1、真菌学概论,真菌(fungus)为真核细胞型微生物,属于真菌界(Kingdom of Myceteae)。具有典型的细胞核,不含叶绿素,以腐生或寄生方式摄取营养,细胞壁含几丁质(Chitin)和(或)纤维素,有完善细胞器,能进行有性生殖和(或)无性繁殖。多数对人有益,仅少数导致人类疾病。,真菌细胞结构,真菌细胞结构较原核细胞更为复杂,有完整的细胞核结构(包括核膜、核质和核仁)和一套具有特定功能的细胞器(包括线粒体、内质网和高尔基体,真菌细胞壁含有甲壳质(chitin)和-葡聚糖,细胞膜含有固醇,营养方式为吸收,无吞噬作用,营腐生、寄生、共生和超寄生生活。,原核细胞型与真核细胞型微生物的结构比较
2、,单细胞真菌 (monocellular fungus) :圆形或卵圆形,有芽生孢子,形成酵母型菌落,如酵母菌(yeast) 、新生隐球菌二相真菌 (dimorphic fungus):又称酵母样真菌(yeast-like fungi),有芽生孢子和假菌丝,形成类酵母型菌落,如白假丝酵母菌、组织胞浆菌、马尔尼菲青霉菌多细胞真菌 (multicellular fungus) :又称丝状真菌(filamentous fungus)或霉菌(mold),由菌丝hypha和孢子spore组成,形成丝状菌落,如絮状表皮癣菌、曲霉菌,分类:形态与结构,单细胞真菌形态圆形或卵圆形,产芽生孢子,新生隐球菌,酵母
3、菌出芽繁殖,多细胞真菌形态,多细胞真菌由菌丝hypha和孢子spore组成,其形态多样,是真菌鉴定的重要依据,在环境适宜情况下由孢子长出芽管,逐渐延长呈丝状,称菌丝,分为:,菌丝形态有助于鉴别,菌丝 hypha,为真菌的繁殖结构,在环境适宜情况下分裂,可分化为菌丝等结构,根据产生方式分为:有性孢子: 同一菌体或不同菌体上的2个细胞融合经 减数分裂形成无性孢子:菌丝上的细胞分化或出芽生成,不经两性细胞的配合。病原性真菌大多形成无性孢子,分为:,分生孢子,叶状孢子,孢子囊孢子,大分生孢子 大小、细胞数和颜色是鉴 定的重要依据小分生孢子 真菌都能产生,芽生孢子 假菌丝厚膜孢子关节孢子,孢子 spor
4、e,生殖菌丝末端细胞分裂或收缩形成;也可从菌丝侧面出芽形成,大分生孢子的形态,芽生孢子,厚膜孢子,关节孢子,孢子囊孢子,二相型真菌,二相型真菌,白色念珠菌呈圆形或卵圆形,直径36m。革兰阳性,出芽方式繁殖,在沙氏培养基或组织内可见芽生孢子、假菌丝,荚膜组织胞浆菌 体外培养菌落为棉絮状,镜检可见细长有隔菌丝和圆形大分生孢子,血液标本中可见中性粒细胞或单核细胞浆中有卵圆形或圆形的酵母细胞,真菌的生长特性,生长条件:营养要求不高,常用沙保弱培养基(含葡萄糖、蛋白胨和琼脂),最适pH4.06.0,2228(深部真菌37), 较高的湿度和O2,可形成3种类型菌落:酵母型菌落:由单细胞真菌形式,湿润、柔软
5、而致密,形态似一般细菌菌落类酵母型菌落:由二相真菌形式,形态似酵母型菌落,有假菌丝丝状菌落:多细胞真菌形式,有棉絮状、绒毛状、粉末状(气生菌丝体),菌落正面与背面、中心与边缘呈不同颜色,为重要鉴定依据。玻片小培养镜下可见孢子、菌丝及完整菌丝体,酵母菌形成的酵母型菌落,白假丝酵母菌形成的类酵母型菌落,真菌菌落,曲霉属,多细胞真菌形成的丝状菌落:表面有棉絮状、绒毛状、粉末状,有皱纹,菌落正面与背面、中心与边缘呈不同颜色,为重要鉴定依据。,青霉菌落,抵抗力,对干燥、日光、紫外线及一般消毒剂抵抗力强对热敏感,601小时菌丝、孢子均被杀死对2%石碳酸、0.1%升汞、2.5%碘酊或10%甲醛敏感对细菌抗生
6、素不敏感对二性霉素B、制霉菌素、咪康唑、酮康唑、氟康唑和伊曲康唑敏感,致病性真菌感染: 外源性真菌感染,如 皮肤癣真菌病条件致病性真菌病:内源性真菌感染, 机体免疫力低下,如白假丝酵母菌、曲霉、毛霉等引起真菌超敏反应性疾病:敏感患者吸入孢子或菌丝等, 引起超敏反应,如寻痲疹、哮喘、变应性鼻炎真菌毒素中毒:粮食受潮霉变,摄入真菌或其产生的毒素后可引起急、慢性中毒称为真菌中毒症(mycotoxicosis) 。主要有:黄曲霉毒素和镰刀菌毒素真菌毒素诱发肿瘤: 黄曲霉毒素-原发性肝癌、镰刀菌T-2毒素、 展青霉素 、黄褐毒素,真菌的致病性,免疫性,天然免疫:免疫力与机体免疫状态有关 皮肤粘膜屏障作用
