1、第二章 山野菜的综合开发,授课教师: 周 志 日期: 2010年秋季,第三节 藤茶的综合开发,1.藤茶植物资源,藤茶，学名为显齿蛇葡萄Ampelopsis grossedentata (Hand-Mazz) W.T.Wang，为葡萄科（Vitaceae Michx）蛇葡萄属（Ampelopsis）的一种野生木质落叶藤本植物，属于典型的类茶植物，俗称山甜茶、白茶、甘露茶、白毛猴、白茶等，主要分布于我国湖南、湖北、云南、贵州、广东、广西、福建等地。藤茶原植物生长于海拔4001300m之间 ，集中或散生在山坡的混杂林中，野生贮量大，分布和生长规律比较清晰，为可以直接利用的野生植物资源。,我国湖南、广
2、西等地对藤茶植物的开发应用较早，据资料，湖南省年产野生显齿蛇葡萄可达450-500t。经过近10年来的开发，目前已在湖南、湖北等省开始人工栽培研究。湖北省内藤茶植物主要分布于鄂西南山区，特别是恩施州的来凤县大河地区盛产野生藤茶，该地区除了分布显齿蛇葡萄（藤茶）外，还分布有同科同属植物大叶蛇葡萄（A. megalophylla Diels）、光叶蛇葡萄(A.sinica var hancei(pl.)W.T.Wang)等；2000年开始，当地科研部门联合高校开展藤茶仿野生栽培试验并获成功，结果表明，人工栽培藤茶与现有野生藤茶药用品质相同。,2.藤茶植物的加工产品,开发藤茶植物资源，目前最主要的加
3、工产品为类茶产品，即冲泡型商品“藤茶”，各地分别有“藤茶”、“白猴”、“甘露茶”、“茅岩霉茶”、“野藤茶”、“龙须茶”等俗称。通常于春夏季采回植株上的幼嫩茎叶，经炒制加工而成。商品藤茶加工工艺流程：原料分级清洗摊放杀青揉捻焖青晒干冷却回润密封保存。其它加工产品主要有：粉沫状的袋泡茶、压榨成型的藤茶饼、与绿茶或红茶为伍的拼和茶、由藤茶茎叶水提取物浓缩加工的速溶茶、藤茶饮料、藤茶含片、果冻、清凉藤茶糖等产品。,3.藤茶的民间药用途径,藤茶为药食两用植物，最初作为一剂草药应用于民间。我国广西、湖南等省区壮族、瑶族和湖北土家族苗族人民常用其幼嫩茎叶入茶, 夏天泡茶，数日不馊, 有“神茶”之称，已有数百
4、年的历史。据中草药汇编等文献记载，该药性味甘淡、清热解毒，主治黄疸型肝炎、感冒风热、咽喉肿痛等。民间认为，大凡失音、中暑、口舌生疮、风火牙痛、便秘等症，用开水泡饮藤茶，疗效明显；对马牙疳、脚丫湿疹等用藤茶外敷、外洗，也有一定疗效。藤茶可全株药用，主要采用茎叶或根部，药用量因加工方法不同而异，磨服量小,代茶冲服量较大。,4. 藤茶化学成分的研究,近年来，关于同科同属不同种的蛇葡萄属植物的化学成分研究，国内外均有报道。如日本学者研究了光叶蛇葡萄A.brevipedunculata var.hancei(pl.)Rehd根的甲醇提取物中的化学成分,从中分离出白藜芦醇苷及蛇葡萄素等成分；李文武等对羽叶
5、蛇葡萄Ampelopsis chaffanjonii (Levl.)Rehd.进行研究,从中分离得到酚甙成分蛇葡萄素Ampelopsisin20。关于显齿蛇葡萄植物（藤茶）化学成分的研究，目前仅限于国内，主要针对我国湖南、广西、福建、湖北等省分布的藤茶植物，包括对藤茶中存在的化学成分种类、含量分析和主要成分的分离、鉴定及相关分析方法的建立等，特别是对藤茶黄酮及其分离成分二氢杨梅素的研究较为系统和全面。,4.1藤茶基本化学成分的种类与含量,张友胜等对湖南显齿蛇葡萄幼嫩茎叶的干样进行了较全面的化学分析，测得粗蛋白含量为13.94%,水溶性蛋白0.55%，总氨基酸2.53%，17种氨基酸中包含8种人
