1、第八章 抗生素发酵的代谢与调控生命科学学院胡庆森,8.1抗生素产生菌的代谢与调节8.2青霉素和头孢霉素的生物合成途径及其代谢调节机制8.3选育青霉素生产菌的方法,11:44:57,菌体合成代谢的产物可根据它们与菌体生长、繁殖的关系分为初级代谢产物和次级代谢产物。 初级代谢产物是指微生物产生的，生长和繁殖所必需的物质，如蛋白质、核酸等。 次级代谢产物是指由微生物产生的，与微生物生长、繁殖无关的一类物质。,8.1 抗生素产生菌的代谢与调节,11:44:57,次级代谢产物生物合成至少有一部分是和与初级代谢产物无关的遗传物质有关，同时也与这类遗传信息产生的酶所控制的代谢途径有关。 抗生素、色素、毒素等
2、是与初级代谢产物(如氨基酸、核酸)相对产生的次级代谢产物。 抗生素的合成代谢途径比氨基酸、糖代谢复杂得多，但与初级代谢产物有着密切的联系。,抗生素是生物包括微生物、动、植物在内在其生命活动过程中，所产生的或由其它方法获得的，能在低微浓度下有选择性地抑能或影响其它生物机能的有机物质。,11:44:57,8.1.1 次级代谢产物和初级代谢产物的关系,11:44:57,从生化角度讲，由初级代谢产物衍生为次级代谢产物的基本途径： 葡萄糖碳架掺入途径 莽草酸途经 与核苷有关的途径 聚酮体和聚丙酸途径 氨基酸衍生途径 甲羟戊酸途径 其他复合途径 初级与次级代谢都受到微生物的代谢调节，在调控上相互影响。因此
3、在研究次级代谢时候，必须考虑初级代谢。次级代谢中所涉及到的酶常常与初级代谢的酶不完全一致。,11:44:57,从遗传代谢观点看，两种代谢都受到核内DNA调控， 次级代谢产物还受到与初级代谢产物生物合成无关的遗 传物质的控制。,质粒产物,11:44:57,8.1.2 抗生素产生菌的几种主要调节机制,1、诱导调节2、反馈调节3、碳分解代谢物调节4、氮分解代谢物调节5、磷酸盐的调节6、细胞膜透性的调节,11:44:57,1. 诱导调节调节,在次级代谢过程中，有些参与次级代谢产物合成的酶为诱导酶，如链霉素生物合成中的转脒基酶、甘露糖链霉素酶等。 诱导酶需要有诱导物存在才能形成。诱导物起诱导作用，能提高
4、次级代谢产物的产量。例如，蛋氨酸能提高头孢菌素C的产量，其原因是蛋氨酸的诱导生物碱合成酶的合成作用，而不是作为硫源的供给物。,生物碱合成酶,生物碱,色氨酸,11:44:57,-酮戊二酸乙酰CoA,高柠檬酸,顺-高乌头酸,高异柠檬酸,-酮已二酸,-氨基已二酸（ - AAA）,赖氨酸,L-AAA-半胱氨酸,L-AAA -半胱氨酸-D-缬氨酸,青霉素G,高柠檬酸合成酶,反馈抑制,2. 反馈调节,11:44:57,Cys,Val,青霉素G,11:44:57,3、碳分解代谢物调节,碳分解代谢物调节分为分解产物阻遏和分解产物抑制两种。 抗生素生产中，可能存在上述两种机制。 葡萄糖对放线菌素合成-分解产物阻
5、遏 青霉素、新霉素生物合成-分解产物抑制 需要注意的是，其他碳源也有可能有分解产物阻遏作用。如柠檬酸阻遏新生霉素合成，此时葡萄糖发生不阻遏作用。,11:44:57,4、氮分解代谢产物调节,初级代谢中，速效氮源（如氨水）能抑制作用于含氮底物酶的合成。如铵盐抑制蛋白酶合成。 次级代谢同样存在氮分解代谢产物调节。 缓慢利用的氮源如黄豆粉（分解为氨基酸和氨）可以减弱氮分解代谢产物阻遏；而利用较快的铵盐在合成链霉素时，效果较差。 头霉素发酵中也存在氮分解代谢产物调节。,11:44:57,Bridger认为：铵离子影响pH和电化学的质子梯度，改变能量代谢，还涉及细胞壁与膜结构功能。,11:44:57,5、
6、磷酸盐调节 磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成分，还是调节次级代谢产物生物合成的重要因素。过量的磷酸盐也象葡萄糖一样抑制次级代谢产物的合成，这种抑制作用被称为磷酸盐调节。,11:44:57,过量磷酸盐对四环素类、氨基糖苷类、多烯类和大环内酯类等32种抗生素的生物合成产生阻抑作用。这些次级代谢产物的生物合成只有在亚适量的磷酸盐浓度下才能进行。 磷酸盐浓度 10 mmol/L 常常对次级代谢产物的合成有抑制作用。磷酸盐浓度的高低还能调节次级代谢产物合成期出现的早晚。磷酸盐起始浓度高，耗尽时间长，合成期就向后拖延。如金霉素、万古霉素等的发酵都存在此类现象。磷酸盐的浓度还可能逆转微生物合成抗生素的