7、 正常菌群的拮抗作用 吞噬细胞的作用,获得性免疫:真菌感染的治愈与细胞免疫有关 真菌感染可引发迟发性超敏反应-癣菌疹,真菌分类,我国普遍采用的是Ainsworth等分类法,与医学有关的真菌为真菌门中的四个亚门:接合亚门(zygomycotina)子囊菌亚门(Ascomycotina)担子菌亚门(Basidiomycotina)半知菌亚门(Deutermycotina),致病性真菌类属,真菌的微生物学检查法,真菌标本的种类,皮肤的角质性物质:毛发、指(趾)甲、皮屑等。各种分泌物和排泄物:生殖道分泌物、耳垢、痰、粪便、尿液等。血液和体液:体液包括胸水、腹水、脑脊液、淋巴穿刺液等。脓汁及渗出物。,真
8、菌标本采集原则,采集的标本要适宜:不同真菌感染应采取不同的临床标 本。怀疑为浅部真菌感染如体癣,应刮取病变边缘的痂、皮屑,发癣应取折断了的病发。怀疑为深部真菌感染应取血液、脑脊液、痰、脓汁等。在用药前采集标本:一般真菌标本须在用药前采集,对已用药者则需停药一段时间后再采集标本。采集足量标本:血液和脑脊液标本5ml,胸腔液20ml,皮屑标本两块,活体组织两份(一份送病理科检查,一份作镜检和培养)。严格无菌操作:在采集标本时严格无菌操作,并进行消毒处理,尤其是在采集血液和脑脊液标本时,要避免污染杂菌。采集后立即送检:对采集的标本应立即送检,特别是深部真菌标本采集后最长不超过2h。,真菌的检验方法,
9、真菌形态学检查真菌抗原检测真菌分离培养与鉴定真菌核酸检测真菌毒素检测,真菌形态学检查,直接镜检:方法简便,快速,10%KOH,微加热,低倍/高倍镜检查菌丝/孢子,角质标本(皮肤癣菌),染色后观察 假丝酵母菌-取材涂片,革兰染色 隐球菌-脑脊液离心取沉淀涂片,墨汁负染,脑脊液涂片-新生隐球菌,表皮癣菌,真菌的直接涂片检查,常用的染色方法,常用的染色方法有革兰染色、瑞氏染色、荧光染色,乳酸酚棉蓝染色、还有墨汁负染色等。对检测骨髓和外周血中的荚膜组织胞浆菌,需作瑞氏染色或姬氏染色后镜检。检测病人脑脊液标本中新生隐球菌,需作墨汁负染色后检查,背景为黑色,新生隐球菌和荚膜不着色,直接镜检意义,结果判断:
10、组织中分隔分枝的菌丝为曲霉; 粗大、不分隔或不分枝的菌丝为毛霉。皮肤癣菌菌丝肥大粗长为处于活跃状态。酵母型和二相型真菌在组织内常为孢子。阳性结果有诊断意义,如浅部真菌病、隐球菌病、皮肤粘膜假丝酵母菌病等代表组织相,直接镜检看到的真菌形态就是该真菌的组织形态,如假丝酵母的菌丝、浅部真菌的厚膜孢子等;确定某些致病性真菌属或种,如皮肤癣菌、曲霉等判断某些真菌种的致病性等,直接镜检的局限性,阴性结果不能排除真菌感染,直接镜检不如培养敏感,其敏感性随标本类型、数量、采集时间和质量等而有所不同 有假阳性结果,如溶解的淋巴细胞在脑脊液印度墨汁湿片中易误认为新生隐球菌;脂肪微滴也可与出芽酵母细胞混淆,抗原检测
11、,采用免疫学方法检测真菌抗原,常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫测定法。,真菌的分离培养,真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法。培养成功与否与采集的标本是否适当、是否新鲜、培养基的选择、培养温度与时间等有关。大多数真菌培养的温度为28,但深部真菌为37。对二相性真菌培养时, 28培养真菌呈菌丝相(霉菌型),37培养为组织相(酵母型)。平皿培养: 表面较大可使标本散布,便于观察菌落形态,但水分易蒸发,只能培养生长繁殖较快的真菌,如假丝酵母菌、隐球菌。 大试管培养: 水分不易蒸发,主要用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存。玻片培养(微量培养、小培养): 可用于真菌菌种的鉴定。,观察菌落