6、体必需氨基酸；总灰分6.80%，包含丰富的无机营养元素；总多酚18.5%；特别是水浸出物含量高，5次浸提总浸提率高达72.97%，其中高含量的总黄酮和二氢杨梅素体现了该植物的特点；对挥发油成分分析显示，其挥发油总得率较低，以叶绿醇、正十六酸和雪松醇为主 。,4.2 藤茶黄酮及酚、甙类成分,采用水、乙醇、丙酮等作介质，对不同产地藤茶原料的提取物中经萃取、分离，主要得到黄酮类化合物，其次是酚类及甙类化合物。覃洁萍等从广西瑶族藤茶的醇提物中分离到双氢杨梅树皮素（DL-dihydromyricetin,C15H12O6）和杨梅树皮素（Myricetin,C15H10O6）两种黄酮物质。袁阿兴等以广西产
7、藤茶地上部的水煎液冷却后得到沉淀和水相部分，从沉淀分离得到双氢黄酮醇结晶(福建茶素，即蛇葡萄素或称二氢杨梅素)，水相部分经浓缩、乙酸乙酯萃取、分离得到4种结晶化合物：龙涎香醇、-谷甾醇、杨梅黄素（即杨梅素）和杨梅甙（杨梅素-鼠李糖甙）。,对藤茶丙酮-水提取物进行分离，乙酸乙酯萃取、聚酰胺柱层析纯化得到1种化合物（芦丁）；水相部分经分离得到3种化合物：没食子酰-D-葡萄糖、没食子酸乙酯和没食子酸。对福建藤茶醇提物再进行乙酸乙酯抽提得到的浸膏，分离出9种化合物：棕榈酸、-谷甾醇、大黄素、没食子酸甲酯、槲皮素、槲皮素-3-O-D-葡萄糖甙、花旗松素、洋芹素和蛇葡萄素；以后再次从醇提物中分离得到2种新
8、的甙类化合物：藤茶甙(grossedentataside)和藤茶素（grossedentstasin)。,4.3 藤茶黄酮类成分的提取分离及测定方法,就现有资料显示，黄酮是藤茶中含量最高的一类化合物，原料经脱脂脱色后，一般以80%95%乙醇浸泡或回流提取得到总黄酮，也可以甲醇回流或用水煎煮法提取得到总黄酮粗提物；依据藤茶黄酮溶于热水不溶于冷水、以及两种组分在乙醇、甲醇、丙酮中的溶解性差异对总黄酮提取液采用除醇、重结晶、过柱等方法加以分离，可得到二氢杨梅素、杨梅素2种主要活性成分。覃洁萍等以ZrOCl28H2O 为络合剂，以二氢杨梅素为标样，用差示分光光度法，最大吸收波长为318nm，测得广西瑶
9、族藤茶精制品中总黄酮含量高达45%以上；何桂霞等以同样方法对湖南不同产地不同采收期藤茶的叶、茎以95%乙醇提取总黄酮并进行含量测定，结果以5月份采集的藤茶叶中总黄酮含量最高，为41.245.3，叶中含量高于茎中34倍。,用甲醇回流提取藤茶黄酮, 以二氢杨梅素为标样，用三氯化铝分光光度法，最大吸收波长为294nm，总黄酮含量达45%左右，以薄层色谱法测得二氢杨梅素的含量高达37.438.5；熊皓平等用95%的乙醇回流浸提显齿蛇葡萄幼嫩茎叶中有效成分，以类似方法测得幼叶干样及加工成品中总黄酮含量均在36%以上。,5 藤茶药理作用与生物活性的研究,5.1藤茶水煎剂及藤茶制剂的药理作用与临床应用基于藤
