1、核酸指纹图谱分析应用于分枝杆菌菌种鉴定,自贡市疾病预防控制中心 邓建平 2017.04,前言,分枝杆菌属包括结核分枝杆菌复合群(MTC,包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、卡介苗)、麻风分枝杆菌及非结核分枝杆菌(nontuberculosis mycobacteria，NTM)。自1882年Koch发现结核菌以来，已报道了100余种分枝杆菌，其中约30种与人类或动物疾病有关。其中结核分枝杆菌(MTB)是最常见且是最重要的致病菌。不同分枝杆菌感染的症状、体征及影像学检查并无特异性，而各自的治疗方案却差异较大。为对结核病病原做出准确判定，以及在亚种水平上对我市分枝杆菌临床分离
2、株复合群进行菌种鉴定，是结核病防治工作中，病原学诊断的一项重要指标。,一、结核病的流行疫情,结核病是伴随人类历史最长，由单一致病菌造成人类死亡最多的慢性传染病，历史上称其为“白色瘟疫”，我国旧称“痨病”，民间素有“十痨九死”的之说。在20世纪40年代链霉素等抗结核药物发明之前，结核病几乎是不治之症。 根据WHO统计,全球结核病感染人数约20亿,每年新发病例800万,每年死于结核的人数约130万。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印度、印尼，居全球第三位。,3,WHO发布2016年全球结核病报告,2016年10月14日 发布，数据涵盖了202个国家和地区的99%的人口和结核病
3、病例。 2015年，世界范围内估计有1040万新发病例，其中男性590万（56%），女性350万（34%），儿童100万（34%）。新发病例中有120万（11%）HIV患者。 印度、印度尼西亚、中国、尼日利亚、巴基斯坦和南非这六个国家占了新发病例总数的60%。 2015年全球估计有48万新发的MDR-TB病例和10万耐利福平结核病（RR-TB）病例。印度、中国和俄罗斯三个国家占所有这58万病例的45%。 2015年有140万人死于结核病，另外40万是TB/HIV双重感染人群死亡。虽然在2000到2015年间，结核病死亡以22%的速度在下降，但2015年结核病仍然排在全部死亡原因中的前十名。,W
4、HO发布2016年全球结核病报告,全球在2000到2015年避免了4900万结核病死亡。2015年全球报告肺结核病例610万，仍有约430万的估算病例未被发现和报告。在2015年估计的58万MDR-TB患者中，只有12.5万（20%）得到了治疗。2013年MDR-TB病例队列的治疗成功率为52%。2015年，55%的报告肺结核病例进行了HIV检测，TB/HIV 双重感染的病例中接受抗病毒治疗的占78%。,结核病高负担国家前三位,每年报告发病数仍居甲乙类传染病的第二位西部地区疫情重主要以农牧民为主老年人高发,我国仍是全球结核病高负担国家之一2014年新发结核病患者93万，位居全球第3位占全球患者
5、数的9.7%,我国结核病疫情现状,我国结核病疫情现状,“六多”的特点 ：1、感染人数多。目前全国约有55亿人感染过结核菌，感染率达到445，高于全球13的感染率水平。2、患病人数多。全国现有活动性肺结核病人约450万，患病人数居世界第二位。3、新发患者多。全国每年新发生肺结核患者约145万。2004年，全国法定报告的甲、乙类传染病中，肺结核的报告发病率位居首位。4、死亡人数多。全国每年约有13万人死于结核病，是各种其他传染病和寄生虫病死亡人数总和的2倍。5、农村患者多。全国约有80的结核病患者集中在农村，而且主要在中西部地区。6、耐药患者多。全国菌阳肺结核病人中耐药病人约占14，而据世界卫生组
6、织调查，全球每年新发生的耐药结核病人中，有14在我国。一名涂阳肺结核患者若不加以治疗，一年平均可感染10-15名易感者。,二 非结核分枝杆菌概况,非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM) ： 指除结核分枝杆菌复合群( 包括结核、牛、非洲和田鼠分枝杆菌) 和麻风分枝杆菌以外的一大类分枝杆菌的总称。非结核分支杆菌感染 ： 感染了NTM, 但未发病。非结核分支杆菌病 ： 感染了NTM, 并引起相关组织、脏器的病变。,非结核分枝杆菌分离,全国 27 省全人群 NTM 感染率,感染率特点省间差异从1.9% 44.9%地理特征南方高于北方，沿海高于内地气温温和地区高
