1、 生存和死亡是存在于所有生物的一对矛盾，它们维持着生物界的平衡，机体的免疫系统亦不例外， 免疫细胞的增殖和死亡是免疫系统得以保持自身平衡的重要条件。 细胞的死亡是人们很早就注意到的现象。1972 年 Kerr 首先提出了有别于一般死亡意义的一种新的概 念，称之为凋亡（apoptosis） 。对凋亡的研究近年来进展很快，引起了多学科的广泛重视，为肿瘤和自身 免疫性疾病的防治等研究方面提供了新的思路。 一、凋亡的生物学特征 （一）凋亡的概念 细胞的死亡有两种方式，第一种是细胞在受到严重的操作后发和的死亡，通常表现为细胞的突然死亡。 在死亡过程的最早期，线粒体的功能和形态即发生变人经，继之，细胞失去
2、自身平衡，细胞膜的操作导致 渗透压平衡的失调，细胞出现肿胀，最后胞膜破裂，胞浆内容物外泄，引起组织器官的炎症反应，这种方 式被称为坏死（necrosis ） 。 另一种细胞死亡的方式是 1972 年 Kerr 等在正常的生理状态下观察到的，这处死亡方式最初被描述为 一种正常生理状态下的形态学改变。8 年以后，这个实验小组将这种形式的细胞死亡命名为凋亡，以区别 于坏死。凋亡是机体的正常细胞在受到生理性和病理性刺激后启动的自发的死亡过程，是一种主动的、信 号依赖的过程，包括胞浆内 Ca2+、cAMP 升高，RNA 和蛋白质合成增加。其典型的特征是一种内源性核 酸内切酶的激活和由此导致的细胞染色体
3、DNA 的降解，DNA 在核小体外被切断，形成约 185bp 或整数倍 长度的 DNA 片段，DNA 电泳时形成特征性的梯形（ladder）电流条带。这种细胞死亡方式的另一个特点 是，降解的胞浆及胞核成份被包裹于膜性成分中而形成凋亡小体（apoptosis bodies） ，胞膜成份和结构的改 变可以被吞噬细胞表面的粘附分子及磷脂酰丝氨酸受体（phosphatidylserine receptor）快速识别，凋亡细胞 被吞噬并降解，因此不引起局部的炎症反应。 （二）凋亡与坏死、程序化细胞死亡 坏死是由于补体或裂解性病毒等致细胞裂解因素造成的细胞胞膜的直接损伤，或是由于其它因素干扰 胞膜上的能量
4、依赖泵的功能而造成细胞水分、离子浓度的失衡，导致细胞膜破裂，胞浆内容物外泄，进而 引起炎症，是一种病理状态下的细胞死亡。 在描述细胞死亡的术语中，还有一个概念是程序化细胞死亡（programmed cell death,PCD） 。PCD 最初 是发育学的一个术语，是指机体发育过程中出现的一系列与发育相关的细胞生理性死亡过程。后来，这个 概念被用来指由基因介导的细胞死亡，例如放射性照射的未成熟 T 细胞经历的死亡过程。启动 PCD 的因 素通常为正常的生理信号，其发生需要有某些基因的表达，给将发生 PCD 的细胞加入 RNA 或蛋白质合成 抑制剂，不但不会促进 PCD 的发生，反而延迟或阻止
5、PCD 的发生。医学全.在线.网.站.提供 凋亡和程序化细胞死亡并不是完全相同的，大部份的 PCD 过程伴有凋亡的形态学改变。但某些物种 组织细胞在发育过程中经历的 PCD 并没有凋亡典型的胞膜出泡、染色质局限化和 DNA 降解。本文中，我 们把凋亡和程序化细胞死亡当成是一种通用的概念。 （三）与凋亡相关的基因 所有的 PCD 过程都有新基因的表达和蛋白质的合成，在绝大多数凋亡也是如此。PCD 所需的蛋白在 正常的细胞中是非组成性表达的，即这些基因的表达是诱导性的。已报道有大量的基因可能与 PCD 的发 生有关，它们促进或抑制 PCD 的发生，如 c-fos、c-myc、TGF-、p53、bc
6、l-2、apt-4、apt-5、nuc-1、ces- 2、ced-3、egl-1 等。到目前为止，这些基因中只有小部分被确定为 PCD 所必需，如 p53 和 cel-1 等。到目 前为止，这些基因中只有小部分被确定为 PCD 所必需，如 p53 和 c-myc 的表达可以诱导某些 T 细胞和白 血病细胞发生 PCD，将 p53 基因转入白血病细胞中即可迅速引起 PCD。bcl-2 是抵抗 PCD 的基因，bcl-2 基因的缺失突变将促进 PCD 的发生。目前，这些基因影响 PCD 的机制还不十分清楚。 二、免疫细胞中的凋亡 各种免疫细胞都存在有凋亡的现象，这对保持免疫系统的平衡十分重要。诱导
7、免疫系统 PCD 的因素 有生理性和非生理性的。生理性因素如细胞因子浓度的改变、B 细胞发育过程中 Ig 基因的重排等。非生 理地因素如电离辐射、加热、药物等。体外培养的淋巴细胞对电离辐射尤为敏感，即使暴露在 2-5Rad 下 也能产生形态改变，X 身线和 Y 射线可诱导静止期的淋巴细胞出现典型的凋亡改变，这一过程有赖于大 分子的合成。加热对于胸腺细胞来说是一种 PCD 凋亡特征的 DNA 降解。其它因素如甲醇、DMSO 等在 低浓度条件下可诱导 PCD，浓度过高时则引起细胞的坏死。 （一）干细胞 干细胞在骨髓的造血环境中受到基质细胞、细胞外基质、生长因子和抑制因子的作用。这些因素共同 作用，