10、茶在民间的药用功效，经动物药理试验及临床应用，均显示藤茶水提液、藤茶冲剂或复方藤茶制剂具有增强免疫功能、抑菌、消炎、镇痛、消肿等作用，毒理学试验表明长期饮服藤茶无毒副作用。,5.2 藤茶黄酮成分的生物活性研究,5.2.1 藤茶总黄酮及二氢杨梅素的抑菌作用体外抑菌试验显示，直接作用于金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、大肠埃希菌时，藤茶总黄酮有明显抑菌作用，其抑菌浓度多低于1.0mg.mL-1；小鼠体内抑菌试验表明,藤茶总黄酮局部给药口腔粘膜0.73g.kg-1，对金葡菌和甲型溶血性链球菌感染的小鼠具有一定的保护作用,小鼠存活率分别提高50%和40%左右；金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌
11、、大肠杆菌、副伤寒沙门氏菌等7种致病菌株的抑菌作用显示，二氢杨梅素与盐酸黄连素的抑菌效果相当，酸性和碱性环境下，二氢杨梅树皮素的抑菌效果显著强于中性条件下的抑菌效果。,5.2.2 藤茶总黄酮及二氢杨梅素的抗氧化作用,淋淑英等对藤茶黄酮分离成分二氢杨梅素在植物油和猪油体系中的抗氧化效果进行了研究。以95%纯度的二氢杨梅素添加到猪油体系中，测定丙二醛吸光值和过氧化物值来评价其抗氧化效果，结果显示，二氢杨梅素在猪油体系的抗氧化作用明显，最优添加量为0.04%；当同时添加0.02%的抗坏血酸或柠檬酸或EDTA作增效剂时,可有效地提高二氢杨梅素的抗氧化性能；在植物油体系中设定DMY(二氢杨梅素)与其它抗
12、氧化剂浓度为0.02%，以MDA（过氧化脂质代谢物-丙二醛）作检测指标, 各种抗氧化剂的抗氧化效果依次是: TBHQDMY儿茶酚大豆异黄酮葛根异黄酮对照；DMY在00.1%的浓度范围内,其抗氧化效果随浓度增加而增强；发挥抗氧化效果的适宜pH45，醇溶DMY优于水溶，低浓度下DMY的抗氧化效果受Fe2+ 影响而降低。,何桂霞等研究了藤茶总黄酮及二氢杨梅素清除氧自由基和抗脂质过氧化作用。藤茶总黄酮(TCF)对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶系统产生的O2-有显著的抑制作用，存在良好的量效关系；TCF对大鼠肝匀浆自氧化的抑制作用在2.540.0 g.mL-1范围内呈剂量-效应关系，通过分光光度法测定过氧化产物M
13、DA，研究二氢杨梅素（DMY）的体外抗脂质过氧化作用，结果显示，DMY对离体的大鼠脏器组织匀浆脂质过氧化以及由 Fe2+-VitC 体系、Fe2+-H2O2体系、Fe2+-Cys体系诱导的组织匀浆及肝线粒体脂质过氧化均有较强的抑制作用，在DMY终浓度为520mol.L-1的范围内，呈现较明显的量效关系，对肝组织匀浆的抗氧化效果最显著。,5.2.3 藤茶总黄酮及二氢杨梅素的降血糖作用,钟正贤等将实验小鼠分为正常对照组、模型组、二甲双胍(150mg/kg)组, 每天灌胃给药1次，广西藤茶总黄酮（GXTF）大小剂量组分别125mg/kg和62mg/kg，对照组和模型组给予等体积蒸馏水，连续7d。于末
14、次给药后1h ,小鼠眼眶静脉丛取血测定血糖水平。与模型组比较，GXTF大小剂量组对四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖升高有抑制作用；于末次给药后1 h ，给药组ip.葡萄糖(2g/kg) 溶液或射肾上腺素(240g/kg)并开始计时，于0.5 、1h后，取血测定血糖值，结果表明, GXTF对0.5,1h葡萄糖引起的血糖升高具有明显抑制作用，具有明显对抗肾上腺素的升血糖作用；阳性对照药优降糖则有明显地降低正常小鼠血糖作用，而GXTF对正常小鼠血糖值未见明显影响；,急性毒性试验显示，GXTF对正常小鼠无明显毒副作用，最大灌胃量为26.0g/kg 。以正常小鼠、四氧嘧啶所致糖尿病小鼠模型及由葡萄糖、肾上腺素引起
