1、 I 摘要 由于金属纳米粒子和金属氧化物纳米粒子比表面积大 、表面能高、生物兼容性好 ,因此可以用作生物标记物制备传感器 ,实现化学检测信号的放大 ,提高分析检测的灵敏度。本文以金属氧化物纳米材料构建胆固醇电化学生物传感器，并在灵敏度、选择性和检测限等性能测试方面取得了良好的效果。 实验选用氧化锌纳米颗粒（ ZnO NPs） ,结合金纳米颗粒 (AuNPs)、银纳米线 (AgNWs)制备电化学生物传感器，用于胆固醇浓度的测试。 通过研究，得到最制备胆固醇生物传感器的要求，最终结果表明这种生物传感器 件可以用于进行胆固醇的检测。本研究论文主要是通过发展新型的生物纳米材料及其固定方法，以达到改进固
2、定生物组分活性、提高传感器灵敏度等目的，具体内容如下： 1 第 2 章中，制备了 ZnO NPs， 构建基于 ZnO NPs 和羧甲基纤维素钠（ CMC）层层修饰的的高灵敏电化学酶传感器，实现对过氧化氢的检测。 2. 第 3 章中，制备了 AuNPs，并结合 ZnO NPs 制备检测胆固醇的酶生物传感器。用电化学交流阻抗 (EIS)验证了了层层组装的过程。扫描电镜照片 (SEM)和透射电子显微镜 (TEM)考察了电极上薄膜的形貌。该薄膜修饰的电极对底物胆固醇溶液表现出较高的灵敏度。 3.第 4 章中，发展了基于 ZnO NPs 与 AgNWs 结合的微型酶传感器。通过实验证明，修饰了复合材料的
3、电极能够快速、灵敏检测胆固醇的浓度。 关键字 : 生物传感器， 氧化锌纳米颗粒，金纳米颗粒，银纳米线，电化学检测 万方数据II Abstract Since the metal nanoparticles and metal oxide nanoparticles specific surface area, high surface energy, bio-compatibility, it can be used as a biomarker for preparing sensors, chemical detection signal amplification, to improve
4、 analysis and detection sensitivity. In this paper, we have built a cholesterol electrochemical biosensor based on metal oxide nanomaterials, and have achieved good results in terms of sensitivity, selectivity and detection limit. The experiment selects the Zinc Oxide nano particles ( ZnO NPs), the
5、gold nano particles (AuNPs), and the silver nano wires (AgNWs) to prepare the electrochemical biosensor, which is used for the test of cholesterol concentration. Through the research, we get the request of the cholesterol biosensor, and the final results show that the biosensor can be used for the d
6、etection of cholesterol. This research paper is mainly through the development of new biological nano materials and its fixed method, in order to achieve the goal of improving the activity of the fixed biological component and the sensitivity of the sensor, the specific content is as follows: 1. In
7、chapter 2, the ZnO NPs was prepared, and the highly sensitive electrochemical enzyme sensor based on ZnO NPs and sodium carboxymethyl cellulose (CMC) was constructed to realize the detection of hydrogen peroxide. 2. In chapter 3, prepared AuNPs, and combined with the ZnO NPs prepared enzyme biosenso
8、r for determination of cholesterol. Using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) has confirmed the layer by layer assembly process. Scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscopy (TEM) investigated the morphology of thin film on the electrode. The film modified electro
9、de on the substrate cholesterol solution showed higher sensitivity. 3. In chapter 4, The micro enzyme sensor based on ZnO NPs and AgNWs was prepared, and the electrode of the composite was proved to be fast and sensitive to detect the concentration of cholesterol. Key words: biosensor, Zinc Oxide na
10、noparticles, gold nanoparticles, silver nanowires, electrochemical detection 万方数据III 目录 第一章 绪论 . 1 1.1 引言 . 1 1.2 生物传感器的概述 . 2 1.2.1 生物传感器的的定义、原理和分类 . 2 1.2.2 生物传感器的特点 . 4 1.3 电化学生物传感器的概述 . 4 1.3.1 电化学生物传感器的定义及工作原理 . 4 1.3.2 酶的固定化方法 . 6 1.4 纳米材料的概述 . 7 1.4.1 绪论纳米材料的的定义、分类 . 7 1.4.2 绪论纳米材料的特性 . 8 1.4
11、.3 纳米材料在电化学生物传感器中的应用 . 11 1.5 本课题目标及意义 . 13 第二章 基于纳米氧化锌颗粒的过氧化氢生物传感器的研究 . 16 2.1 引言 . 16 2.2 实验部分 . 17 2.2.1 试剂、材料与仪器 . 17 2.2.2 溶液配制 . 18 2.2.3 纳米 ZnO 的制备 . 20 2.2.4 ITO/ ZnO /CMC/HRP 电极的制备 . 20 2.2.5 测试 . 21 2.3 结果与讨论 . 21 2.3.1 材料表征 . 21 2.3.2 ITO/ZnO/CMC/HRP 修饰电极的循环伏安行为 . 22 2.3.3 测定条件的优化 . 23 2.