7、于寒冷地区,分枝杆菌菌种鉴定的必要性,1.NTM病呈快速增长趋势，已成为威胁人类健康的重要问题，1990：4.1% 2000：11.9% 2010：22.9%2.老年化现象：3.诊断：影像学缺乏特异性、临床症状不典型、可长期误诊为结核病4.治疗：对常用的抗结核药物天然耐药治疗效果不确切、治疗费用较高及易引起不良反应,分枝杆菌菌种鉴定的现状,目前诊断NTM的技术还十分滞后，最突出的是实验室质量控制较差，不同的鉴定方法可能产生不同的鉴定结果，导致分枝杆菌假阳性和假阴性升高。实验室菌种鉴定水平不高，使得1/4的NTM病误诊为结核病。因此，在条件允许的情况下，对已明确的NTM菌株进行鉴定很重要，这有助
8、于区分是否致病菌，以进一步指导临床处理。,分枝杆菌鉴定方法,基于生长特性和生化反应的传统方法基于特定基因序列的分子分型方法(如核酸指纹图谱分析,hsp65,rpoB基因多态性)根据菌体特定成份(如脂肪酸,分枝菌酸等)建立的色谱法 基于蛋白组学的飞行质谱技术,三 核酸指纹图谱法,核酸指纹图谱分析是以分枝杆菌复合群各菌种的特异性基因片段（16SrRNA、Rv0577、IS1561、Rv1510、Rv1970、Rv3877/8、Rv3120，代号为1、2、3、4、5、6、7）作为靶标，通过特异性基因片段的有无进行菌种鉴定。针对上述7个结核分枝杆菌复合群的特异基因，合成7对特异引物7，分别对分枝杆菌的
9、7个基因进行扩增靶基因序列，产物电泳后获得酶切指纹图谱。,PCR定义,PCR反应特点,PCR反应基本步骤,PCR技术的基本原理,核酸指纹图谱操作步骤,1、DNA的提取,（1）水煮法,（2）CTAB提取法,（3）柱子提取法,（4）全自动核酸提取法,水煮法提取DNA,（1）收集菌体，用生理盐水洗脱L-J培养基菌体；（2）离心收集菌体，400ul TE重新悬菌；（3）恒温金属浴98 20分钟，超声波破碎 15分钟；（4）13000rpm离心5分钟；（5）取上清即为模板DNA。,全自动核酸提取仪提取DNA,2、PCR扩增,在25ul反应体系中，上、下引物各1ul,2Taq PCR MasterMix
10、13ul，DNA模板4ul，纯水6ul。PCR反应条件：预变性945min ，变性94 1min ， 退火601mi n，延伸721 min ，循环次数30次，最后充分延伸7210 min， 每次扩增分别设阳性及阴性对照 。,3、电泳产物分析,扩增产物 ，经2琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果获得核酸指纹图谱 。,标准分枝杆菌核酸指纹图谱,自贡市分枝杆菌指纹图谱,自贡市分枝杆菌菌种鉴定结果,2012至2016年共完成3650株菌株DNA提取及鉴定工作，以核酸为模板扩增7个位点（16S rRNA，Rv0577，IS1561，Rv1510，Rv1970，Rv3877/8和Rv3120）的目的片段，根
11、据核酸指纹图谱初步鉴定结核分枝杆菌1634株、非洲型20株、非结核分枝杆菌38株。,该技术的引进与应用对了解我市结核分枝杆菌流行株的种型特征，进行分子流行病学调查和研究，临床诊断和治疗提供了病原学依据，并取得可喜的成果。 使患者个体及时得到诊治提供了保障，为控制结核病的传播具有实际意义，同时推动了中心结核病实验室检测能力的建设；,核酸指纹图谱鉴定意义,核酸指纹图谱技术对分枝杆菌菌种鉴定在四川省的首次应用后，已为省内推广使用该技术提供了示范参考作用。该技术不仅快速可靠，而且具有成本低廉，可建立标准化操作程序的优点，不仅对临床诊断和治疗，而且在流行病学上均有重要意义。 国内首次发现脓毒分枝杆菌及四川首次发现马赛分枝杆菌感染，为进一步开展非结核分枝杆菌病的研究提供了先进技术依据。,谢谢！,