15、的高血糖小鼠模型，进行双氢杨梅树皮素的降血糖试验。以二甲双胍(0.15g/kg) 组作阳性对照，每天灌胃双氢杨梅树皮素一次，大小剂量组分别为0.25g/kg和0.125 g/kg, 对照组和四氧嘧啶组给予等体积蒸馏水, 连续7d，末次给药后1h 测定血糖水平。结果显示，双氢杨梅树皮素对正常小鼠血糖无无明显影响；对四氧嘧啶所致糖尿病小鼠有明显的降血糖作用,其中高剂量组效果与阳性组对照组的效果相当；大、小剂量的二氢杨梅素对葡萄糖、肾上腺素引起的高血糖模型小鼠也有明显的降血糖效果。,5.2.4 藤茶总黄酮及二氢杨梅素的降血脂作用,动物实验结果表明，GXTF能降低高血脂症模型小鼠血脂和血糖水平；明显抑
16、制大鼠体外血小板聚集和体内血栓形成；提高D-半乳糖所致衰老模型小鼠血清和肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)活性，抑制丙二醛(MDA)的生成，说明GXTF具有降血脂和抗氧化作用、抗血小板聚集和血栓形成的作用。陈晓军等以高脂血症模型小鼠和实验性高脂血症鹌鹑进行藤茶总黄酮(TFAG)的降血脂实验，结果表明TFAG高、低剂量(400,200mg/kg)均有降低实验动物血清TC、TG及AI和升高血清HDL-C的作用,可抑制肝脏脂肪化病变动脉粥样硬化。,5.2.5 藤茶总黄酮及其主要成分的保肝护肝作用,对实验小鼠连续灌胃藤茶总黄酮(TCF/800，400，200mg/kg)7d，再腹腔注射0.1% CCl4的
17、花生油溶液致小鼠急性肝损伤，16h后测定肝损伤鼠血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、肝中超氧化物歧化酶(SOD)活性和肝中丙二醛(MDA)生成量，结果表明，TCF可降低肝损伤小鼠血清ALT、AST值，减少肝组织匀浆MDA的生成，增强SOD的活性，呈剂量依赖关系；病理学检查显示TCF对肝脏细胞的病理损伤有减轻作用；郑作文等证实广西藤茶双氢杨梅树皮素对四氯化碳和半乳糖胺致小鼠急性肝损伤具有保护作用。,5.2.6 藤茶黄酮类成分的其它药理作用,曾春晖等对小鼠脾细胞体外培养试验显示，藤茶二氢杨梅素(APS)对ConA诱导的小鼠淋巴细胞增殖有明显的增强作用，提示APS有免疫增强功能；藤茶
18、总黄酮在最大无毒浓度(62.5g.mL-1)下，对HBV基因转染的人肝癌细胞系2215细胞分泌乙型肝炎病毒HBsAg和HBeAg的抑制率分别为43.14%和33.76%，同时可一定程度地抑制HBVDNA的合成。在前人研究基础上，以鄂西藤茶为原料研究了藤茶总黄酮与水溶性多糖的综合提取工艺，并证实该工艺提取的藤茶总黄酮具有显著的体内外抗氧化、降血糖、抗肿瘤活性。,5.3 藤茶多糖的生物活性研究,由于藤茶植物中黄酮类物质的高含量，我国目前对藤茶植物成分的研究主要集中在藤茶黄酮方面，关于藤茶多糖的研究报道不多。从鄂西藤茶中提取藤茶水溶性多糖，其多糖粗品得率可达7%左右，经脱蛋白等初步纯化处理后得藤茶多