8、控制造血干细胞的自我更新和分化。细胞因子在造血干细胞的凋亡过程中发挥重要的作用，IL- 3、GM-CSF、IL-6 等不仅对于造血干细胞的增殖分化是必须的，而且对保持干细胞的存活也是必不可少 的。去除这引起细胞因子将是致干细胞发生凋亡。因此，有的学者提出了一类新的造血因子概念，即造血 挽救因子（survival factors） ，这类因子的存在可以阻断细胞凋亡的机制，通过其尝试的变化影响凋亡，达 到地造血干细胞调节的作用。EPO、IL-3、GM-CSF、G-CSF 等对造血干细胞凋亡均有抑制作用。目前认 为 EPO 对凋亡的抑制机理是，红系干细胞发育从 CFU-E 或更早的 BFU-E 开始
9、进入对 EPO 的依赖阶段， 在这一时期，如果失去 EPO 的维持，红系干细胞将发生凋亡，EPO 的作用只是抑制干细胞发生凋亡，但 对细胞的 DNA 合成并汉骨促进作用。CFU-E 中的红系干细胞在无 EPO 存在的条件下培养 16 小时，70% 的 DNA 被降解，在 EPOSCF 存在的条件下，DNA 的降解比率分别为 3%和 42%。 1.胸腺细胞的发凋亡 淋巴干细胞通过血流进入胸腺，在胸腺中的发育成熟过程中要发生基因的重排 和分化，同时，胸腺细胞要经历严格的选择过程，只有那些对自身 MHC 分子亲和力较高的细胞克隆才被 允许发育为 CD4+和 CD8+双阳性细胞（阳性选择） 。其中那些
10、对自身抗原和力较高的胸腺细胞必须清除 （阴性选择） 。胸腺细胞在胸腺中的阳性选择和阴性选择是通过凋亡机制来实现的，其机制与胸腺细胞和 胸腺基质细胞间的相互作用有关。大部分的胸腺细胞是未经阳性选择或阴性选择过的，因此其平均寿命很 短，只有 3-4 天，代表了胸腺中凋亡的整体水平。在胸腺细胞中，凋亡与内源性糖皮质激素有关，未成熟 胸腺细胞对糖皮质激素是敏感的，而成熟 T 细胞对糖皮质激素则是抵抗的。 2.活化 T 细胞与凋亡 静止 T 细胞受到丝裂原 CD3-TCR 抗体的诱导而发生增殖，产生细胞因子。同 样的信号在未成熟 T 细胞和 T 细胞杂交瘤则诱导细胞的凋亡，这种凋亡也称为活化诱导的细胞死
11、亡 （activation-induced cell death, AICD） 。决定这种差别的因素目前还不完全清楚，可能与 Ca2+流量和蛋白 激酶 C（PKC ）有关。蛋白激酶 C 可以阻断引起核酸内切酶海参性所需的 Ca2+流，它可能通过抗原刺激 依赖的第二因子（如 IL-1 激活的蛋白激酶 C）的存在与否来诱导凋亡或增殖。 活化诱导的细胞死亡并不仅仅限于未成熟的胸腺细胞和 T 细胞杂交瘤，在成熟的外周 T 细胞也发现 了类似的情况。表达 TCR 或 TCR 的小鼠和人 T 细胞在受到抗 CD3-TCR 抗体、PHA 或抗 Fas 单 抗的诱导时发生凋亡。 （1）活化状态的外周 T 细胞
12、更易发生凋亡：经丝裂原活化和体外扩增培养的人外周 T 细胞对凋亡更 为敏感。小鼠脾脏 T 细胞在对凋亡易感之前也需要受到抗原的激活。在活化的 T 细胞中，对凋亡的敏感 性在 CD4+和 CD8+T 细胞亚群之间无差异，在小鼠 CD4+细胞中，Th1 和 Th2 亚群之间亦无明显的区别。 （2）细胞因子在凋亡中的作用：目前关于细胞因子在体外诱导和阻止凋亡中发挥作用的报道不尽一 致。在辅助性 T 细胞亚群和细胞毒 T 细胞亚群中，不仅其激活和增殖需要依赖 IL-2，其存活也需要 IL-2 的支持。如在上述细胞的培养基中支除 IL-2 可使细胞在 6 小时内进入 PCD。在体内，这种对细胞因子的 信
13、赖性与机体在抗原清除后扩增的效应淋巴细胞亚群的消失有关。以防止过高和维持时间过长的免疫应答。 （3）抗原诱导的 T 细胞的凋亡：抗 CD3 单克隆抗体及 PHA 虽然能有效地诱导外周 T 细胞的活化， 但它们不是生理性的刺激剂。目前认为 AICD 也能以抗原特异性的方式发生于 T 细胞，如超抗原葡萄球菌 肠毒素（SF）能在体外及体内诱导活化 T 细胞的凋亡。抗原诱导的 T 细胞的凋亡也发生于同种异体抗原 的刺激，当同时异体抗原再次刺激机体时，有 20%-30%的同种异体反应细胞发生了 AICD。 （4）AICD 的调节及其意义：相同的抗原在通过 CD3-TCR 刺激静止 T 细胞活化的同时，也
