1、蛋白质 1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在 280nm 波长处有特征性吸收峰。蛋白质的 OD280 与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 2.双缩脲反应 biuret reaction： 蛋 白 质 在 碱 性 溶 液 中 与 硫 酸 铜 作 用 形 成 紫 色 络 合 物 的 呈 色 反 应 。 在 540nm 波 长 处 有 最 大 吸 收 。 可 用 于 蛋 白 质 的 定 性 和 定 量 检 测 。 紫 色 络 合 物 分 子 结 构 式 在 碱 性 溶 液 （ NaOH） 中 ， 双 缩 脲 （ H2NOC NH CONH2） 能 与 铜 离 子 （ C
2、u2+） 作 用 ， 形 成 紫 色 络 合 物 （ 该 物 质 的 分 子 结 构 式 见 图 ） ， 该 反 应 即 双 缩 脲 反 应 。 双 缩 脲 反 应 是 肽 和 蛋 白 质 所 特 有 的 ， 而 为 氨 基 酸 所 没 有 的 一 种 颜 色 反 应 。 一 般 分 子 中 含 有 两 个 氨 基 甲 酪 基 （ 即 肽 键 ： -CO-NH-） 的 化 合 物 与 碱 性 铜 溶 液 作 用 ， 就 会 形 成 紫 色 或 蓝 紫 色 络 合 物 。 注 ： 除 -CO-NH-有 此 反 应 外 ， （ -CONH2-） 、 （ -CH2-） 、 （ -NH2-） 、 （
3、-CS-CS-NH2） 等 基 团 亦 有 此 反 应 。 双 缩 脲 反 应 的 鉴 定 由 于 蛋 白 质 分 子 中 含 有 很 多 与 双 缩 脲 结 构 相 似 的 肽 键 ， 因 此 也 能 与 铜 离 子 在 碱 性 溶 液 中 发 生 双 缩 脲 反 应 ， 且 颜 色 深 浅 与 蛋 白 质 的 含 量 的 关 系 在 一 定 范 围 内 符 合 比 尔 定 律 ， 而 与 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 及 分 子 量 无 关 ， 故 可 用 双 缩 脲 法 测 定 蛋 白 质 的 含 量 （ 借 助 分 光 光 度 计 可 减 小 误 差 ） 。 双 缩 脲 反 应
4、主 要 涉 及 肽 键 ， 因 此 受 蛋 白 质 特 异 性 影 响 较 小 。 使 用 试 剂 价 廉 易 得 ， 操 作 简 便 ， 可 测 定 的 范 围 为 1 10mg 蛋 白 质 ， 适 于 精 度 要 求 不 太 高 的 蛋 白 质 含 量 的 测 定 ， 能 测 出 的 蛋 白 质 含 量 须 在 约 0.5mg 以 上 。 双 缩 脲 法 的 缺 点 是 精 确 度 低 、 所 需 样 品 量 大 。 干 扰 此 测 定 的 物 质 包 括 在 性 质 上 是 氨 基 酸 或 肽 的 缓 冲 液 ， 如 Tris 缓 冲 液 ， 因 为 它 们 产 生 阳 性 呈 色 反
5、应 ， 铜 离 子 也 容 易 被 还 原 ， 有 时 出 现 红 色 沉 淀 。 配 制 双 缩 脲 试 剂 的 注 意 事 项 双 缩 脲 试 剂 由 NaOH 溶 液 （ 0.1g/mL） 和 CuSO4 溶 液 （ 0.01g/mL） 配 制 而 成 ， 配 制 比 例 为 5:1。 但 是 双 缩 脲 试 剂 不 用 现 配 现 用 ， 这 是 与 斐 林 试 剂 不 同 的 地 方 之 一 ！ 蛋 白 质 检 测 方 法 比 较 氨 基 酸 茚 三 酮 鉴 别 试 验 的 反 应 方 程 式 ： 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定 氮法 灵敏度低，使 用于 0.2-
6、1.0mg 氮，误 差为2% 费时，8-10 小 时，但如果采用 凯氏定氮仪，缩 短时间至 4 个 小时 将蛋白氮转化为氨气，然后用酸吸收 滴定 非蛋白氮（可用三氯 乙酸沉淀蛋白质而分 离） 用于标准蛋白质含量的准确 测定，干扰少，费时，如果 采用凯氏定氮仪，就会大大 缩短定氮时间 双缩脲 法 灵敏度低，1- 20mg 中速 20-30 分 钟 多肽键+碱性 Cu2+紫色络合物 硫酸铵：Tris 缓冲液， 某些氨基酸 用于快速测定，但不灵敏， 不同蛋白质显色相似 紫外吸 收光法 较为灵敏，50- 100 微克 快速 5-10 分钟 蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在 280nm 处有紫外光吸收 各
