1、LDH5 在舌鳞状细胞癌中的表达及其临床意义袁春平 1，李中武 1，张玮 2，王东苗 1，程杰 1，杨建荣 11，南京医科大学口腔医学研究所 南京 江苏 2100292，南京医科大学附属口腔医院口腔病理科 南京 江苏 210029基金项目：国家自然科学基金（81100737） ，江苏省自然科学基金（BK2011762 ） ，教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20113234120003）作者简介：袁春平 （1989-） ，男，江苏盐城人，在读七年制研究生李中武 （1988-） ，男，安徽六安人，在读硕士研究生 共同第一作者通讯作者：杨建荣，主任医师。 E-mail: 程杰，副教授。E-ma
2、il: leonardo_ 共同通讯作者Comment 微微微微1: 详细结果呈现，与正常粘膜结果相比，正常粘膜组标本不足Comment 微微微微2: LDH5表达水平还是强度？Comment 微微微微3: 相关性分析具有统计学差异？Comment 微微微微4: 有关无关不宜使用Comment 微微微微5: 具有相关性摘要 目的：探讨 LDH5蛋白在舌鳞状细胞癌组织中的表达特点，及其与临床病理和患者生存预后的关系。方法：应用免疫组织化学染色法检测 LDH5蛋白在 63例舌癌组织标本和 16例正常舌黏膜组织标本中的表达。结合患者临床病理资料和随访资料，应用 SPSS17.0软件分析 LDH5的表
3、达与相关临床病理参数（Fisher 精确概率法）以及患者总生存率之间（Kaplan-Meier 法）的关系。结果：LDH5 在部分舌鳞癌组织中呈高表达（33/63，52.38%） ，与其在正常舌黏膜组织的表达水平相比有显著统计学差异（P0.01） 。LDH5 蛋白表达水平与肿瘤大小、颈淋巴结转移、临床分期有关具有相关性（P0.05） ，而与患者的性别、年龄、病理分级、局部浸润等 无关无相关性（P0.05） 。Kaplan-Meier 法分析患者总体生存情况结果显示：LDH5 高表达组患者的总体生存率明显低于 LDH5低表达组患者（P=0.0031，Log-rank 检验） 。结论：LDH5 在
4、部分舌鳞状细胞癌组织中呈异常高表达，其表达水平与肿瘤发展的病理学特征及患者预后具有相关性有关。关键词 舌鳞状细胞癌；LDH5 基因；有氧糖酵解；免疫组织化学染色Comment 微微微微6: 进一步修改英文摘要，特别是英文表述习惯The expression and clinical significance of LDH5 in tongue squamous cell carcinomaYuan Chunping1, Li Zhongwu1, Zhang Wei2, Wang Dongmiao1, Cheng Jie1*, Yang Jianrong1*1, Institute of Sto
5、matology, Nanjing Medical University, Nanjing, JaingsuJiangsu, 2100292, Department of Oral Pathology, Affiliated Hospital of Stomatology, Nanjing Medical University, Nanjing, JaingsuJiangsu, 210029*Corresponding author: Jianrong Yang E-mail: Jie cheng E-mail: leonardo_Abstract Objective: The present
6、 study iswas aimed toTo investigate the LDH5 expression in tongue squamous cell carcinoma (TSCC) and its relationship with various clinicopathological parameters. Methods: The LDH5 protein expression in 63 cases of TSCC and 16 cases normal tongue samples mucosa were examined by immunohistochemistry.
7、 Based on these patients information and their follow-up data, the correlation between the LDH5 level and patients clinicopathological characteristics, and overall survival were further evaluated by statistical analyses using Fisher exact test and Kaplan-Meier method, respectively. Results: The LDH5
8、 expression in TSCC was much higher than that in normal tongue (P0.0001). LDH5 over-expression was found to be associated with tumor size (P=0.0094), cervical lymph node metastasis (P=0.0230) and clinical stages (P=0.0024), but not with gender, age, local invasion and pathological grades (P0.05). Th
