远的影响。参考文献1沈月新，食品水产学. 北京：中国农业出版社，20012，江善宗;生物技术在水产食品加工上之应用利用生物技术生产鱼肉蛋白降解抑制剂J;福州大学学报(自然科学版);2002 年 S1期3，刘书成:水产食品加工学.郑州：郑州大学出版社；2011