14、启动了活 化 T 细胞的凋亡过程。那么，静止细胞和活化细胞发生凋亡是如何调节的呢？一种可能的机制是某一特定 的 T 细胞克隆的活化和凋亡是同时进行的，抗原的量决定增殖抑或凋亡。SE 超抗原在诱导部分活化细胞 （40%-50%）凋亡的同时，也有 MHC抗原阳性的抗原提呈细胞的作用下诱导其余 T 细胞（50%-60%） 的增殖。AICD 是外周 T 细胞克隆清除（ clonal deletion）的一种机制，有助于机体免疫耐受机制的建立， 也是对细胞免疫调节的补充。当抗原活化的 T 细胞与特异性抗原接触时诱导部分 T 细胞发生 AICD，使得 机体能在一定范围内限制免疫应答的强度。 （三）B 细胞
15、 B 细胞根据其分化的不同阶段对抗原的刺激有不同的反应。前 B 细胞在发育过程中必须经历免疫球蛋 白的基因重排。基因重排未成功的 B 细胞将发生凋亡，重排成功的前 B 细胞最先表达膜表面 IgM，如果 前 B 细胞在这个阶段接触抗原，它们将会夭折，这是机体去除自身抗原反应细胞的一种机制。因为大多 数出现在骨髓的抗原是自身抗原。mIgM、mIgD 阳性 B 细胞如无抗原刺激一般于 24 小时之内在脾脏中死 亡，脾脏 B 细胞胞核有高浓度的 Ca2+、Mg2+，可诱导内源性的核酸内切酶，与无抗原刺激 B 细胞的凋 亡有关。B 细胞 mIg 结合相应抗原的亲和力成熟在保持 B 细胞的存活中起重要作用
16、，只有对抗原刺激能 产生高亲和力抗体的 B 细胞才能逃避凋亡。 （四）髓样细胞 免疫系统其它细胞中的嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和单核细胞都与炎症发生密切相关。体外实验表明， 它们各自在炎症中的作用可通过细胞因子对凋亡的发生来加以调节。髓样细胞系 HL-60 细胞在培养时， 除小部分细胞自发分化外，大部分细胞在经历 5-7 天的培养时间后发生凋亡。单核细胞在失去某些刺激时 将发生 PCD，FMLP、C5a、MCP-1、TGF-、IL-2、IL-4 和 IL-6 都不能阻止单核细胞的凋亡，而适当浓 度的 IL-1、TNF- 、TIFN- 和 GM-CSF 等炎症因子则能阻断单核细胞 PCD 过程。活
17、化的单核细胞也 通过自分泌方式产生 IL-1、TNF- 和 GM-SCF。有趣的是，TNF- 在成熟单核细胞和单核细胞系 U937 中对 PCD 的诱导作用是完全相反的。新鲜分离的嗜酸性粒细胞在体外培养 72-96 小时后即进入 PCD，而具有促进嗜酸性粒细胞集落形成作用的 IL-5 能使嗜酶性粒细胞的 PCD 过程推迟 80 小时。 LPS、C5a 和 FMLP 在体外能以剂量依赖式推迟中性粒细胞的 PCD 过程。炎症因子对嗜酸性粒细胞和中性 粒细胞 PCD 的推迟，有助于死亡的细胞被巨噬细胞完整地摄入并加以清除。 细胞凋亡与免疫 细胞凋亡（apoptosis） ，又称程序性细胞死亡(PCD
18、)，指的是细胞将自身裂解为许多膜包小泡的一种精确调 节的细胞死亡过程，是目前生物界最热门的话题之一。细胞凋亡之所以引起学者们的广泛关注，在于它在 保证许多生物的健康生存上起到了十分关键的作用。它在生物的发育过程中塑造了神经系统，并且保证了 免疫系统行使正常功能。细胞凋亡是免疫应答和免疫调控的重要形式之一，免疫细胞的增殖与分化过程是 与免疫细胞的正常死亡相统一的，免疫应答的效应过程也是与靶细胞的死亡相伴随的。细胞凋亡的研究也 是免疫学的重要课题。 1.概念 1972 年，Kerr 首先提出细胞凋亡是不同于坏死的一个主动的自我破坏过程。1980 年，Wyllie 等在糖皮质 激素诱导胸腺 T 细胞
19、死亡的过程中，观察到一系列形态学和生物化学的变化，与常规坏死不同，认为这是 细胞内基因调控发生的有序的死亡过程，并提出了细胞程序性死亡（PCD）的概念。作为生命过程中同一 个过程的两个方面，凋亡和增生同样不可缺少，二者是辨证统一的。对免疫学来说，细胞凋亡有特殊的意 义。免疫系统识别外来异物和自身组织的形成，必须依靠对自身起反应的淋巴细胞的删除，而这种删除主 要是通过细胞凋亡来完成的。淋巴细胞对靶细胞的杀伤过程部分也是通过靶细胞凋亡来实现的。细胞凋亡 如果出现紊乱，机体可能出现严重的病理状态，如肿瘤、白血病、自身免疫性疾病（类风湿性关节炎、系 统性红斑狼疮、强直性脊柱炎等） 、免疫缺陷等。以下对
20、细胞凋亡的基本机制、信号传导、分子事件及疾 病治疗等方面的研究成果综述如下。 （1）基本机制 多细胞动物体内的细胞具有一套相似的酶系统，激活后可以启动细胞凋亡。线虫 Caenorhabditis elegans 是 研究细胞死亡机制的一种很好的生物模型。C.elegans 的三种基因产物：CED-3，CED-4 和 CED-9 对凋亡 而言是十分重要的，CED-3 和 CED-4 促使凋亡，CED-9 抑制凋亡。CED-3 是一种 caspase,即一种半胱氨酸 蛋白酶，它在天门冬氨酸存在的部位之后切断蛋白。CED-3 是一种酶原，通过自身切割而活化。CED-4 与 CED-3 结合并激活 C