9、e overall survival rates in patients with LDH5 high expression were significantly lower than those in patients with its low expression as estimated by Kaplan-Meier method and Log-rank test (P=0.0031). Conclusion: LDH5 is aberrantly over-expressed in a significant fraction of TSCC. and itIts upregula
10、tion associates with multiple clinicopathological features tumor progression and patients Comment 微微微微7: 舌癌是最常见的口腔粘膜鳞状细胞癌，具有等特点。Comment 微微微微8: 其他部位口腔癌也具有这个特点，注意描述的科学性和严谨性。易发生？Comment 微微微微9: 舌癌是最常见的口腔粘膜鳞状细胞癌，具有等特点。Comment 微微微微10: 建议删Comment 微微微微11: 下文参照引言意见，仔细修订语言的规范和严谨prognosis. Key words Tongue squ
11、amous cell carcinoma; LDH5; Aerobic glycolysis Immunohistochemistry舌鳞状细胞癌（以下简称舌癌？）是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤，具有生长迅速、浸润性强、颈淋巴结转移率高、预后差等特点，是最常见的口腔颌面部恶性肿瘤。其平均 5年生存率约为 50-60%。 ，烟酒是主要致病因素之一，局部侵袭和淋巴转移是导致患者死亡的主要因素 1。异常的肿瘤细胞代谢，主要是有氧糖酵解反应，是包括舌癌在内的恶性实体肿瘤包括舌癌在内的共同特性之一 2。乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)是在肿瘤细胞糖酵解过程中催化丙酮酸生成
12、乳酸的关键酶 3。既往有少量研究表明：LDH 同工酶 5（LDH5 ）在多种恶性肿瘤组织中呈异常高表达，而且与肿瘤的多种恶性表征及患者的预后有密切相关 4-6。然而，目前对于 LDH5在舌癌发生发展过程中的生物学作用研究较少。本研究旨在检测LDH5在临床舌癌组织中的表达，探讨其表达水平与患者的临床病理参数及预后的关系相关性。1. 材料和方法1.1 舌癌临床组织标本选择 2000年 1月至 2011年 12月就诊于南京医科大学附属口腔医院口腔颌面外科的 63例舌鳞状细胞癌石蜡组织标本，其中男性 37例，女性 26例，平均年龄 54.7岁（26-74 岁） 。纳入标准：术前未接受放、化疗的原发舌癌
13、患者，所有患者均采用原发病灶扩大切除术和颈淋巴清扫术（肩胛舌骨上颈淋巴清扫或全颈清） ，原发病灶经术后常规病理均证实为舌鳞状细胞癌。患者的临床分期、病理分级等根据 WHO TNM分期标准和病理学分级标准确定。所有患者均接受术后常规随访，资料齐全，平均随访 46.8个月（2-80 个月，从术后至最后一次随访时间点或患者死亡） 。16 例正常舌黏膜舌组织标本取自舌部非肿瘤手术，术后经常规病理检查确认为正常舌黏膜。所有标本均经常规处理，置于中性 4%甲醛液中固定 12-24h，逐级脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋。Comment 微微微微12: 为了完整性建议提供阴性表达照片虽然用了精确统计，但为了说明L
14、DH5在舌癌发生发展中的作用，建议增加对照样本1.2 免疫组织化学染色试剂：羊抗人 LDH5多克隆抗体（ab9002，Abcam 公司） ，辣根过氧化物酶 HRP标记的兔抗羊二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司） ，抗羊 SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司） ，DAB 显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司） 。 免疫组织化学染色步骤：所有石蜡组织标本切片（5m）后，常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，经 3%过氧化氢封闭 10min灭活内源性过氧化物酶后，应用 0.01M柠檬酸钠缓冲液行微波抗原修复（pH 6.0, 15min）, 经山羊血清封闭 20min后滴加一抗 LDH5（1
15、:400）4，过夜。次日分别滴加兔抗山羊二抗、SABC 室温 20min，PBS 充分洗涤后 DAB显色。苏木素复染后，脱水透明，封片镜检。用 PBS缓冲液代替一抗做空白阴性对照。LDH5阳性判定标准：免疫组化阳性信号以胞浆出现棕黄色染色为阳性细胞。每张染色切片均由口腔病理科医师进行评价。染色结果评价采用半定量积分法判断，即基于染色强度和阳性分布细胞比例计分判定 7。染色强度定义为：0-阴性；1-弱阳性；2-阳性；3-强阳性。阳性染色的细胞比例（百分比）通过镜下随机选择 10个高倍镜视野的 1000个肿瘤细胞，定义为 1：10%；2：11-50%；3：51-80% ；4： 80%。免疫染色积分
16、按“免疫组化积分=染色强度 阳性 ”比例公式计算得出，0 分为阴性，1-4 分为弱阳性，4 为强阳性。1.3 统计学分析应用SPSS 17.0 进行数据的统计学分析，并采用卡方、Fisher精确概率法检验对LDH5表达水平与患者的临床病理因素进行相关性分析，同时应用Kaplan-Meier法（Log-rank检验）分析患者的生存情况。P=0.05 。2 结果2.1 LDH5在正常舌黏膜和舌鳞癌组织中的表达 免疫组织化学染色显示 LDH5蛋白主要表达于胞浆中，胞核染色罕见。舌癌组织标本中LDH5主要在鳞癌上皮中表达，癌周围组织表达很弱（图 1B、C ） ；正常舌黏膜组织中 LDH5大多在上皮层可