7、种嘌呤和各种核苷 酸 用于层析柱流出液的检测， 核酸的吸收可以校正 考马斯 亮蓝法 灵敏度最高， 1-5 微克 快速 5-15 分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，在 稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸（ 特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基 结合后变为蓝色其 max由 465nm 变为 595nm 强碱性缓冲液， TritonX-100SDS 最好的方法，干扰物质少， 颜色稳定，灵敏度高颜色深 浅随不同蛋白质变化 Folin 酚 试剂法 灵敏度高，5 微克 慢速 40-60 分 钟 双缩尿反应，磷钼酸-磷钨酸试剂被 Tyr 和 Phe 还原 硫酸铵，Tris 缓冲液， 甘氨酸，各种硫醇 耗费时间长；
8、操作要严格计 时；颜色深浅随不同蛋白质 变化 CCOO CCOOHH2O2 CO2NH2RCHO+ COHH2NCOHRCOO +2NH3 COC-NH4+ H2O+COCOO 氨基酸与茚三酮水合物共热，可生成蓝紫色化合物，其最大吸收峰在 570nm 处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系，因此可作为氨基酸定量分析方 法。脯氨酸为黄色化合物，谷丙酰胺和天冬酰胺为棕色化合物。 糖分的鉴别实验 1. Fehling 试验 生药的水浸液加 Fehling 试剂，于沸水浴加热数分钟，若有还原性糖类成分存在，则产生砖红色氧化亚铜沉淀。若有非还原性低聚糖及多糖存 在，则必须加稀酸水解后，才能与 Fe
9、hling 试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖，其中单糖和某些二塘具有有力羰基，是还原糖，多糖和蔗糖没有还原性。 斐林试剂是新配制的溶液，它在加热条件下与醛基反应，被还原成砖红色的沉淀，可用于鉴定可溶性还原糖的存在。 CuSO4 + 2NaOH=Cu（OH）2 + Na2SO4 2CH3(CH2OH)4CHO + 2 Cu(OH)2 -（加热）- 2 CH3(CH2OH)4COOH+ Cu2O(砖红色沉淀) + 2 H2O 2. Molish 试验 生药水浸液，加 a -萘酚试剂数滴，摇匀后沿管壁滴加浓硫酸，若有糖类成分与甙类存在，则在二液面交界处出现紫红色环。 OH2H 2SO4羟 甲
10、 基 糠 醛HO2COCHO HO2CCSO3HHO3SOHO OOHH2SO4糖 紫红色复合物 3. 成脎试验 生药的水浸液与盐酸苯肼液共热，只要有糖类成分存在，即生成黄色的糖脎结晶。镜检结晶，可视结晶的形状而鉴定出糖的种类。 4. 层析法 取生药浸出液（多糖类需水解），以某种糖为对照品一起进行层析检测。常用纸层析法，正丁醇-乙酸-水（4 : 1 : 5 上层）作展开剂，新配制的氨化硝 酸银溶液为显色剂，结果还原糖形成黑色斑点。 糖检测方法比较 方法 原理 试剂 操作 说明 Molish 反 应 -萘酚 反应 糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及 其衍生物与 -萘酚作用形成紫红色复合物，
11、在 糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫 环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反 应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及 丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。 因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而 阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进 一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存 在 Molish 试剂：取 5g - 萘 酚用 95%乙醇溶解至 100 mL，临用前配制，棕色瓶 保存。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖 溶液；1%淀粉溶液。 取试管，编号，分别加入各待测 糖溶液 1 mL，然后加两滴 Molish 试剂，摇匀。倾斜试管， 沿管壁小心加入约 1mL 浓硫酸， 切勿摇动，小
12、心竖直后仔细观察 两层液面交界处的颜色变化。用 水代替糖溶液，重复一遍，观察 结果。 单糖、双糖、多糖一般都发生此反应， 但氨基糖不发生此反应。丙酮、甲酸、 乳酸、草酸、葡萄糖醛酸、各种醛糖 衍生物、甘油醛等均产生近似的颜色 反应。因此，阴性反应证明没有糖类 物质的存在；而阳性反应，则说明有 糖存在的可能性，需要进一步通过其 他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 蒽 酮 反 应 糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮 （10-酮-9 ，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。 蒽酮试剂：取 0.2g 蒽酮 溶于 100mL 浓硫酸中， 取试管，编号，均加入 1ml 蒽酮 溶液，再向各管滴加 2 3