12、3.4 电化学阻抗 . 26 2.3.5 扫描速率 . 27 2.3.6 计时电流 . 28 2.4 本章小结 . 30 第三章 基于纳米氧化锌颗粒和金纳米颗粒的胆固醇生物传感器的研究 . 31 3.1 引言 . 31 3.2 实验部分 . 32 3.2.1 试剂、材料与仪器 . 32 3.2.2 金纳米颗粒的制备 . 32 3.2.3 CHOx/ZnO/Au/APTES/ ITO 电极的制备 . 32 3.2.4 测试 . 33 3.3 结果与讨论 . 34 3.3.1 结构表征 . 34 3.3.2 CHOx/ ZnO/ Au /APTES/ ITO 的电化学传感研究 . 34 3.4 本
13、章小结 . 39 第四章 第四章基于纳米氧化锌颗粒和银纳米线的胆固醇生物传感器的研究 . 40 4.1 引言 . 40 4.2 实验部分 . 41 4.2.1 试剂、材料与仪器 . 41 万方数据IV 4.2.2 银纳米线的制备 . 41 4.2.3 胆固醇生物传感器的制备 . 41 4.3 结果和讨论 . 42 4.3.1 材料的表征 . 42 4.3.2 电化学性能研究 . 43 4.4 本章小结 . 53 第五章 总结与展望 . 54 参考文献 . 55 附录 1 攻读硕士学位期间撰写的论文 . 60 附录 2 攻读硕士学位期间申请的专利 . 61 致谢 . 62 万方数据南京邮电大学专
14、业学位硕士研究生学位论文 第一章 绪论 1 第一章 绪论 1.1 引言 随着科技的发展 ,在经历了第一代、第二代生物传感器后，出现了一种不需要电子媒介物的酶直接与电极反应的第三代酶传感器 1，引起了更多人的研究兴趣。在制备传感器的过程中，很重要的一点是如何把酶分子固定到电极表面且保持其稳定性和生物活性。但是，传统酶的固定化方法虽然在可以一定程度上增强生物催化剂的稳定性，但增强幅度有待进一步提高，同时酶的负载量小、暴露在空气中容易变性、电子的传输递能力也低等一系列问题 2,不利于传感器的制备。现在，具有高比表面的新型纳米材料不断被引入酶的固定化领域，因为大孔道、高比表面积的纳米材料中可以固定更多
15、的酶，有利于在固定化与催化过程中酶蛋白和底物的反应，从而酶的固定化和催化效果得到提高。由于纳米材料具有比表面积大、稳定性也高和生物兼容性好 3等一系列特点，而且还能在酶的电子传递过程中体现出其特有的催化效果。因此电化学领域中一些新型功能纳米材料可以作为良好的电子传递介质应用于生物传感器的制备 4-6。 胆固醇是人体中最丰富的类固醇，以游离态的胆固醇和酯化态的胆固醇两种形式存在于人体 中。血清中胆固醇正常的浓度范围是 3.16.7 mmol.L-17。当胆固醇浓度超过正常水平时 ,糖尿病、心脏病、动脉粥样硬化等多种疾病就会产生。我们知道糖尿病是一种常见病，而且在我国及全世界的发病率都很高。发达国
16、家糖尿病患病率在 6-10%以上 ,我国糖尿病患病率约在 2-4%8。在临床上 ,只通过检测血糖一个参数是远远不够的，为了早点发现并发症和及时治疗 ,还需要定期检测一些其他的生化指标。例如为预防糖尿病而引起的冠心病、高血压、脑血管病等各种疾病 ,就需要检测胆固醇等相关物质的含量。所以检测全血的总胆固醇的 对于预防糖尿病和糖尿病并发症的发生有着很重要的意义。另外，胆固醇在血液中还会与脂蛋白结合形成三种脂蛋白，包括极低密度脂蛋白 (VLDL)、低密度脂蛋白 (DLL)与高密度脂蛋白 (HDL)9，很多临床实践证明 ,当血液中总胆固醇的浓度超过 200 mg/dL 时 ,动脉粥样硬化程度、冠心病发病
17、率都会变大，当总胆固醇达到 260 mg/dL 时 ,冠心病的发病率比总胆固醇浓度为 200 mg/dL时高 7 倍 ,死亡率也会变高 10。通过上面的介绍可以看到 ,测定全血总胆固醇的含量是十分重要的，这已经成为临床诊断中一个很重要的参考指 标。通过测定胆固醇浓度来评估人体的健康状况，减少各种疾病的发生。 目前 ,基于酶法测定的操作简单、选择性好、灵敏度高等优点 ,所以胆固醇的检测方法大多万方数据南京邮电大学专业学位硕士研究生学位论文 第一章 绪论 2 数都是用固定化酶的方法来制备生物传感器，然后通过电化学方法检测。电化学方法测定胆固醇的主要机理是：用胆固醇氧化酶和辣根过氧化物制备酶修饰电极
