1、中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 尼龙固定化木瓜蛋白酶 化学生物学实验 1.实验目的 化学生物学实验 6学时 1 2 学习尼龙固定化木瓜蛋白酶的原理和方法。 掌握共价结合法固定化酶的原理和方法 。 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 1 2 3 4 酶不与产品混合，制品易于纯化。 在大多数情况下，可提高酶的稳定性。 提高酶的使用效率，降低生产成本。 利用固定化酶，工业上可以大批量、连续化生产 定义： 通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载 体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内 进行催化反应的酶称为固定化酶。 固定化酶的优越性主要
2、表现在： 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 包埋法 共价键 结合法 交联法 酶的固定化方法有： 吸附法 (物理吸附、离子吸附 ) 1 2 3 4 2.实验原理 化学生物学实验 6学时 本实验尼龙固定化木瓜蛋白酶属共价键结合法。尼龙长链中的酰胺键 经 HCl水解后，产生游离的 -NH2基，在一定条件下与双功能试剂戊二醛 中的一个 -CHO基缩合，戊二醛中的另一个 -CHO基则与酶中的游离氨 基缩合，形成尼龙 (载体 )-戊二醛 (交联剂 )-酶，即尼龙固定化酶。 NH(CH2)6NHCO(CH2)4COn HCl R-CH2-NH2 OHC-CH2-CH2-CH2-CHO R-CH2-N=C
3、H-CH2-CH2-CH2-CHO 目标产物 3.实验材料、试剂及仪器 化学生物学实验 6学时 材料 (1)尼龙布 (86或 66)，140目，剪成 3 cm 3 cm大小的方块 (2)吸水纸 仪器 (1)恒温水浴锅 (2)紫外分光光度计 (3)冰箱及玻璃器皿 中南民族大学 药学院 化学生物学教研室 3.实验材料、试剂及仪器 化学生物学实验 6学时 (1)18.6% CaCl2溶液 (2)甲醇溶液 (3)3.65 mol/LHCl溶液 (4)0.2 mol/L硼酸缓冲液 (pH值 8.5) (5)5%戊二醛溶 :用 0.2 mol/L,pH值 8.5的硼酸缓冲液配制 (6)0.1 mol/L硼
4、酸缓冲液 (pH值 7.8) (7)1 mg/mL木瓜蛋白酶溶液 (8)0.1 mol/L磷酸缓冲液 (含 3% NaCl) (pH值 7.2) (9)0.1 mol/L磷酸缓冲液 (pH值 7.2) (10)激活剂：用 0.1 mol/L磷酸缓冲液 (pH值 7.2)配制，内含 20 mmol/L半胱氨酸、 1 mmol/LEDTA的混合液。 (11)1%酪蛋白溶液：用 0.1 mol/L磷酸缓冲液 (pH值 7.2)配制。 (12)10%三氯乙酸 (TCA)溶液。 主要试剂 4.实验步骤 1、固定化酶的制备 (1)每组取 5块尼龙布洗净、晾干，浸入 10 mL混合液（取 1.86 mL 1
5、8.6%CaCl2溶液加入 8.14 mL甲醇溶液中，注意要现配现用） 中 10s左右，取出后用水冲洗 、干净，用吸水纸吸干。 (2)尼龙布用 3.65 mol/L HCl溶液在室温下水解 45min，用蒸馏水 冲洗三次至 pH中性。 (3)将尼龙布用 5%戊二醛溶液在室温下浸泡偶联 20 min。 (4)取出尼龙布，用 0.1 mol/L 磷酸缓冲液 (pH值 7.2)反复洗涤， 洗去多余的戊二醛，吸干之后，立即用酶液 (0.5 1 mg/mL)在 4 下固定 3.5 h(酶液用量每块尼龙布不宜超过 0.8 mL)。 (5)从酶液中取出尼龙布 (保留残余酶液作测定用 )，用 0.5mol/L
6、NaCl溶液 (用 0.1 mol/L， pH值 7.2的磷酸缓冲液配制 )洗去多余的酶蛋白，即为尼龙固定化酶。 化学生物学实验 6学时 4.实验步骤 化学生物学实验 6学时 2、酶活力测定 (1)溶液酶活力测定：取 0.2 mL酶液，加入 2.3 mL激活剂，于 37 下预热 10min，加入 37 预热的 1%酪蛋白溶液 mL， 准确反应 10 min，然后加入 10%三氯乙酸溶液 1.5 mL终止 酶反应。对照管先加入 10%三氯乙酸溶液，后加酪蛋白溶 液，其他与测定管相同，以 8000 r/min的转速离心 10 min或 过滤，取其上清液于波长 280 nm处测定吸光度。在上述条 件
7、下，每 10 min增加 0.001个吸光度为 1个酶单位 (U)。 (2)残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。 (3)固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶，加入 2.5mL激 活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。 4.实验步骤 化学生物学实验 6学时 表 1 酶活力测定 试剂 溶液酶 固定化酶 残留酶 CK 1 2 CK 1 2 CK 1 2 激活剂（ mL） 1.8 1.8 1.8 2.0 2.0 2.0 1.8 1.8 1.8 酶液 /固定化酶（ mL或块） 0.2 0.2 0.2 1块 1块 1块 0.2 0.2 0.2 37 保温 5min 37 1%酪蛋白（ mL） 1 1 1 1 1 1 37 反应 10 min 20% TCA (ml)摇匀 2 2 2 2 2 2 2 2 2 1%酪蛋白（ mL） 1 1 1 过滤
