1、蛋白质 1.由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸,因此在 280nm 波长处有特征性吸收峰。蛋白质的 OD280 与其浓度呈正比关系,因此可作蛋白质定量测定。 2.双缩脲反应 biuret reaction: 蛋 白 质 在 碱 性 溶 液 中 与 硫 酸 铜 作 用 形 成 紫 色 络 合 物 的 呈 色 反 应 。 在 540nm 波 长 处 有 最 大 吸 收 。 可 用 于 蛋 白 质 的 定 性 和 定 量 检 测 。 紫 色 络 合 物 分 子 结 构 式 在 碱 性 溶 液 ( NaOH) 中 , 双 缩 脲 ( H2NOC NH CONH2) 能 与 铜 离 子 ( C
2、u2+) 作 用 , 形 成 紫 色 络 合 物 ( 该 物 质 的 分 子 结 构 式 见 图 ) , 该 反 应 即 双 缩 脲 反 应 。 双 缩 脲 反 应 是 肽 和 蛋 白 质 所 特 有 的 , 而 为 氨 基 酸 所 没 有 的 一 种 颜 色 反 应 。 一 般 分 子 中 含 有 两 个 氨 基 甲 酪 基 ( 即 肽 键 : -CO-NH-) 的 化 合 物 与 碱 性 铜 溶 液 作 用 , 就 会 形 成 紫 色 或 蓝 紫 色 络 合 物 。 注 : 除 -CO-NH-有 此 反 应 外 , ( -CONH2-) 、 ( -CH2-) 、 ( -NH2-) 、 (
3、-CS-CS-NH2) 等 基 团 亦 有 此 反 应 。 双 缩 脲 反 应 的 鉴 定 由 于 蛋 白 质 分 子 中 含 有 很 多 与 双 缩 脲 结 构 相 似 的 肽 键 , 因 此 也 能 与 铜 离 子 在 碱 性 溶 液 中 发 生 双 缩 脲 反 应 , 且 颜 色 深 浅 与 蛋 白 质 的 含 量 的 关 系 在 一 定 范 围 内 符 合 比 尔 定 律 , 而 与 蛋 白 质 的 氨 基 酸 组 成 及 分 子 量 无 关 , 故 可 用 双 缩 脲 法 测 定 蛋 白 质 的 含 量 ( 借 助 分 光 光 度 计 可 减 小 误 差 ) 。 双 缩 脲 反 应
4、主 要 涉 及 肽 键 , 因 此 受 蛋 白 质 特 异 性 影 响 较 小 。 使 用 试 剂 价 廉 易 得 , 操 作 简 便 , 可 测 定 的 范 围 为 1 10mg 蛋 白 质 , 适 于 精 度 要 求 不 太 高 的 蛋 白 质 含 量 的 测 定 , 能 测 出 的 蛋 白 质 含 量 须 在 约 0.5mg 以 上 。 双 缩 脲 法 的 缺 点 是 精 确 度 低 、 所 需 样 品 量 大 。 干 扰 此 测 定 的 物 质 包 括 在 性 质 上 是 氨 基 酸 或 肽 的 缓 冲 液 , 如 Tris 缓 冲 液 , 因 为 它 们 产 生 阳 性 呈 色 反
5、应 , 铜 离 子 也 容 易 被 还 原 , 有 时 出 现 红 色 沉 淀 。 配 制 双 缩 脲 试 剂 的 注 意 事 项 双 缩 脲 试 剂 由 NaOH 溶 液 ( 0.1g/mL) 和 CuSO4 溶 液 ( 0.01g/mL) 配 制 而 成 , 配 制 比 例 为 5:1。 但 是 双 缩 脲 试 剂 不 用 现 配 现 用 , 这 是 与 斐 林 试 剂 不 同 的 地 方 之 一 ! 蛋 白 质 检 测 方 法 比 较 氨 基 酸 茚 三 酮 鉴 别 试 验 的 反 应 方 程 式 : 方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定 氮法 灵敏度低,使 用于 0.2-
6、1.0mg 氮,误 差为2% 费时,8-10 小 时,但如果采用 凯氏定氮仪,缩 短时间至 4 个 小时 将蛋白氮转化为氨气,然后用酸吸收 滴定 非蛋白氮(可用三氯 乙酸沉淀蛋白质而分 离) 用于标准蛋白质含量的准确 测定,干扰少,费时,如果 采用凯氏定氮仪,就会大大 缩短定氮时间 双缩脲 法 灵敏度低,1- 20mg 中速 20-30 分 钟 多肽键+碱性 Cu2+紫色络合物 硫酸铵:Tris 缓冲液, 某些氨基酸 用于快速测定,但不灵敏, 不同蛋白质显色相似 紫外吸 收光法 较为灵敏,50- 100 微克 快速 5-10 分钟 蛋白质中的络氨酸和色氨酸残基在 280nm 处有紫外光吸收 各