19、糖AGP得率约为4.5%，该多糖具有一定的抗氧化活性，并具有增强免疫与抗肿瘤效果。,6.藤茶水溶性多糖及总黄酮的提取工艺研究,6.1原料鄂西产藤茶（保健茶成品），由鄂西藤茶公司藤茶研究所鉴定为Ampelopsis grossedentata。经粉碎并过20目筛得藤茶粗粉，密封备用。6.2主要试剂与设备工业乙醇(95%以上)，浓硫酸、葡萄糖、苯酚、氯仿、正丁醇等均为AR级。植物组织粉碎机、电热恒温水浴锅、离心机、真空浓缩器，UV-VIS分光光度计等。,6.3 方法,6.3.1 藤茶多糖与总黄酮的综合提取根据藤茶总黄酮的溶解特性，本文通过以下工艺比较醇提黄酮再水提多糖（路线1）和同时热水浸提黄酮与
20、多糖（路线2）两条工艺路线的总黄酮、粗多糖得率，以比较两条综合提取工艺路线的优劣。,路线1：,藤茶粗粉按1:3料液比加入石油醚回流2次，1h/次，残渣以1:3料液比加95%乙醇回流提取2次，1h/次，合并醇提液，除去乙醇，加适量蒸馏水加热溶解并趁热过滤，滤液冷却析出晶体，离心，收集沉淀，再复溶析晶一次，干燥得总黄酮粗粉，按原料重计算得率。收集醇提后的残渣，挥干乙醇后，按1:30料液比加入蒸馏水于95水浴提取多糖2次，1h/次，收集滤液并浓缩为小体积，加入3倍体积的工业乙醇混匀后静置24 h，离心收集沉淀并以无水乙醇洗涤沉淀2次，干燥得粗多糖，按原料重计算得率。,路线2：,藤茶粗粉按1:3料液比
21、加入石油醚加回流2次，1h/次。残渣按1:30 料液比加入蒸馏水于95水浴浸提2次，1h/次。趁热过滤，浓缩滤液为小体积后、冷却低温放置2-3d，充分析出晶体。离心并收集沉淀（同路线1），得到总黄酮粗粉。对离心后的上清液加入3倍体积的工业乙醇，混匀后静置24 h（同路线1），得粗多糖。,6.3.2 多糖含量的测定与提取效果的两种表示方法,苯酚-硫酸法测定多糖含量7。多糖得率表示方法：以葡萄糖制作标准曲线，回归方程为A490=0.0235X+0.0039，r=0.9995。测定多糖粗提液中多糖含量后，换算成原料多糖得率，用以表示少量原料的多糖提取效果。计算公式为 多糖得率(%)=（Xa0.910
22、-4）/ W X-由粗提液吸光度据标准曲线回归方程求得的糖含量(g)； a-取样体积倍数； W-原料重(g) ； 0.9-葡萄糖对多糖的换算系数； 10-4-重量单位换算系数。,6.4 结果与分析,6.4.1 浸提单因素对水溶性多糖得率的影响6.4.1.1浸提时间的影响 设定提取温度90，水料比20:1，提取1次，不同浸提时间的水溶性多糖得率如图1所示。随提取时间的延长而得率增加，但总的来看增加幅度不大。,6.4.1.2 水料比的影响,图2所示，固定提取温度90，浸提时间为2h，提取1次，水溶性多糖得率最初随水料比的增加而提高, 30:1时达到最高,而后有所下降,可能与同一水浴加热时水料比大者
23、升温慢有关。,6.4.1.3 温度的影响,固定水料比30:1，浸提时间为2h，提取1次，不同温度下的多糖得率如图3所示。水溶性多糖得率随温度的上升而逐渐增加，并且在设定的温度范围内，相邻两温度间的得率相差不大，但间隔2030的处理间多糖得率差异明显。出于对常规提取时温度的可控性考虑，未对100以上的温度进行实验。,6.4.1.4 提取次数对多糖提取率的影响,设定提取温度90，水料比30:1，提取时间2h，少量原料提取3次，分别测定每次提取的多糖含量。如图4所示，若以3次提取总量合为100%提取率，第1次提取率为91.04%,第1、2次提取率之和达到97%以上。所以在优化其它因素以后，选择提取2
