1、 毕业论文 文献综述 化学工程与工艺 分散固相萃取高效液相色谱法快速检测猕猴桃中的氯吡脲 一、 前言部分 食品安全事件容易造成群体性发病，引起较大的社会和心理影响，如何保证食品安全已提升到新世纪社会性、国际性的重大课题，越来越受到政府和人们的重视。 食品安全问题已受到各国政府部门的高度重视，在 2001 年初世界卫生组织召开的第 53 届世界卫生大会上，全球 100 余个会员国针对食品安全问题达成了一项食品安全决议。将食品安全列为公共卫生的优先领域，并要求成员国制定相应的行动计划，最大程度地减少食源性疾病对公众健康的威胁。我国 政府也高度重视食品的安全与卫生问题。而一个好的食品检测方法，可以为
2、食品安全的控制和治理提供良好的科学依据。 色谱法亦称层析法，是一种分离技术，其基本原理是利用不同物质在两相 (固定相和流动相 )中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次分配，从而使分配系数只有微小差别的组分得到分离 。高效液相色谱法（ High Performance Liquid Chromatography/HPLC）又称 “ 高压液相色谱 ” 、“ 高速液相色谱 ” 、“ 高分离度液相色谱 ” 、“ 近代柱色谱 ” 等。高效液相色谱是色谱法的一 个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定
3、相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术 1。 高效液相色谱法有 三高一广一快 的特点： 高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。 高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能高出许多 倍。 高灵敏度：紫外检测器可达 0.01 ng，进样量为 ul 数量级。 应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
4、分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在 15 30 分钟，有些样品甚至在 5 分钟内即可完成，一般小于 1 小时。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，但也有缺点，与气相色谱相比各有所长，相互补充。高效液相色谱的缺点是有 柱外效应 2。在从进样到检测器之间， 除了柱子以外的任何死空间 （ 进样器、柱接头、连接管和检测池 ） 中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。 2003 年，由美国农业部农业研究服务中心的 Anastassiades M
5、等开发了一种快速、简便、价格低廉的预处理方法来实现高质量的农药多残留物分析，该法被简称为 QuEChERS 法 3。该法已在世界各国得到广泛应用， 2006 年欧盟委员会制定了相应的 SANCO 操作指南。QuEChERS 是英文字母 QuickEasyCheapEffectiveRugged and Safe 的缩写，即快速、容易、便宜、有效、稳定和可靠。其主要步骤是用乙腈对放入聚四氟乙烯离心管的样品进行浸提，再加入无水硫酸镁与氯化钠振荡，离心促使其分层，随后进行分散固相萃取，即将浸提液转移至含有 PSA 等 吸附剂和硫酸镁的聚四氟乙烯离心管中，离心后取上清液进行测定。同时本方法也可根据可供
6、选择的分析仪器种类、检测限、靶标农药的范围以及使用介质的差异进行适当调整。有超过 200 种农药残留可用该法分析，其中包括含脂肪的介质体系 。 二、主体部分 2.1色谱法 色谱法 亦称层析法，是一种分离技术，是由俄国植物学家 Tswett 在 1906 年创立的，发展至今，已有将近百年的历史。液相色谱法是以液体为流动相的色谱分析方法。迄今，液相色谱法已广泛应用于化工、医药、农业、环境监测等领域，在水质、大气、土壤、有机化工、食品、生物等方面已应用于实际指标分析。其基本原理是利用不同物质在两相 (固定相和流动相 )中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质在两相中进行多次分配，从而使分配
7、系数只有微小差别的组分得到分离 4。 2.1.1高效液相色谱法 高效液相色谱按其固定相的性质可分为高 效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型： 液 液分配色谱法 (Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色 (Chemically Bonded Ph
8、ase Chromatography)。流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。 a. 正相液 液分配色谱法 (Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 液分配色谱法 (Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 液 固色谱法。流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质
9、分子 (X) 和溶剂分子 (S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是 S），可表示如下： Xm + nSa =Xa + nSm 式中： Xm-流动相中的溶质分子； Sa-固定相中的溶剂分子； Xa-固定相中的溶质分子；Sm-流动相中的溶剂分子。 离子交换色谱法 (Ion-exchange Chromatography)。 IEC 是以离子交换剂作为固定相。 IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同 电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。 离子对色谱法 (Ion Pair Chromatography)。
10、离子对色谱法是将一种 (或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 (称为对离子或反离子 )加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示： X+水相 + Y-水相 = X+Y-有机相。式中： X+水相 -流动相中待分离的有机离子 (也可是阳离子 )； Y-水相-流动相中带相反电荷的离子对 (如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六 烷基三甲铵等 )； X+Y-形成的离子对化合物 5,6。 离子色谱法 (Ion Chromatography)。用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导