13、 滴待 该方法可以用于测定几乎所有碳水化 合物的含量，包括戊糖、己糖，多糖 在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀， 其反应如下： 该复合物在 630nm 有最大的吸收峰，并且在一 定范围内，颜色与糖量的多少成正比 当日配制。 待测糖溶液，同 Molish 试 验。 测糖溶液，充分混匀，观察各管 颜色变化并记录。 等。 酮糖的 Seliwanof f 反应 酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。 后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应 仅需 20-30 秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸， 才产生微弱的阳性反应。 Sedi
14、wanoff 试剂：0.5g 间 苯二酚溶于 1 升盐酸 （H2OHCl=21） (V/V)中，临用前配制。 1%葡萄糖；1%蔗糖；1% 果糖。 取试管，编号，各加入 Sediwanoff 试剂 1mL，再依次分 别加入待测糖溶液各 4 滴，混匀， 同时放入沸水浴中，比较各管颜 色的变化过程。 酮基本身没有还原性，只有在变成烯 醇式后，才显示还原作用。 Fehling 试验 费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化 钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑 色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产 生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。由于沉淀的 速度不同，而形成的颗粒大小也不同，颗粒大 的为红色，颗
15、粒小的为黄色。 试剂甲：称取 34.5g 硫酸 铜溶于 500mL 蒸馏水中。 试剂乙：称取 125g NaOH 137g 酒石酸钾钠溶于 500mL 蒸馏水中，贮存于 具橡皮塞玻璃瓶中。临用 前，将试剂甲和试剂乙等 量混合。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖 溶液；1%淀粉溶液。 取试管，编号，各加入 Fehlin 试 剂甲和乙 1mL。摇匀后，分别加 入 4 滴待测糖溶液，置沸水浴中 加热 2 3min，取出冷却，观察 沉淀和颜色变化。 为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜 或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin 试剂中加 入酒石酸钾钠，它与 Cu2形成的酒 石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离 子，该反应是可逆
16、的。平衡后溶液内 保持一定浓度的氢氧化铜。 Benedict 试验（本 尼迪特试 验） Benedict 试剂是 Fehling 试剂的改良。Benedict 试剂利用柠檬酸作为 Cu2+的络合剂，其碱性较 Fehling 试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。 取试管，编号，分别加入 2mL Benedict 试剂和 4 滴待测糖溶液， 沸水浴中加热 5 分钟，取出后冷 却，观察各管中的颜色变化。 Barfoed 试验（巴 弗德氏试 剂 ） 在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有 明显差异。Barfoed 试剂为弱酸性。单糖在 Barfoed 试剂的作用下能将 Cu2+还原成砖红色 的氧化亚铜，时间约为 3 分钟，而还原二糖则 需 20 分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖 和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖 经水解后也能呈现阳性反应。 取试管，编号，分别加入 2mL Barfoed 试剂和 2 3 滴待测糖 溶液，煮沸 2-3 分钟，放置 20 分钟以上，比较各管的颜色变化。 还原二糖：麦芽糖、乳糖、纤维二糖