7、状态。,11:44:57,磷酸盐调节抗生素的合成机制直接作用：磷酸盐自身影响抗生素合成 影响抗生素合成过程中磷酸酯酶（如焦磷酸酶 ）和前体中某些酶的活性磷酸盐调节细胞内其他效应物（如ATP）进而影响抗生素合成 ATP影响抗生素和糖代谢过程中某些酶的活性,11:44:57,6、细胞膜透性的调节,菌体细胞吸收外源营养物质和分泌代谢产物到培养基中能力的大小直接关系到发酵产物的产量。 实例1：诱变获得的青霉素高产菌，由于提高了细胞膜摄取无机硫酸盐能力，增大了细胞内硫酸盐浓度，促进了半胱氨酸合成，增大了合成青霉素的前体。 弗氏链霉菌+ 新霉素 弗氏链霉菌- 不产新霉素的弗氏链霉菌-,培养基中加入油酸钠或
8、氯化钠，改变其细胞膜的脂肪酸组成，原菌株可以恢复成亲株。,实例2：,脂肪酸组成似乎是细胞摄取合成新霉素所需氨基酸的控制因素,11:44:57,8.1.3 抗生素合成的关键酶及其调节,11:44:57,抗生素合成的关键酶及其调节,11:44:57,8.1.4 影响次级代谢产物产量的因素及其改进因素,11:44:57,1、青霉素和头孢霉素的生物合成途径及其调节机制,11:44:57,青霉素的历史1928年 Flenming发现青霉素；1940年由Florey和Chain提取并经临床证实青霉素具有卓越疗效和低毒；1941年 英美合作开发青霉素；采用表面培养法生产青霉素1943年 成功创造了崭新的青霉
9、素深层培养工艺；1945年，弗莱明、佛罗理和钱恩三人，共同获得了诺贝尔奖,8.1.5 青霉素的历史与现状,11:44:57,起初培养青霉菌时，发酵液中主要合有五种青霉素成分，即青霉素F、G、X、K和双氢和双氢F。其中青霉素G（即苄青霉素）较为稳定，作用最强，产量也较高。 青霉素青霉素G是应用于临床的第一个抗生素,青霉素G为一不稳定的酸，可和碱金属结合成盐类。,11:44:57,我国青霉素基本上集中于华药、哈药、石药和鲁抗四家，四家产量占国内青霉素总产量的75。华北制药年产量达到70008000吨（亚洲第一，世界第二）青霉素原料药生产能力。,11:44:57,8.1.6 青霉素和头孢霉素的生物合
10、成途径及其代谢调节机制,同属于-内酰胺类抗生素共同的中间体-氨基己二酰半胱氨酰缬氨酸,双氢噻嗪环,噻唑环,11:44:57,11:44:57,1、青霉素的生物合成与碳源分解代谢产物的关系,乳糖被缓慢水解成单糖的速度正好符合青霉素生产期合成青霉素的需要，而不会产生很高浓度的分解产物来抑制青霉素的合成。 碳源的缓慢利用是大量合成青霉素的关键。,8.1.7 青霉素和头孢霉素C合成的代谢调节,11:44:57,2、青霉素的合成与赖氨酸的反馈调节,-氨基己二酸是青霉素 和赖氨酸合成的共同中 间体。,高柠檬酸合成酶,Lys对高柠檬酸合成酶存在抑制作用,11:44:57,3、蛋氨酸对头孢霉素C形成的促进作用
11、,Met对头孢霉素C合成的促进作用，不一定是作为硫源的原因。,蛋氨酸:149.21,胱硫醚 :222.26,半胱氨酸：121.16,11:44:57, 含硫酸盐的培养基-丝状菌丝体 含Met的培养基-菌丝体膨大不规则，存在节孢子 节孢子将Val合并进头孢霉素C和青霉素N的能力大于其菌丝体，合成抗生素的能力较其他形态菌丝体合成能力要强。 抗生素的合成量与节孢子的数量呈正比例关系,11:44:57,正亮氨酸和Met的作用机制相同，它们作为一种调节物对头孢霉素C的合成起促进作用,头孢霉素C相对产量,培养基中Met含量,正亮氨酸,正亮氨酸也能诱导菌丝体分节为节孢子,11:44:57,8.1.8 选育青
12、霉素生产菌的方法,1、出发菌株的选择主要是产黄青霉（P.Chrysogenum ）51-20和点青霉,（P. notatum）,发酵单位：几十个单位,发酵单位：原种发酵单位：原种100U/mL；诱变诱变30000U/mL,11:44:57,2、切断代谢之路 （1）菌株的初级代谢和次级代谢处于分支代谢途径时，初级代谢产物的营养缺陷型突变株可使相应的次级代谢产物增加产量。 Leu-突变株，青霉素产量提高四倍 （2）青霉素的合成收到Lys的反馈抑制（抑制高柠檬酸合成酶），选育Lys -突变菌株，并在培养基中限量添加Lys,11:44:57,11:44:57,11:44:57,3、切断菌体自身的反馈调