21、ED-3，CED-9 与 CED-4 结合从而阻断 CED-4 激活 CED-3。通常，CED-9 与 CED- 4 和 CED-3 形成复合物是 CED-3 保持无活性状态。当引起细胞凋亡的刺激发生时， CED-9 会分解从而活 化 CED-3，继而导致细胞死亡。脊椎动物已进化出一整套基因族，类似于 C.elegans 的死亡基因。哺乳动 物的 caspase 类似于 CED-3。Apaf-1 是目前唯一已知的哺乳动物体内 CED-4 类似物。哺乳动物 Bcl-2 基因 族产物与 CED-9 有关，但包括两个蛋白亚群，一个亚群抑制凋亡，一个亚群促进凋亡。 （2）死亡受体直接介导凋亡机制 从细
22、胞生存环境发出的生存信号和内部感受器对细胞完整性的感知使细胞的凋亡机制随时处于戒备状态。 一旦细胞失去与外界的联系或内部发生难以修复的损伤则启动凋亡。细胞同时受到加快分裂周期和减慢分 裂周期的信号时，也会促发凋亡。哺乳动物已经进化出一套机制使生物体能自主性的指导其个体细胞自我 毁灭。这类有益的凋亡对免疫系统尤为重要。死亡受体细胞表面传导由特定“死亡配体”引起的凋亡信 号的受体在这类凋亡中发挥了核心作用。这些受体可以在与配体结合的数秒内激活死亡 caspase，并 在数小时内引起细胞凋亡。 3. 细胞凋亡的信号传导途径 近年的工作表明，在不同的系统中，许多信号传导调节了细胞的死亡过程，他们包括:
23、 细胞浆中的 Ca2+浓度上升、cAMP 累积、蛋白酶 C 的激活、酪氨酸蛋白激酶的活化和神经酰氨的产生。 这些充分说明，细胞凋亡是一个调节性很强的过程，象细胞的增殖和分化一样，它也是由激素和受体介导 的。 Ca2+的调节或流人（influx）激活了细胞内的核酸内切酶，在胸腺和免疫细胞中引起细胞凋亡。有实验表 明 Ca2+浓度的高低调节了细胞凋亡。胞外或胞内 Ca2+螯合剂、通道阻塞剂和钙调蛋白拮抗剂能够延迟或 阻止细胞凋亡。 刺激腺苷酸环化酶或引起 cAMP 上升的试剂使胸腺细胞和淋巴细胞凋亡。关于依赖 cAMP 的蛋白激酶和 磷酸酶的影响还不很清楚，转录因子能够介导 cAMP 的效应；cA
24、MP 通过磷酸化抑制成纤维细胞的 Ras 通 路。 生理活性因子能抑制细胞凋亡，都是通过酪氨酸蛋白激酶活性（PTKs）的受体来介导的。和其它的一些 信号分子一样，PTKs 调节凋亡过程也有两面性，B 细胞的凋亡可以是由电离辐射刺激的 PTK 活性所引起。 T 细胞表面抗原 CD4 或 CD8 所启动的 T 细胞受体介导的凋亡过程也是由同一机制所引起。 神经酰氨（ceramide ）是一种新型的第二信使。它激活胞质内的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（CAPP） ， CAPP 参与了对凋亡的调节。 信号传导十分复杂，增殖、分化和凋亡是一个紧密连接的整体，有时是同一分子机制在起作用。可以认为 细胞凋亡是由
25、不均衡的信号传导引起的。 4. 细胞凋亡与疾病治疗 细胞的稳态平衡，是细胞生与死的总体平衡。一旦失衡则造成细胞的堆积或丢失，细胞凋亡受阻或增加， 都有可能导致疾病。 (1) 与凋亡受阻相关的紊乱、的紊乱 与凋亡受阻相关的紊乱可导致包括肿瘤、自身免疫缺陷性疾病如系统性红斑狼疮，以及病毒感染性疾病如 腺病毒的感染。与细胞过量死亡相关的紊乱可导致病毒诱发的淋巴死亡如 AIDS。还可导致神经变性紊乱 因而导致一些神经性疾病如肌萎缩性侧索硬化病以及一些由血细胞紊乱导致的疾病。 (2) 细胞死亡的调节治疗前景 既然这些疾病是由于凋亡失控的结果，要治疗这些疾病就必须把它们反调过来使之成为正常的状态，即反 其
26、道而行之。 对第一类疾病（与凋亡受阻相关） ，有如下治疗措施：（1）诱发细胞凋亡的试剂：化学治疗试剂，放射线。 （2）生长因子、细胞因子、视黄酸等。 （3）Bcl-2 mRNA 的反义寡核苷酸可以抑制 Bcl-2 的表达。 （4）小 分子药物试剂参与蛋白蛋白和蛋白核酸的相互作用，从而调节 Bcl-2 基因的表达。 （5）自体免疫疾病 可用与疾病有关的自体抗原来治疗。 对第二类疾病（与细胞过量死亡相关）可有如下治疗措施：（1）增加 Bcl-2 的表达量。 （2）对局部贫血， 可用调节钙代谢的试剂。 （3）调节刺激信号，抑制细胞表面与凋亡有关的效应器。 （4）半胱氨酸蛋白酶抑 制剂的加入。 5.