11、检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同 7。 空间排阻色谱法 (Steric Exclusion Chromatography)。空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米 。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶
12、孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。 2.1.2气相色谱法 气相色谱有：填充柱气相色谱，毛细管气相色谱，裂解气相色谱，顶空气相色谱。食品检测中化合物的定性主要有：保留时间定性，相 对保留值定性，保留指数定性，化学反应配色谱定性，不同类型的检测器定性等。 进入 20 世纪 90 年代，由于电子技术、计算机和软件的飞速发展使 MSD 生产成本和复杂性下降，以及稳定性和耐用性增加，从而成为最通用的气相色谱检测器之一。期间出现了非放射性的脉冲放电电子俘获检测器 (PDECD)、脉冲放电氦电离检测器(PDHID)和脉冲放电光电离检测器 (PDECD)以及集次三者为一体的脉冲
13、放电检测器(PDD) 8。四年后，美国 Varian 公司推出了商品仪器，它比通常 FPD 灵敏度高 100 倍。另外，快速 GC 和全二维 GC 等快速 分离技术的迅猛发展，也促使快速 GC 检测方法逐渐成熟，在食品检测中的应用也越来越多 9。 2.3联用技术 2.3.1分散固相萃取 高效液相色谱法 分散固相萃取 高效液相色谱法快速检测猕猴桃中的氯吡脲。建立了高效液相色谱快速检测猕猴桃中氯吡脲残留的方法 10。试样经乙腈提取、丙基乙二胺 (PSA)分散固相萃取 (DSPE)净化后在 C18柱上以乙腈 0.01 mol/L 磷酸水溶液 (体积比为 35： 65)为流动相进行分离 ， 在 260
14、 nm 波长下检测。氯吡脲的检出限为 0.005 mg/kg， 在 0.0510.00 mg/L 时线性关系良好(r=1.000)。试样在 0.05,0.60,1.20 mg/kg 三个添加水平的回收率为 82.0%112.0%， 相对标准偏差 (RSD)(n=5)为 2.41%。该方法简便快速 ， 准确灵敏 ， 适合大批量样品的快速处理。 2.3.2高效液相色谱 质谱法 高效液相色谱 质谱法用于食品检测快速简单：可直接经过离心提取过个膜就可稀释进样检测。许泓，古珑等 11，用高效液相色谱 (HPLCUV VIS)法检测，高效液相色谱 质谱 (HPLCMS)的确证法仅提供了对苏丹 I 的检测。
15、本研究采用高效液相色谱 质谱 质谱(HPLCMS)法，电喷雾 (ESI)离子接 VI 的正离子化电离方式，多离子反应监测 (MRM)同时对苏丹 I 号 4 种染料同时进行检测，检出限为 0.05 mg kg，定性符合欧盟规定，线性、回收率、精密度均可满足残留分析要求 12。 2.3.3高效液相色谱 化学发光法 高效液相色谱 化学发光分析法在食品检测中应用广泛。张群林等 13研究了高效液相色谱分离和化学发光反应的一些重要参数，结果表明：用甲醇 水 (60： 40， v/v)的流动相进行等度洗脱时，四种对羟基苯甲酸酯在 8.5 分钟内实现了良好的基线分离；其 线性范围均达到三个数量级以上，日内和日
16、间的 R.S.D值均低于 4.5；对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯和丁酯的检测限分别为 1.9， 2.7， 3.9 和 5.3 ng/ml。高效液相色谱的流动相与硫酸铈 (IV)罗丹明 6G 化学发光体系的兼容性良好。该法具有灵敏度高、选择性好、线性范围宽和测定快速等优点，且检测实际样品时元需预浓缩或衍生步骤，已经成功应用于食品中的对羟基苯甲酸酯类防腐剂的定量分析，其精密度和回收率均令人满意。 三、总结部分 在色谱分析中，分离度、分析速度和柱容量三者之间的关系总是呈现幻想三角形关系，即其 中任一因素都要受到另外两个因素的制约，因此，至今也未曾找到分离度、柱容量和快速分析三者同时存在的色谱分析系统。
17、色谱技术是食品样品复杂基质中微量、痕量目标物分离、富集和测定的有力工具，也是食源性疾病病因和代谢毒理学研究的重要手段。随着科技向纵深发展，人们对食品安全认识和要求与日俱增。由于目标物含量极低，同时又有毒性或致突变、致癌性差异极大的同系物、异构体的存在，以一种分析仪器解决复杂对象的分析已不可能了。在食品安全领域，色谱与其他仪器联用技术已成为现代食品化学分析的主要方向，分离分析技术始终向着灵敏、准确、快 捷、简便的方向发展 14,15。 四、参考文献 1 Taylor.etc. Analysis and residue levels of forchlorfenuron(CPPU) in wate
18、rmelonsJ. Journal of Environmental Science and Health.2007, (42): 801-807. 2 Kyoko Kamijo.etc. Clean-up Method of Forchlorfenuron in Agricultural Products for HPLC AnalysisJ. J.Food Hyg.Soc.Japan.2007, 48,(5): 148-152. 3 Shinichi Adaniya,Koya Minemoto,etc.the use of CPPU for efficient propagation of
19、 pineappleJ.Scientia Horticulturae.2004,100:7-14. 4 Theisen, S.; Hnsch, R.;etc. A fast and sensitive HPLC method for sulfite analysis in food based on a plant sulfite oxidase biosensorJ.Biosensors etc.The assessment of selective stationary phases for two-dimensional HPLC analysis of foods: Application to the analysis of coffeeJ. Academic Journal.2010,4,(82):1349-1357.