13、节（1）选育结构类似物抗性突变株,Leu结构类似物三氟亮氨酸,11:44:57,（2）筛选自身耐受性突变株 不同菌株自身对产物耐受性不同，耐受性突变株可能是由于产物对合成途径中某一酶的反馈抑制被解除。,青霉素V,实例：筛选抗青霉素V的菌株产量提高到40000 U/mL,11:44:57,(3)筛选前体或前体结构类似物抗性突变株 选育毒性前体（或其结构类似物）抗性突变株，可以消除它们对生物生长与产物合成的抑制作用，提高产物合成。,苯乙酸或苯乙酰胺,青霉素V ：选育耐13 g/L的苯氧乙酸突变株，产量可达到50000U /mL,同理，可以选育苯乙酸或苯乙酰胺抗性突变株来提高维生素G的产量,11:4
14、4:57,（4）选育营养缺陷型回复突变株,当一种初级代谢产物是次级代谢产物的前体时，这种初级代谢的营养缺陷型回复突变株就有可能是次级产物高产菌株。,-氨基己二酸缺陷回复突变株半胱氨酸营养缺陷回复突变株,11:44:57,11:44:57,4、增加前体物质的合成,增加Val：选育对乙酰羟酸合成酶反馈抑制较小的突变株,丙酮酸 乙酰乳酸,Val,增加-氨基己二酸：基因工程技术克隆同型柠檬酸合成酶基因，使其在细胞内扩增；进一步体外诱变，使同型柠檬酸合成酶不受Lys的反馈抑制，增加增加-氨基己二酸的合成量。,乙酰羟酸合成酶,11:44:57,5、选育形态突变株 长期选育过程发现：青霉素产量逐步提高的过程
15、中，菌落直径逐渐变小，菌落表面由平坦变为褶皱，孢子也减少。可以依据此变化，寻找高产菌株。 深层培养时，菌丝形态的突变有利于溶氧时，也会有利于提高产量。,11:44:57,6、其他标记,（1）筛选抗生长抑制剂突变株,筛选抗重金属离子突变株（Cu2+,Hg2+,Co2+）原因：重金属离子本身对细胞有毒性，与青霉素结合能消除 毒性，产生抗性菌株（2）筛选耐消泡剂的突变株：减少消泡剂的用量，提高溶氧 方法：培养基中加入消泡剂进行筛选,（3）选育细胞膜渗透性好的突变株 实例：产黄青霉细胞膜渗透性发生突变，摄取无机硫酸盐能力增强，由于S元素参与半胱氨酸合成，这样青霉素的产量也得以提高。,11:44:57,
16、（4）构建基因工程菌株青霉素G酰化酶（pac）,E.coli D816,最适温度和通风条件，产量3000 U/L,11:44:57,8.1.9 青霉素发酵控制,1、碳源 青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、淀粉、天然油脂等。 乳糖是最好的碳源，葡萄糖在使用时，需要控制加入的浓度，常采用流加葡萄糖的方法来替代乳糖。,11:44:57,苯乙酸或苯乙酰胺、苯乙酰甘氨酸均可作为青霉素G的侧链前体。 菌体对前体的利用有两个途径：直接结合到分子中或作为养分，氧化为CO2和H2O。两个途径的比例主要取决于培养条件和所用菌株的特性。 为避免浓度过大造成菌体伤害，除基础料中加入0.7 g/L前体外。其余
17、按需要与氮源一同补入。前体的供应速率略大于生物合成的需要。,11:44:57,2、pH,pH 过高,添加糖、硫酸盐或无机氮源(避免超过7.0),pH 过低,添加CaCO3、NaOH、氨水、尿素或提高通风量,自动流加酸碱，控制发酵液pH维持在6.8-7.2,两种补糖策略,恒速补糖，酸或碱控制pH,根据pH来补糖（ pH 变化上升大，就多补）,11:44:57,3、温度 青霉菌的最适生长温度为30 oC,产物青霉素合成的最适温度为20 oC。 变温控制：不同阶段不同温度 生长阶段：较高温度，缩短生长时间；生产阶段适当降低温度，有利于青霉素的合成 0-5 h：30 oC 5-40 h： 25 oC
18、40-125 h：20oC 125-165 h：25 oC 比单独在恒定于25 oC发酵产量提高15%,变温控制实例,11:44:57,4、补料,发酵过程中，补加氮源如硫酸铵或尿素亦可提高发酵单位。 在发酵过程中，与料液一起补入非离子型表面活性剂表面活性剂如聚氧乙烯、山梨糖醇酐、单油酸酯、三油酸酯也能增加青霉素的产量。 在青霉素发酵过程中加入少量可溶性高分子如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、聚二已胺或聚乙烯吡咯酮能使青霉素产率增加能使青霉素产率增加38。,11:44:57,5、铁离子的影响,一般发酵液中Fe3+超过30-40 mg/mL，则青霉素发酵单位增长缓慢。,铁罐使用前必须处理，可在发酵罐罐壁涂上环氧树脂作为保护层，控制发酵液中Fe3+小于30 mg/mL 。,