27、总结 毫无疑问，细胞凋亡是当前生命科学的研究热点，其中以凋亡机制的研究最为重要。它可以使我们深入了 解凋亡的发生、发展过程，以及凋亡与维持机体正常生理功能之间的关系。细胞凋亡的研究的深入，不仅 可以进一步阐明凋亡的作用机理，而且有望对免疫缺陷性疾病以及其它一些恶性疾病的治疗提供理想的途 径，具有重要的理论和实践意义。 细胞凋亡与自身免疫性疾病 11. 细胞凋亡 11 细胞凋亡概念 对机体组织而言，细胞分化是一个连续不断的过程，以维持器官大小和功能的稳定，防止肿瘤的发生，这 种平衡是通过分化率和死亡率(即细胞凋亡 )的协调得以实现。细胞凋亡 (apoptosis)或称程序性细胞死亡 (progr
28、ammed cell death，PCD)，又被简称为凋亡，其确切含义是：机体在生长、发育及维持内环境稳定过程中，由基因控 制的自主的有序性细胞死亡行为。细胞凋亡作为一种基本的生命现象。普遍存在于各种组织及机体发育的 各个阶段，在维持正常组织的稳态平衡方面起着重要的作用。与细胞的坏死不同，细胞凋亡不是一种被动 的过程，而是一种主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。它并不是病理条件下的 自体损伤，而是更好地适应生存环境主动采取的一种死亡方式。 虽然细胞凋亡与细胞坏死的最终结果极为相似，都是结束细胞生命，但它们的过程与表现却有本质差别。 “坏死”是细胞受到强烈物理、化学或生物因素
29、作用引起细胞无序变化的死亡过程，核变化较慢，DNA 降解不充分，可引起局部严重的炎症反应； “凋亡”是细胞对环境的生理性或病理性刺激信号，环境条件的变化或缓和性损伤产生的应答，是有序 变化的死亡过程。 一般认为凋亡本身不会引起炎症和周围组织损伤，是一种“清洁”的死亡方式。因为理论上细胞凋亡时， 细胞膜始终保持完整，胞内内容物无溢出，故不会引起局部的炎症反应，这与坏死的细胞肿胀、破裂、溶 酶外溢而引起的炎症过程完全不同。但是，凋亡与炎症之间仍然具有一定的相关性：当环境不利于吞噬细 胞摄取凋亡细胞时，或者凋亡大量发生使吞噬不能及时完成时，凋亡细胞仍将发生裂解，从而导致非特异 性的炎症前介质的释放，
30、促成炎症反应。而炎症的消退有赖于局部堆积的炎性细胞经凋亡被清除，一旦这 种机制失效时就表现为炎症的持续存在。 12 细胞凋亡的形态学与生化特征 细胞凋亡具有其特异性的形态学改变。实体细胞凋亡时，其表面微绒毛消失，与周围细胞脱接触。接着， 凋亡细胞胞浆开始脱水产生空泡，并与胞膜融合，出现胞膜空泡化；此时细胞因水份丧失出现细胞固缩、 核固缩和发芽；之后细胞膜内陷，将细胞分隔成多个有外膜包裹、表面光滑的内涵物不外溢的凋亡小体 (apoptosis bodies)，其中可含有各种不同的、结构尚完整的细胞器，以及染色质的短片等；凋亡小体的大小相差很大， 其数目则与原细胞的大小直接有关。在凋亡的整个过程中
31、，没有细胞的内容物的外漏，因此也不伴有局部 的炎症反应。 细胞在凋亡过程中发生着复杂的生化变化，目前尚没有完全搞清楚凋亡的整个生化机制。已有的研究 结果表明，细胞凋亡的主要生化特征包括如下： DNA 的片段化：由于胞内 Ca2+依赖性的内源性核酸内切酶激活，基因组的 DNA 在核小体连接区发生 非随机性降解，产生大小不等的寡核小体片段，其大小相当于核小体(180200bp) 的倍数，在琼脂糖凝胶 电泳中可见特征性的“梯”状 DNA 条带而细胞坏死时 DNA 随意断裂为长度不一的片段，琼脂糖凝胶 电泳呈弥散状。出现特征性的 DNA 阶梯(DNAladder)是细胞凋亡在生物化学方面的典型变化。钙
32、超载： 在 80 年代人们发现用糖皮质激素诱导胸腺细胞凋亡时发现凋亡的细胞内游离 Ca2+浓度显著上升用 Ca2+载体 A23187，人为提高 B 淋巴细胞内 Ca2+的水平，可诱导 B 淋巴细胞的凋亡。而用钙络合剂降低 细胞内水平，能阻止凋亡发生。后发现凋亡细胞存在钙超载现象Ca2+在细胞凋亡中充当凋亡信号传递 的角色。内源性核酸内切酶激活：在凋亡时，细胞核内的核酸内切酶常常被激活，从无活性状态变成有 活性，多数核酸内切酶是一种二价金属离子依赖性酶，Ca2+Mg2+增加酶的活性，而 Zn2+能抑制它的活 性。当然在某些细胞内也存在非二价金属离子依赖性核酸内切酶。Zn2+也不能抑制其活性。 1