18、，胆固醇氧化酶专一性的催化氧化溶液中的胆固醇，并产生 H2O2 产物，而生成的 H2O2 在辣根过氧化物酶的作用下被氧化，释放出氧化电流，电流的大小与样品中胆固醇浓度成正比。 其反应的原理方程为：酯化胆固醇 (CE)+H2O 胆固醇酯酶 游离胆固醇 (ch)+脂肪酸 游离胆固醇 (ch)+O2 胆固醇氧化酶 4一胆甾烯酮 + H2O2 H2O2 辣根过氧化物酶 O2 +2H+2e- 通过使用各种修饰方法将酶等生物活性物质牢固稳定地结合在电极表面上 ,而构建电化学生物传感器的关键就在于如何将高含量的生物大分子稳定的固定在电极表面并保持其良好的生物活性。将纳米材料其用于电极表面的修饰材料，可以 增
19、强电极表面修饰物质的负载量 ,为生物分子提供一个生物兼容性良好的微环境 ,增强了传感器的稳定性 ,提高了传感器的灵敏度，从而较好提高生物传感器的分析性能。 利用纳米材料独特的性质，将其修饰到电极上，不仅可以使其快速化、微型化及多功能化，而且它还具有灵敏度高、选择性好、稳定性高、回应速度快、检测范围宽和耐负荷性高等优点。因此，将一些新兴的检测原理与技术和功能纳米材料相结合，以提高检测方法的灵敏度和准确性，实现对待测物质的精确检测。 1.2 生物传感器的概述 1.2.1 生物传感器的 的定义、原理和分类 国家标准 GB7665-87 对传感器下的定义是：“能感受规定的被测量并按照一定的规律转换成可
20、用信号的器件或装置，通常由敏感元件和转换元件组成” 11-12。传感器是一种检测分析物的装置，它能感受到被测量的信息，而且能将检测到的信息，按一定顺序变换成为电信号或者其他形式的信息输出来，然后将信息进行传输、处理、记录、分析，得出结果。 在 生物传感器 的 实际 制备 中，主要 使 用酶、抗体等作为 被测物质的感应物 。 因此固定化这些物质是 制作生物传感器的关键。这些 物质 的信号转换能力决定 了 生物传感器的 性能是否良好。生物传感器通过对生物敏感材料进行固定化处理以 用作识别元件 (酶、抗体、 DNA、核酸等 ),然后借助另一部分的元件 (如 ITO 电极、金电极、场效应晶体管等 )对
21、信号进行传输并且进行转换化处理 ,再利用传感器的另一部分即信号放大处理装置和仪器设备等对信号进行进一步处理 ,最后构成一个完整的传感器装置 13,其结构示意如图 1.1 所示。 万方数据南京邮电大学专业学位硕士研究生学位论文 第一章 绪论 3 图 1.1物传感器的原理示意图 由图 1.1 可以看出：生物传感器由两部分组成 :一是可以识别被分析物的感受器 ,即生物的识别元件 ,这部分是对被分析物进行选择和识别，然后将被分析物的信号传输到另一部分，另一部分信号转换器也就是换能器 ,它是将从上一步获取的分析物的信号从通过转换处理变成另一种形式传输到信号处理器，最后进行记录、分析。生物传感器就是利用所
22、修饰的生物体分子的识别能力 ,将其固定在适当的载体上 ,形成一种特殊的薄膜 ,将生物分子识别被分析物所反应产生的各种变化 (如 pH 值的变化、质量变化、电子转移等 )转换成可处理测量的信号 ,然后再通过数字化或其他的处理 ,最终通过仪器显示端来记录结果。 生物传感器的原理： 被检测的物质经过扩散作用进入待测物质的材料中，经过传感器上生物分子的有效识别功能，由此发生反应，产生的信息后被相应的换能器转变成可以测量处理的电信号，然后再经过仪器放大记录并输出最终的检测结果，这样就可以测出被测物质的浓度 14。 生物传感器的种类： 根据生物传感器中分子识别元件即敏感元件可分为五类：酶传感器（ enzy