7、种嘌呤和各种核苷 酸 用于层析柱流出液的检测, 核酸的吸收可以校正 考马斯 亮蓝法 灵敏度最高, 1-5 微克 快速 5-15 分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,在 稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸( 特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基 结合后变为蓝色其 max由 465nm 变为 595nm 强碱性缓冲液, TritonX-100SDS 最好的方法,干扰物质少, 颜色稳定,灵敏度高颜色深 浅随不同蛋白质变化 Folin 酚 试剂法 灵敏度高,5 微克 慢速 40-60 分 钟 双缩尿反应,磷钼酸-磷钨酸试剂被 Tyr 和 Phe 还原 硫酸铵,Tris 缓冲液, 甘氨酸,各种硫醇 耗费时间长;
8、操作要严格计 时;颜色深浅随不同蛋白质 变化 CCOO CCOOHH2O2 CO2NH2RCHO+ COHH2NCOHRCOO +2NH3 COC-NH4+ H2O+COCOO 氨基酸与茚三酮水合物共热,可生成蓝紫色化合物,其最大吸收峰在 570nm 处。由于此吸收峰值与氨基酸的含量存在正比关系,因此可作为氨基酸定量分析方 法。脯氨酸为黄色化合物,谷丙酰胺和天冬酰胺为棕色化合物。 糖分的鉴别实验 1. Fehling 试验 生药的水浸液加 Fehling 试剂,于沸水浴加热数分钟,若有还原性糖类成分存在,则产生砖红色氧化亚铜沉淀。若有非还原性低聚糖及多糖存 在,则必须加稀酸水解后,才能与 Fe
9、hling 试剂呈阳性反应。糖类包括多糖、寡糖、单糖,其中单糖和某些二塘具有有力羰基,是还原糖,多糖和蔗糖没有还原性。 斐林试剂是新配制的溶液,它在加热条件下与醛基反应,被还原成砖红色的沉淀,可用于鉴定可溶性还原糖的存在。 CuSO4 + 2NaOH=Cu(OH)2 + Na2SO4 2CH3(CH2OH)4CHO + 2 Cu(OH)2 -(加热)- 2 CH3(CH2OH)4COOH+ Cu2O(砖红色沉淀) + 2 H2O 2. Molish 试验 生药水浸液,加 a -萘酚试剂数滴,摇匀后沿管壁滴加浓硫酸,若有糖类成分与甙类存在,则在二液面交界处出现紫红色环。 OH2H 2SO4羟 甲
10、 基 糠 醛HO2COCHO HO2CCSO3HHO3SOHO OOHH2SO4糖 紫红色复合物 3. 成脎试验 生药的水浸液与盐酸苯肼液共热,只要有糖类成分存在,即生成黄色的糖脎结晶。镜检结晶,可视结晶的形状而鉴定出糖的种类。 4. 层析法 取生药浸出液(多糖类需水解),以某种糖为对照品一起进行层析检测。常用纸层析法,正丁醇-乙酸-水(4 : 1 : 5 上层)作展开剂,新配制的氨化硝 酸银溶液为显色剂,结果还原糖形成黑色斑点。 糖检测方法比较 方法 原理 试剂 操作 说明 Molish 反 应 -萘酚 反应 糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及 其衍生物与 -萘酚作用形成紫红色复合物,
11、在 糖液和浓硫酸的液面间形成紫环,因此又称紫 环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反 应。此外,各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及 丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。 因此,阴性反应证明没有糖类物质的存在;而 阳性反应,则说明有糖存在的可能性,需要进 一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存 在 Molish 试剂:取 5g - 萘 酚用 95%乙醇溶解至 100 mL,临用前配制,棕色瓶 保存。 1%葡萄糖溶液;1%蔗糖 溶液;1%淀粉溶液。 取试管,编号,分别加入各待测 糖溶液 1 mL,然后加两滴 Molish 试剂,摇匀。倾斜试管, 沿管壁小心加入约 1mL 浓硫酸, 切勿摇动,小
12、心竖直后仔细观察 两层液面交界处的颜色变化。用 水代替糖溶液,重复一遍,观察 结果。 单糖、双糖、多糖一般都发生此反应, 但氨基糖不发生此反应。丙酮、甲酸、 乳酸、草酸、葡萄糖醛酸、各种醛糖 衍生物、甘油醛等均产生近似的颜色 反应。因此,阴性反应证明没有糖类 物质的存在;而阳性反应,则说明有 糖存在的可能性,需要进一步通过其 他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 蒽 酮 反 应 糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮 (10-酮-9 ,10-二氢蒽)作用生成蓝绿色复合物。 蒽酮试剂:取 0.2g 蒽酮 溶于 100mL 浓硫酸中, 取试管,编号,均加入 1ml 蒽酮 溶液,再向各管滴加 2 3
