1、第三章 DNA的复制,第一节半保留复制的验证 半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型(conservetive model) 分散模型(Dispersive model)。,验证半保留复制的实验,一、Meselson-Stahl实验 二、Taylar实验 三、姐妹染色单体差别染色方法（sister- chromatid differential staining） 5溴脱氧尿嘧啶（5-Bromodeoxy uridine，简称BUdR） 斑色染色体（Harlequin chromosome） 四、Cairns复制模型型复制,图11-4 Taylor 蚕豆根
2、尖放射自显影实验。(a)按半保留复制预期DNA在复制过程中标记情况；(b)实验结果染色体放射自显影的图示。,第二节复制的起点、方向和终点,一. 研究方法： 1. 用同位素标记电镜观察及变性法2. 用噬菌体插入标记法 同步培养 不同步培养 3. 变性定性法（denaturation mapping） 4. 双向电泳法,图11-11不同步培养时各标记的拷贝数不同 复制起点标记的拷贝数应最多,二、原核的复制起点和方向,E.coli定点、双向对称复制。 T7在近一端的17处开始，向两端延伸。 枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。 质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组 进行时双向复制。 质
3、粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。 mt DNA进行D（displaced loop）环复制 真核有多个复制起点（i），双向等速复制。,D环复制,第三节DNA复制突变型的筛选,根据温度敏感性筛选同位素标记法筛选5溴尿嘧啶掺入法质粒温度敏感性的筛选根据抗药性筛选根据与突变有关的生物学功能筛选快停突变与慢停突变,第四节原核生物复制的酶系统,DNA合成酶DNA聚合酶的共同特点是： （1）需要提供合成模板； （2）不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH； （3）合成的方向都是53; （4）除聚合DNA外还有其它功能。,表11-1 E.coli 中的三种DNA多聚酶,(一). DNA聚合
4、酶I的结构,DNA聚合酶有6个结合位点：(1) 模板结合位点；(2) 引物结合位点；(3) 引物3OH结合位点；(4) 底物dNTP结合位点；(5) 53外切酶结合位点；(6) 35校正位点。,(二). DNA聚合酶的功能,1. 53聚合功能 2. 35外切活性 3. 53外切活性 (1)切口平移（nick translation）； (2)链的置换； (3)模板转换（template-switching） 4. 内切酶活性,(三)DNA多聚酶的结构,全酶在DNA上的装配分为三个阶段：,（1）一个二聚体加上一个复合体识别引物模板形成一种前起始复合物。（2）DNA在于,复合体结合的位点构象发生改
5、变，而对核心酶产生了高亲和。使核心酶能与DNA结合。（3）二聚体结合核心聚合酶，使其二聚化。,二. DNA连接酶,其作用机制是分三步进行：1. 在真核生物中， EATPEAMPppi 在E.coli中， ENADEAMPNMN（烟酰胺单核苷酸）2. E-AMP上的AMP转移到DNA的5-PO4上使其活化3. 活化的5PO4与相邻的3OH作用形成 35磷酸二酯键，并释放出AMP。,三. 单链结合蛋白（SSB）,又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein）由177个aa组成在E.coli 中以四聚存在分子量为74KDa在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应。（
6、1）SSB之间的相互作用；（2）第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。,四.解旋酶(helicase),第五节 原核生物，噬菌体和病毒的复制起始和终止,一.环状DNA的复制,复制起始区的结构特点是：,（1）富含AT，这可能和双链易于解开起始 复制有关；（2）含有多个回文结构（914个GATC） 8个GATC较保守,CATC中的“ A”已甲基化;（3）具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合 位点；（4）此顺序的右侧毗邻区域有两个启动子，其可能的作用是：转录产生引物；产生复制必要的蛋白；产生调节功能的RNA；起转录激活作用。,1968年Gilbert提出滚环复制模型:,（1）共价延伸；（2）