17、见散在低表达或不表达（图 1A） 。根据我们免疫组化染色评价标准， 63例鳞癌中有 33例（52.38%）高表达，30 例（47.62%）呈低表达；在正常粘膜组织中 9例（56.25%）呈低表达，5 例表达呈阴性，2 例表达呈高表达 。因此，LDH5 在舌癌组织和正常舌粘膜组织的差异表达具有统计学意义（P0.0001） 。图 1 LDH5 在正常舌黏膜和舌鳞癌组织中的表达A：正常舌黏膜上皮（100）B：舌鳞癌组织标本 LDH5 低表达、弱阳性（200）C：舌鳞癌组织标本 LDH5 高表达、强阳性（200）Fig.1 LDH5 expression in normal tongue mucosa
18、 and TSCCA: Normal tongue mucosa (100)B: Low expression of Bmi-1 in TSCC (200)C: High expression of Bmi-1 in TSCC (200)2.2 LDH5 表达水平与患者临床病理参数的相关性在 63 例舌癌患者中结合临床病理资料发现：LDH5 表达与肿瘤大小、颈淋巴结转移和临床分期有关具有相关性，而与患者的性别、年龄、局部浸润性和病理分级均无相关性关（详见表 1） 。表 1 舌鳞癌组织中 LDH5 的表达水平与临床病理参数的关系Table 1 Correlation between LDH5 e
19、xpression and clinicopathological parameters in TSCCLDH5临床病理参数 病例数低表达 高表达 P 值性别 63 30 33男性 37 18 19 1.0女性 26 12 14年龄60 36 18 18 0.799760 27 12 15肿瘤大小T1-T2 47 27 20 0.0094T3-T4 16 3 13病理分级 34 20 14 0.0770 - 29 10 19颈淋巴结转移N(0) 35 22 15 0.0230N(+) 28 8 20局部浸润无 15 6 9 0.5638有 48 24 24临床分期 - 29 20 9 0.00
20、24 - 34 10 242.3 LDH5 表达与患者总体生存率的关系结合临床随访资料，应用 Kaplan-Meier 法对患者的总体生存情况进行分析。如图 2 所示，LDH5 高表达组患者的总体生存率明显低于低表达组（P=0.0031，Log-rank 检验） 。图 2 LDH5 的表达与患者总体生存率的关系 （Kaplan-Meier 分析）Fig.2 The relationship between LDH5 expression and the overall survival in patients with TSCCComment 微微微微13: 进一步结合研究结果深入讨论意义，以
21、及今后的进一步研究思路3 讨论恶性肿瘤细胞在有氧条件下进行糖酵解反应，即 Warburg effect, 是癌细胞基本生物学特性之一 2。癌细胞为满足生长增殖需要，在有氧环境中通过糖酵解以获得更多的营养和能量。在此过程中，葡萄糖进过系列生物化学反应生成丙酮酸，然后大多丙酮酸通过乳酸脱氢酶反应形成乳酸。因此，乳酸脱氢酶是癌细胞有氧糖酵解过程中的关键酶之一，也是潜在的癌基因，在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用 3,8。既往研究表明：LDH5 在多种原发性恶性肿瘤包括大肠癌、肺癌、头颈癌等组织中呈中异常高表达 5,6,9,10。本研究通过对正常舌黏膜和舌癌组织标本的免疫组织化学染色发现，与其他恶性实
22、体肿瘤类似，LDH5 蛋白在多数舌癌组织中呈高表达，阳性表达率明显高于正常舌粘膜组织；LDH5 染色主要是位于肿瘤细胞的胞浆中，而在胞核中罕见，这也与 LDH5的生物学功能相符合。这提示 LDH5可能参与了舌癌的发生发展过程 LDH5作为一种癌基因，可能是参与了舌癌发生发展过程中的重要分子。既往研究已证实：LDH5 蛋白的异常高表达与多种恶性肿瘤的多种临床病理参数具有相关性有关。Koukourakis MI等对 141例头颈鳞癌标本进行 LDH5免疫组织化学染色，结果发现 LDH5在头颈癌中高表达，与肿瘤的大小、HIF1 、局部复发和远处转移有关，并且提示LDH5可能是 逆转放疗抵抗和潜在的治
23、疗靶点 5。在 191例口腔鳞癌标本中对 LDH5进行免疫组化监测，发现其高表达与颈淋巴结转移、肿瘤临床分期和局部复发相关 10。在手术对128例大肠腺癌手术标本中的 LDH5表达进行免疫组织化学检测，结果发现 LDH5的异常高表达与 HIF1 的表达呈正相关，而且其高表达预示着患者的预后不良 4。与此类似，我们的研究结果也证实：在人舌癌组织中 LDH5蛋白的表达水平与肿瘤大小、颈淋巴转移和临床分期呈显著相关。再结合组织标本中 LDH5的表达和患者的生存预后情况，我们发现 LDH5的表达与舌癌患者的总体生存率有关，即：LDH5 高表达患者总体生存率明显低于低表达患者。因此，我们认为 LDH5在
24、舌癌组织中的表达水平可是判断患者总体生存的重要指标之一。综上所述，本研究发现 LDH5蛋白的表达水平与与肿瘤大小、颈淋巴转移和临床分期和患者的总体生存率显著相关，是舌癌潜在的分子标记物之一，综上所述，本研究发现 LDH5蛋白是舌癌发展过程中的重要癌基因，其表达与与肿瘤大小、颈淋巴转移和临床分期和患者的总体生存率显著相关，是舌癌潜在的分子标记物之一，也提示 LDH5可能是潜在的抗肿瘤生物治疗的靶点。然而，LDH5 在舌癌病变过程中的生物学机制及以 LDH5为靶向的生物治疗新手段值得进一步深入研究。参考文献：1. Bagan J, Sarrion G, Jimenez Y. Oral cancer
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