24、次为宜，既减少后期浓缩的困难，又节省能耗。,6.4.2 中心组合试验结果与回归方程的拟合,参考单因素试验结果，以温度、料液比和浸提时间作主要因素，中心组合设计（CCD）参照文献方法，因素与水平配制如表1。为避开二次提取时残渣转移的损失所带来的影响，每个组合仍以提取1次的多糖得率计算。,表1 中心组合设计的因素与水平表Tab.1 Factors and levels table of central composite design(CCD),表2 中心组合试验方案与结果Tab.2 Experimental design and results of the CCD,中心组合试验方案及结果如表2
25、所示。以水溶性多糖得率为响应值（Y），通过SAS软件的RSREG程序对实验资料进行响应面分析（RSA）,经二次回归拟合后求得响应函数，即回归方程为Y=3.40667+0.41750X1+0.01750X2+0.38000X3-0.18083X12-0.26583X22+0.10417X32 -0.09000 X1X2+0.07500X1X3-0.22000X2X3 其决定系数R2为0.9322，试验值与预测值非常接近。即95、25:1水料比、提取4 h，提取一次水溶性多糖得率计算值和试验值分别为4.20%、4.24%，与求偏导得到的极值点计算值（4.33%）接近。,6.4.3 乙醇用量及沉淀时
26、间对粗多糖得率的影响,图5显示，随乙醇用量的增加，水溶性粗多糖得率增加。加入3倍体积的乙醇，粗多糖得率约7.3%，以后再增加乙醇用量，粗多糖得率增加不多。有资料表明，达到一定用量后再随之增加的粗多糖中实际上增加的多糖较少，且以杂质增加居多，同时考虑成本及固液分离的工作量，选定以3倍体积的乙醇用量为宜。,加入乙醇后，不同静置时间对粗多糖得率的影响结果见图6。沉淀224 h的粗多糖得率在7.27.4%之间，各处理间差异不明显，,甚至6h以后随着时间的延长，粗多糖得率有下降的趋势。本试验选择沉淀2h，还可提高工作效率。,6.4.4 总黄酮与粗多糖综合提取得率,两条综合提取工艺路线的总黄酮与粗多糖得率
27、如图7所示。,本试验结果显示，二条路线的粗多糖得率接近，分别为6.70%和6.63%；而总黄酮粗粉得率则以路线2（31.10%）明显高于路线1(21.30%)，可能与本试验中醇提黄酮不充分以及总黄酮在以醇为提取介质和水作提取介质的浸出效果不同有关。实际提取过程中，路线1在水提多糖的同时又获得了得率为6.05%的黄酮粗粉，加上醇提部分共计总黄酮粗粉得率为27.35%，仍明显低于路线2的得率。考虑同时水提总黄酮与粗多糖的低成本优势，以及提高工效，工艺路线2较适合藤茶总黄酮与粗多糖的综合提取，尤其适宜规模化生产。,6.5.2 初步确定可行的藤茶水溶性多糖与总黄酮的综合提取工艺路线为,藤茶粗粉石油醚脱脂脱色热水浴浸提滤液浓缩与静置分离总黄酮沉淀多糖分离粗多糖。在本艺条件下,提取两次的总黄酮粗粉和粗多糖得率分别达到31%和6.6%以上(以粗品重量表示)。本工艺路线成本低、工效快，适合规模化生产。有资料表明，藤茶总黄酮的含量可达38%甚至40%2,4，本试验中总黄酮得率低于文献报道值，可能与原料来源、提取及分析方法不同有关。综合提取的水溶性多糖与总黄酮粗品得率低于二者独立提取值，尚需对综合提取工艺参数作进一步优化。,