13、 滴待 该方法可以用于测定几乎所有碳水化 合物的含量,包括戊糖、己糖,多糖 在加热条件下,用样液滴定,样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应,酒石酸钾钠铜被还原糖还原,产生红色氧化亚铜沉淀, 其反应如下: 该复合物在 630nm 有最大的吸收峰,并且在一 定范围内,颜色与糖量的多少成正比 当日配制。 待测糖溶液,同 Molish 试 验。 测糖溶液,充分混匀,观察各管 颜色变化并记录。 等。 酮糖的 Seliwanof f 反应 酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。 后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物,反应 仅需 20-30 秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸, 才产生微弱的阳性反应。 Sedi
14、wanoff 试剂:0.5g 间 苯二酚溶于 1 升盐酸 (H2OHCl=21) (V/V)中,临用前配制。 1%葡萄糖;1%蔗糖;1% 果糖。 取试管,编号,各加入 Sediwanoff 试剂 1mL,再依次分 别加入待测糖溶液各 4 滴,混匀, 同时放入沸水浴中,比较各管颜 色的变化过程。 酮基本身没有还原性,只有在变成烯 醇式后,才显示还原作用。 Fehling 试验 费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化 钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热,则生成黑 色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在,则产 生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。由于沉淀的 速度不同,而形成的颗粒大小也不同,颗粒大 的为红色,颗
15、粒小的为黄色。 试剂甲:称取 34.5g 硫酸 铜溶于 500mL 蒸馏水中。 试剂乙:称取 125g NaOH 137g 酒石酸钾钠溶于 500mL 蒸馏水中,贮存于 具橡皮塞玻璃瓶中。临用 前,将试剂甲和试剂乙等 量混合。 1%葡萄糖溶液;1%蔗糖 溶液;1%淀粉溶液。 取试管,编号,各加入 Fehlin 试 剂甲和乙 1mL。摇匀后,分别加 入 4 滴待测糖溶液,置沸水浴中 加热 2 3min,取出冷却,观察 沉淀和颜色变化。 为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜 或碱性碳酸铜沉淀,Fehlin 试剂中加 入酒石酸钾钠,它与 Cu2形成的酒 石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离 子,该反应是可逆
16、的。平衡后溶液内 保持一定浓度的氢氧化铜。 Benedict 试验(本 尼迪特试 验) Benedict 试剂是 Fehling 试剂的改良。Benedict 试剂利用柠檬酸作为 Cu2+的络合剂,其碱性较 Fehling 试剂弱,灵敏度高,干扰因素少。 取试管,编号,分别加入 2mL Benedict 试剂和 4 滴待测糖溶液, 沸水浴中加热 5 分钟,取出后冷 却,观察各管中的颜色变化。 Barfoed 试验(巴 弗德氏试 剂 ) 在酸性溶液中,单糖和还原二糖的还原速度有 明显差异。Barfoed 试剂为弱酸性。单糖在 Barfoed 试剂的作用下能将 Cu2+还原成砖红色 的氧化亚铜,时间约为 3 分钟,而还原二糖则 需 20 分钟左右。所以,该反应可用于区别单糖 和还原二糖。当加热时间过长,非还原性二糖 经水解后也能呈现阳性反应。 取试管,编号,分别加入 2mL Barfoed 试剂和 2 3 滴待测糖 溶液,煮沸 2-3 分钟,放置 20 分钟以上,比较各管的颜色变化。 还原二糖:麦芽糖、乳糖、纤维二糖