33、3 细胞凋亡的信号转导途径 细胞凋亡是多细胞有机体为调控机体发育，维持内环境稳定，受遗传控制的细胞主动死亡程序。细胞凋亡 程序是在一定的诱导条刊：下发生的，例如正常或病理性刺激，多种疾病包括自身免疫性疾病，肿瘤，免 疫缺陷和神经退化性疾病。细胞凋亡最终将激活细胞内以无活性原酶形式存在的半胱氨酸天冬氨酸特异性 蛋白酶家族，即 caspase 家族。该家族成员均具有一保守的五肽活性位点，在多种凋亡信号刺激下经蛋白 水解作用切断该位点后形成活性酶。活化的 caspase 激活其下游 caspase 家族成员及其他蛋白酶引起级联反 应并最终导致细胞溶解。不同种类的细胞在接受不同的细胞外刺激后引起凋亡的
34、形态学改变是高度保守的， 但是它们并不是遵循同一种固定的或有规律的模式进行，而是通过各自的信号转导途径来传递胞膜上的死 亡。哺乳动物细胞凋亡由两条信号转导途径调控，在某些种类的细胞中这两条信号转导通路可能相互关联。 131 死亡受体途径 又称为外源性凋亡途径，是通过激活细胞膜上死亡受体而触发细胞凋亡机制。死亡受体属于 TNFR 基因超 家族成员，可传导由特定的死亡配体引起的凋亡信号。目前发现的死亡受体包括：CD95(Fas 从 PO-1)、 TNFRl(p55 或 CDl20a)、DR3(Death Receptor 3)、DR4 和 DR5 等， 因此有分别由 CD95，TN“FRI，DR3
35、 ，DR4 和 DR5 介导的信号传导途径。其中最典型且研究最多的死亡 受体为 CD95(FasAPO-1)。CD95(Fas APO-1) 广泛分布于各种有核细胞，FasL 属 I 型跨膜糖蛋白，位于 活化的 T 淋巴细胞表面，由胞外区(157 个 aa)、跨膜区(17 个 aa)、胞内区(145 个 aa)三部分组成。Fas 胞内 区 C 端一段 60-70 氨基酸序列与 TNFR 胞内区同源，并介导细胞死亡，称之为死亡域(Death domain， DD)，对于 Fas 传递凋亡信号进入细胞内非常重要。FasL 是 Fas 的配体，以膜结合蛋白 P40 和可 溶性蛋白 P27 形式存在。
36、含死亡结构域的 Fas 相关蛋白(FADD)是存在于胞浆中的一种蛋白质，靶细胞表 面 Fas 与 FasL 结合后，诱导 Fas 分子的三聚体化，继而 Fas 分子胞浆段内的 DD 与 FADD 梭基端的 DD 结合，促使 FADD N 端的死亡效应区(death effector domain， DED 与 procaspase-8(或 10)中的 DED 结合，形成由 FasFADDpro-caspase-8(或 pro- caspase10)组成的死亡诱导信号复合物。pro-caspase-8(或 pro-caspase-10)自身催化形成活化的异四聚体形 式，从而激活下游的 caspa
37、ses，在通过一系 caspase 的级联激活反应发挥凋亡效应，最终导致细胞死亡(见 图 1)。 132 线粒体依赖性途径 又称为外源性凋亡途径，在该途径线粒体外膜通透性改变促使细胞色素 C 释放是导致细胞凋亡的关键。 以往的研究认为，细胞色素 C 等凋亡前体物质是通过线粒体膜上的膜通透性孔道(permeability transition pore，PT 孔) 释放到胞浆中的。 PT 孔是位于线粒体内外膜之间的由不同蛋白组成的复合体，该复合体由胞质中的己糖激酶、线粒体外膜 上的电压依赖性阴离子通道(VDAC)、线粒体膜间隙的肌酸激酶、线粒体内膜上的腺昔酸转运蛋白(ANT) 以及基质中的亲环蛋
38、白 D(cyclophilinn D)组成。PT 孔是线粒体内外信息交流的枢纽，外界凋亡刺激因素可导致 PT 孔的开放，从而直接导致线粒 体电化学梯度耗散、细胞色素 C 等凋亡相关分子的释放。 PT 孔开放导致线粒体内室的扩张，从而引起线 粒体外膜破裂，进而导致膜间隙凋亡诱导因子的释放线粒体的凋亡因素主要有细胞色素 C 和凋亡诱导 因子(AIF) ，细胞色素 C 进入胞浆后首先与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)的 C 末端结合，Apaf-1 的 N 末端 含有募集区，在 ATP 或者 dATP 存在下，细胞色素 C-Apaf-1 复合物募集并激活 caspase-9，被激活的 caspase