7、模板链和新合成的链 分开;（3）不需RNA引物，在正 链3OH上延伸（4）只有一个复制叉;（5）形成多联体（concatemer ）;,滚环复制的电镜照片,哪些DNA进行滚环复制?,真核rDNA的扩增；F因子DNA的转移；裂解途经的复制； X174,M13.G4等；单链环状DNA噬菌体第二阶段复制都是进行滚环复制的。,二.DNA末端起始复制,线性双链DNA的复制有的是从一端开始的: 腺病毒（Adenovirus） 29 DNAs 脊髓灰质病毒（poliovirus)腺病毒DNA全长35937 bp，线性双链，两端各有反向重复顺序103162 bp，两末端各有50 bp为复制起点。其复制是以单链
8、置换（strand displacement）形成一个大的茎环或叫平锅形结构来进行的。,三.复制的终止,E.coli的复制终止现已发现有两个终止区域（terE,D,A和ter C,B），位于相遇点的另一侧100Kb处。每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的。ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性。终止需要tus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)，Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进。ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止。,第六节 复制的过程,一.半不连续复制,E
9、.colidUTPase，它能使dUTP变成dUMP，dUMP是不能作为DNA合成的底物，这样它就不再能加入DNA中。尿嘧啶N-糖苷酶（uracil N-glycosylase），它可以切断混合尿苷的糖苷键，形成无Pu和Py位点（apurinic or apyrimidinic ，AP），再由AP内切酶在AP位点切出一个缺口，进一步进行切除修复。,以下实验证实了这个解释：,(1)在dut -突变体（dUTPase缺失）中冈崎片段比在dut +中为短。这是因为U掺入机会增加；(2)在ung- （尿嘧啶N-糖苷酶缺失）突变体中，新合成的DNA约有一半由片段组成。(3)因为尿嘧啶N-糖苷酶缺失，不会
10、切除U的糖苷链，也就不会出现AP位点，所以碱沉淀时不易断裂，从而保持了半不连续的原貌。 在dut-, ung-双突变体中，结果和实验（2）相同，更进一步证实了此推测。,酵母的自主复制区,ARS(autonomously replicationg sequence)发挥复制起点的功能，但是过量的；酵母染色体的着丝粒附近为ARS1序列；ARS1分为A,B,C三个功能区, A,B起主要作用,C起次要作用；A区为15bp,其中11个保守，称ACS (ARS consensus sequence)。有复制起始子的功能；B区约为80bp,含B1,B2,B3三个功能区；B3是ABF1（ARS-binding
11、 factor 1）结合区。,酵母的复制,ORC：由6个亚基组成相当于DnaA和的O蛋白，与 A/B1结合，结合于游离的DNA Cdc6:相当于DnaC,及的P蛋白，使Mcm蛋白结合到复合体上。此对在Origin上起始复制是必须的。 Mcm: DnaB 螺旋酶。即 licensing factorABF1（转录因子）结合于B3,原核和真核生物复制体系的比较,E.coli SV40/人 酵母 功能 DnaA O T抗原 ORC 起始蛋白 DnaB DnaB T抗原 MCM 解旋酶 DnaC P ? Cdc6 装配因子 DnaG DnaG Pol-引发酶 Pol-引发酶 引发酶 Pol的 亚基 P
12、ol Pol,Pol 聚合酶 Pol的亚基 Pol Pol,Pol 校正 Pol的亚基 PCNA PCNA 滑动钳 复合体 RF-C RF-C 滑动钳装配器 SSB RF-A RF-A 单链结合蛋白,Pvu Bg1 Bam H1 Bam pBR322 TEL TEL 四膜虫rDNA ARS Pvu Bg1 Bam H 连接 Pvu 转化酵母 Pvu 传几代酵母DNA Pvu Pvu 连接 转化酵母 传几代 图 11-56 四膜虫与酵母TEL的拼接以及酵母细胞将其特有的TEL加到四膜虫 的TEL上(参考Shampg,J and Blackburn et al: Nature1984,310:154-157),真核生物与原核生物DNA合成的区别,真核DNA复制和原核DNA复制的区别,1、 真核DNA复制为多个复制起点。2 、真核DNA复制时DNA聚合酶有五种（、和），其中只有酶具有35外切酶活性；而原核生物只有三种DNA聚合酶（pol、），且都具有35外切酶活性。真核的pol和分别负责合成前导链和后滞链，而原核的pol是两者兼顾。3、真核细胞内DNA引物酶和pol紧密偶联，而在原核细胞内引发酶是和解旋酶偶联在一起，形成复制体的一部分。,作业：1、图示说明DNA半保留复制的机制证明。2、DNA复制为何选择RNA作为引物？3、试比较原核与真核生物DNA复制的异同。,