12、形态时注意,菌落性质,是酵母菌还是霉菌。菌落大小,一般病原性真菌菌落小,而条件致病性真菌菌落大。菌落颜色,一般病原性真菌颜色淡,污染真菌颜色深。致病性真菌菌落下沉,污染性真菌菌落不下沉; 致病性真菌有时使培养基开裂,但污染霉菌很少引起培养基开裂。,真 菌 鉴 定,菌落观察形态学观察生化反应:糖(醇)类发酵试验、同化碳源试验、同化氮源试验、硝酸钾试验利用、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。主要用于检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。分子生物学鉴定,动物试验: 分离病原性真菌、确定真菌菌种的致病性、研究药物对真菌的作用等。 核酸检测: 操作简便、省时省工、敏感性和特异性高的
13、优点,但要一定的实验条件,并大多仍处于实验研究阶段,故目前不可能完全替代常规鉴定方法 。真菌毒素的检测: 生物学方法、薄层层析法、高效液相色谱法和间接竞争ELISA法等。,真菌非培养检测技术,多烯类抗生素,如两性霉素B、制霉菌素、曲古霉素等。吡咯类,包括酮康唑、伊曲康唑、氟康唑、伏立康唑、克霉唑、益康唑等。其他类如氟胞嘧啶。,抗真菌药物分类-化学结构分类,抗真菌药物分类-化学结构分类,作用于真菌细胞膜:两性霉素B、制霉菌素、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、酮康唑及克霉唑等。作用于真菌细胞壁:尼可霉素Z、卡泊芬净及普拉米星(pradimicin)等。作用于真菌核酸:干扰真菌DNA合成,5氟尿嘧啶(5
14、FC)等。其他:大蒜新素(allitridum)及冰醋酸(glaciale acetic acid)等。,抗真菌药物分类-作用机理分类,两性霉素B:两性霉素对大多数深部致病真菌具有活性,如念珠菌、新型隐球菌、曲菌、组织胞浆菌、双向真菌等均有较强的抑制作用。但对皮肤和毛发癣菌大多耐药。酮康唑(ketoconazole) 对念珠菌、着色真菌 属、球孢子菌属等有抗菌活性,对毛发癣菌亦具抗菌活性。氟康唑(fluconazole) :对念珠菌、隐球菌 具有较高抗菌活性。氟胞嘧啶:为窄谱抗生素,对念珠菌、新型隐球菌和球拟酵母有较高抗菌活性,对其他真菌抗菌作用差,易产生耐药性,故常和两性霉素B联合使用。,临
15、床常用抗真菌药物,抗真菌药物药敏试验原则,提供两种以上有相当活性的抗真菌药物的可信测量方法和体内的活性具有相关性,可预测治疗的效果可用来监控敏感群体菌株的耐药性发生可预期研究新药的潜在治疗效能。,真菌药物敏感试验过程,方法:肉汤稀释法,包括常量稀释法和微量稀释法。 培养基:含谷氨酰胺和pH指示剂,不含碳酸氢钠RPMI 1640培养基。程序:药物原液配制 接种菌液制备 药液稀释 常量稀法 微量稀释法 结果判断 质量控制,取材 接种动物 接种途径 潜伏期 动物病变白假丝 痰、尿 家兔、耳静脉、 35d肾脏明显肿胀,肾酵母菌病 便、血 小白兔腹腔 皮质部位有白色脓疡新生隐球 脑脊液、 小白鼠颅内、
16、28周 死亡。取标本涂片、菌病 脓、痰、尿 腹腔 墨汁负染色见带荚膜孢子丝 脓汁、痰液 大、小腹腔、 13周 肠系膜、腹膜有肉芽菌病 活体组织、小白鼠睾丸组织 形成,睾丸肿大(涂 片见G+圆形、卵圆形 “雪茄烟“状小体) 着色真脓汁、培养物 大白鼠 腹腔、 肺、肾、腹腔呈肉芽菌病、活体组织 小白鼠 睾丸、静脉数周 肿损害 组织胞血、骨髓、大白鼠 腹腔、 死亡、肝、脾、肾淋浆菌病痰、皮肤小白鼠 颅内 12周 巴结呈肉芽肿损害。 涂片,于巨噬细胞和大单核细胞内可查到本菌球孢子 血液、骨髓、小白鼠、腹腔、 12周 死亡。可从肝、脾、肺等菌病痰、皮肤 豚鼠 睾丸器官及腹膜找到本菌。睾 丸脓肿可见典型的球菌,常见深部真菌病动物试验鉴别要点,课外阅读书目,Hawley LB,微生物与感染性疾病,中信出版社,2004闻玉梅,现代医学微生物学,上海医科大学出版社,1999Brooks GF,Medical Microbiology,人民卫生出版社,2001蔡文成, 实用临床微生物诊断学,东南大学出版社,1998,