39、-9 切割效应 caspases，如 caspase-3 和 caspase7，而启动凋亡通路。 (见图 2) 线粒体外膜通透性受到 Bcl-2 蛋白家族的调控。Bcl2 是 B 细胞淋巴瘤白血病2(B-cell lymph-omaleukemian-2)的缩写，Bcl2 基因家族是研究最早的与凋亡有关的基因，也是目前最受重视的 调控细胞凋亡的基因家族。Bcl2 属于一类新的癌基因家族，其结构主要由两大结构域构成，即位于羧基 端的跨膜结构域和数量不等的(1-4 个)Bcl2 同源结构域(Bcl2homology，BH)。其家族成员根据其所具 有的 BH 结构域以及在细胞凋亡中发挥的生物学效应的
40、不同大致将其分为三大类( 具体成员及对细胞的作 用见表 1)：包括抑凋亡基因(Bcl 2 和 Bclx)，促凋亡基因(Bax 和 Bak)和只具有 BH3 结构域的基因(Bid 和 Bik)。 Bcl-2 为 Bcl-2 家族的抗捆亡基因，其基因产物分子量为 26KD。Bcl2 蛋白可表达于正常细胞的激活和发 育过程中，在成熟组织中亦有表达，在走向凋亡的细胞中低表达或不表达。电镜下可见 bcl2 蛋白位于 核膜、粗面内质网和线粒体膜上。1988 年 Vaux 等首次正实 Bcl2 基因高表达可以引发肿瘤，并且发现 它可明显延长细胞的生长期，而对细胞的增值率没有明显影响。后来又有人发现 Bcl2
41、 基因及其蛋白可 抑制多种组织的细胞凋亡，从而使人们认识到 Bcl2 基因是一种新的癌基因，它不影响细胞的增殖，而 是作为细胞凋亡的一个潜在抑制 子调节细胞死亡。人们通过 Bcl-2 脂质体转染细胞，Bcl-2 反义寡核昔酸处理细胞等方法证实 Bcl2 基因 过高表达能明显延长细胞寿命，减少细胞凋亡，并对诱导凋亡因素如放射线、化疗药物、自由基等有明显 抵抗作用。Bcl-2 转染小鼠出现 B 细胞囊性增生并最终导致 B 淋巴细胞瘤。对 Bcl2 基因抑制凋亡的机 制还不十分明确，多认为是多因素共同作用的结果。有的学者认为 Bcl2 基因可能是通过阻止细胞凋亡 的早期环节发挥作用的，可阻止或降低细
42、胞皱缩，染色质浓缩和 DNA 裂解的发生；还有人认为 Bcl-2 基 因并不能降低药物诱导的 DNA 损伤，但可加速 DNA 修复，因此，Bcl 2 基因可能通过阻止受损细胞 DNA 转录出对促细胞凋亡相关基因有激活作用的信号或者阻止这些相关基因产物的作用而抑制细胞凋亡。 Bax 为 bcl2 家族的促凋亡基因，其基因产物分子量为 21KD，由 192 个氨基酸组成，其中 21的氨基酸 与 bcl2 同源。 Bax 蛋白由 9 条 螺旋组成，包含 bcl2 家族结构特征的 BHl，BH2 和 BH3 及 C 末端 的跨膜结构域，其 BH3 结构域位于 2 螺旋，对其与其他凋亡相关蛋白形成异二聚
43、体以及线粒体膜定位都起着关键作用。在生理状态下，其 C 末端的 9 螺旋占据了 BH3 结构域所在的疏水口袋的结合位点，从而使其无法与其他 bcl2 家族蛋白结合，也无 法锚着在线粒体外膜上。当细胞接受到凋亡信号后，Bax C 末端 9 螺旋与 BH3 结构域所在的疏水口袋的解离对于 Bax 的膜定位或同源(异源)二聚体的形成是必不 可少的，BaxC 末端 9 螺旋与 BH3 结构域的结合很可能是 Bax 自身抑制的重要机制，用以防止在生理状 态下 BaxBH3 结构域的暴露和线粒体膜转位所引起的细胞损伤。Bax 与 Bcl-2 及 BclxL 的抗凋亡区结合 拮抗其保护性效应而促进细胞凋亡B
44、ax 与 Bcl2 的蛋白水平与凋亡调控直接相关，其比率影响细胞凋 亡的倾向：Bax 增高，促进细胞凋亡；Bcl2 增高，抑制细胞凋亡。Bcl-2 的磷酸化可阻止它与 Bax 形成 二聚体，使细胞趋于凋亡。 研究发现，Bcl2 家族蛋白对于线粒体盯孔的开放和关闭起着关键的调节作用，促凋亡蛋白 Bax 等可以 通过与 ANT 或 VDAC 的结合介导 PT 孔的开放，而抗凋亡类蛋白如 Bcl-2、Bcl-xl 等则可通过与 Bax 竞争 性地与 ANT 结合，或者直接阻止 Bax 与 ANT、VDAC 的结合来发挥其抗凋亡效应。 2淋巴细胞凋亡 随着研究手段的完善和对细胞动物的生理作用的认识，现