23、mesensor），细胞传感器（ organallsensor），微生物传感器（ microbialsensor）组织传感器（ tis-suesensor）和免疫传感器（ immunolsensor） 15。所应用的敏感材料依次为酶、细胞器、微生物个体、动植物组织、抗原、抗体 16。具体的有：基于 GMR 效应的自旋阀生物磁传感器，有灵敏度高、线性程度好、易于集成等特点。 DNA 包覆的碳纳米管生物传感器。能知道抗癌药物是否到达了靶点或者毒素是否在破坏健康的细胞。电化学 DNA 纳米生物传感器，使 DNA 检测变得便捷而廉价。 万方数据南京邮电大学专业学位硕士研究生学位论文 第一章 绪论 4
24、1.2.2 生物传感器的特点 生物传感器具 有以下特点： （ 1）可以采用固定化生物活性物质作为催化剂 ,一些昂贵的试剂可以多次使用 ,克服了以往酶法分析试剂费用昂贵的缺点。 （ 2） 专一性强 ， 只对特定的 底液 起反应。 (3) 灵敏度很高，对一些含量极低的检测对象也能准确地反应。 (4) 操作也比较简单 ,可行性大，容易分析。 (5) 成本低 ,可以连续使用时 ,在各个领域便于推广普及应用。 （ 6）测定范围比较广 ,理论上可以制成测定所有生物物质的传感器。 1.3 电化学生物传感器的概述 1.3.1 电化学生物传感器的定义及工作原理 生物传感器中制备最多应用比较广泛的的 是电化学生物
25、传感器。电化学生物传感器是以生物活性物质为识别元件 ,以各种电化学电极为信号转换器 ,然后用电势、电流或电容作为检测信号的生物传感装置 17-19。 图 1.2 是电化学生物传感器的构成及工作原理示意图。其原理是当酶电极浸入到被测的溶液，待测的分析物会扩散进入到酶层里面，混合在一起并参与反应，大部分酶反应都会产生电极可以测定的有效物质，当反应达到稳态时，活性物质的浓度便可以通过电位或电流的模式来进行测定 20。因此，酶生物传感器又可以可分为电位型和电流型两类传感器 21。电流型传感器是在酶促反应发生时产生电流信号，并且输出，输出电流的大小与底物的浓度有关。电位型传感器指的是制作的酶电极与 参比
26、电极 之间发生反应，并且输出电位信号，电位与被测物质之间服从能斯特关系 22。电流型传感器与电位型传感器相比，效果更简单、直观。 万方数据南京邮电大学专业学位硕士研究生学位论文 第一章 绪论 5 图 1.2电化学生物传感器的构成及工作原理示意图 目前研究较 多的是各种酶电极。酶电极就是利用酶对生化反应催化的被测物质进行检测。在绝大多数情况下 ,生物酶会专一性的作用于被测物质并且保持极大的选择性。 随着科技的不断发展，电化学生物传感器也经历了一代又一代的改变，逐渐从第一代发展到第三代，其性能也逐步得到提高。 (1) 第一代酶生物传感器 第一代酶生物传感器是以氧为中继体的电催化 23。 ,第一支葡
27、萄糖生物传感器的研制成功 ,用于血清中葡萄糖的含量的定量检测，这代表着第一代生物传感器的诞生。它的缺点是当由酶促反应产生的过氧化氢以很多，且浓度很大的时候，就可能会使 酶失去活化，回应信号与氧分压或溶解氧关系较大，溶解氧的变化可能引起电极回应的波动。 (2) 第二代酶生物传感器 为了改进第一代酶生物传感器的缺点，现在很多遍采用的是第二代酶生物传感器，第二代生物传感器通过化学修饰层并且含有电子媒介体。此化学修饰层不仅能促进电子传递过程，使得回应的线性范围拓宽，电极的工作电位降低，同时，噪声、背景电流及干扰信号都变小，而且使得酶生物传感器的工作寿命延长，传感性能得到提高。电子媒介体在近几年以来得到迅速发展，使用的媒介体种类也越来越多 24。 （ 3） 第三代酶生物传感器 随着技术的发展，生物传感技术也不断提高， 第三代酶生物传感器也产生了，它是酶与电极间进行直接电子传递，这种传感器与其他电子媒介体无关，不需要中间的需媒介体传递电子，但由于酶分子的电活性中心是在深埋在分子的内部，且酶在电极表面吸附后容易发生变形，使得酶与电极间很难以进行直接电子转移，因此这种方法制