45、已证实淋巴细胞凋亡在免疫系统的发育以及免疫 反应过程中起着决定性的作用。研究发现，在免疫系统中，凋亡与淋巴细胞的发生、选择、功能发挥和及 时终止密切相关，调节着体内免疫细胞群的合适比例并参与了淋巴器官中免疫细胞的成熟和淋巴细胞抗原 受体谱的发育，赋予机体具有分辨自身和非自身的能力，同时还决定着免疫耐受和免疫记忆的产生。 21 淋巴细胞凋亡的调控 Fas FasL 系统：lpr 和 gld 鼠分别发生了 Fas 基因和 FasL 基因的突变，致使不能消除 T 细胞而积聚在淋 巴结和脾，产生淋巴结病和脾肿大，甚至发生自身免疫性疾病。敲除 Fas 基因的小鼠也有上述表现，且程 度较 1pr 突变小鼠
46、为重，通过转基因处理使 1pr 小鼠淋巴细胞表达 Fas 后，其淋巴增生现象得以缓解，充 分证明 Fas 在 T 淋巴细胞的程序性死亡中起有的作用。Fas 缺陷的鼠除 T 细胞异常，还发生 B 细胞的积聚 和各种免疫球蛋白水平的提高，包括抗 ssDNA 抗体及抗 dsDNA 抗体。抗原快速免疫鼠后可以诱导生发中 心中 Fas 的表达，而且通过 C040 激活的幼稚 B 细胞对 Fas 介导的凋亡敏感，而用 CD40 和 18 受体共刺激 后产生抵抗，说明表达 Fas 的激活 B 细胞可能通过表达 FasL 的 T 细胞得以清除。 Bcl2 家族：Bcl 家族所参与的细胞凋亡在抑制淋巴细胞的寿命
47、和维持体内平衡方面有非常重要的作用。 敲除基因 Bcl-2 或 Bcl-XL 后，淋巴细胞的存活受到严重影响，Bcl2 的缺失使得成熟淋巴细胞不能存活， 而 Bcl-XL 的缺失导致不成熟淋巴细胞的死亡。结果显示 Bcl2 及 BclXL 对于淋巴细胞的发育成熟阶 段非常重要。有研究证实 Bcl2 家族蛋白在 B 淋巴细胞凋亡的信号传递通路中起着重要作用，同时发现 在 B 淋巴细胞发育过程中，Bcl-2 的转录调控具有时相特异性，在前 B 细胞中，Bcl2 的表达较低，因此 导致大量不成熟 B 细胞死亡，而在成熟 B 细胞中，Bcl-2 的表达量则较高。体外及体内实验均证实 Bax、 Bak
48、广泛表达，可促使淋巴细胞凋亡单独敲除 Bax 或 Bak 的小鼠其免疫表型的变化不是很显著， 缺失 Bax 小鼠只有轻度的淋巴细胞增生，而缺失 Bak 小鼠则变化不大，而 Bak 及 Bax 同时缺失的小鼠则 出现了很大的变化，Bax-Bak-小鼠脾及淋巴结可增大 30 倍，大量堆积 T、B 淋巴细胞，且主要为记 忆细胞。 p53 基因：p53 是一种重要的抑癌基因，是 Bcl2 和 Bax 的上游调节基因，与 Bax 启动子的 p53 结合位点 结合后上调 bax，下调 bcl2 的表达促进细胞凋亡。研究发现 p53 基因剔除的鼠骨髓中早前期 B 细胞数量 较正常鼠增多，且此细胞群体的凋亡频
49、率较正常对照组明显降低，而 p53 鼠的前期 B 及未成熟 B 细胞的 凋亡动力学与正常鼠相比无明显变化。这些结果说明，p53 基因对于淋巴细胞的凋亡也有一定的调节作用。 细胞因子：细胞因子是一类调节细胞凋亡的重要生物活性分子。发现一些细胞因子如 TGF，TNF 有 促进凋亡作用，另一些细胞因子具有抑制凋亡作用如 GMCSF、IL-2，研究发现细胞因子是免疫细胞通 过自分泌或旁分泌作用于细胞表面细胞因子受体发挥对细胞凋亡的调节作用。这种作用涉及到免疫反应的 许多方面，对免疫细胞的发育，活化等方面均具有重要作用。 3凋亡与自身免疫性疾病 细胞凋亡与机体免疫之间有着极为密切的关系。值得指出的是，凋亡本身也可以介导自身免疫，在某些情 况下，存在于凋亡细胞内的自身抗原可被自身反应性系统识别而激发自身免疫反应，从而导致自身免疫性 疾病的发生发展。有关调亡与免疫失控及导致自身免疫性疾病的发生有以下几种解释：淋巴细胞凋亡减 少，导致自身反应性 T、B 细胞和巨噬细胞不适当的生存。在器官特异性自身免疫性疾病的发病过程中， 各种效应细胞，包括 CD8+T 细胞， CD4+Thl 细胞
